山銀花、金銀花微毒測試Microtox與安全性研究

華樺　鄢良春　吳詩惠　劉俐　羅茜　曾安琪　陳雛　趙軍寧

摘要 目的：運(yùn)用小鼠急性毒性試驗(yàn)和基于Microtox（微毒）技術(shù)的生物綜合毒性評價(jià)技術(shù)對比研究金銀花醇提物和山銀花醇提物的毒性大小，探索Microtox技術(shù)應(yīng)用于中藥毒性快速評價(jià)的可行性。方法：小鼠一次性灌胃給予不同濃度的金銀花醇提物、山銀花醇提物，觀察并記錄小鼠的毒性反應(yīng)及死亡情況，計(jì)算小鼠的半數(shù)致死量（LD50）;利用Microtox技術(shù)測定金銀花醇提物、山銀花醇提物對發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度抑制率，計(jì)算發(fā)光細(xì)菌半數(shù)抑制濃度（IC50），將2種毒性評價(jià)方法的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：小鼠灌胃金銀花醇提物和山銀花醇提物的半數(shù)致死量（LD50）值分別為81.29 g生藥/kg、91.0 g生藥/kg。采用生物綜合毒性評價(jià)技術(shù)測得對發(fā)光細(xì)菌的半數(shù)抑制率分別為0.001 3 g生藥/mL、0.002 2 g生藥/mL。結(jié)論：應(yīng)用小鼠急性毒性試驗(yàn)及基于Microtox技術(shù)的生物綜合毒性評價(jià)測試金銀花提取物和山銀花提取物，2種評價(jià)結(jié)果具有一定的一致性，將Microtox技術(shù)用于金銀花提取物和山銀花提取物毒性的快速評價(jià)具有一定的可行性，但2種毒性評價(jià)方法的相關(guān)程度還有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞 金銀花;山銀花;Microtox技術(shù);急性毒性;綜合毒性;安全性;發(fā)光細(xì)菌;生物評價(jià)

Abstract Objective：By using the acute toxicity test of mice and the comprehensive toxicity evaluation technology based on Microtox technology， to compare the toxicity of ethanol extracts from Honeysuckle and Lonicera Japonica， and to explore the feasibility of Microtox technology in rapid toxicity evaluation of traditional Chinese medicine. Methods：Mice were given ethanol extracts from Honeysuckle and Lonicera Japonica at different concentrations in a single gavage， and the toxicity reaction and death of the mice were observed and recorded， then calculated the median lethal dose（LD50）of the mice. The inhibition rate of ethanol extracts from Honeysuckle and Lonicera Japonica to the luminescence intensity of the luminescent bacteria was measured by Microtox technology， and calculated the half inhibitory concentration（IC50）of the luminescent bacteria. The results of the two toxicity evaluation methods were compared. Results：The median lethal dose（LD50）values of the ethanol extract from Honeysuckle and Lonicera Japonica were respectively crude drug 81.29 g/kg and crude drug 91.00 g/kg. The half-inhibition rate of luminescent bacteria measured by the bio-complex toxicity evaluation technique was crude drug 0.0013 g/mL and crude drug 0.0022 g/mL， respectively. Conclusion：The acute toxicity test in mice and the comprehensive toxicity test based on Microtox technology were used to test the extracts of Honeysuckle and Lonicera Japonica. The two kinds of evaluation results have a certain consistency. It is feasible to use Microtox technology to evaluate the toxicity of extracts from Honeysuckle and Lonicera Japonica， but the correlation between the two methods needs to be further studied with a larger sample size.

Keywords Honeysuckle; Lonicera Japonica; Microtox technology; Acute toxicity; Comprehensive toxicity; Security; Luminescent bacteria; Biological assay

中圖分類號：R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.02.017

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花。山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、華南忍冬Lonicera confusa DC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvoto-mentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花。2015版《中華人民共和國藥典》中對金銀花和山銀花的表述可歸納為，性味甘、寒，歸肺、心、胃經(jīng);具清熱解毒，疏散風(fēng)熱之功;用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱[1]。大量研究表明，金銀花和山銀花的主要成分大致相同，包括以綠原酸為代表的有機(jī)酸，以木犀草苷為代表的黃酮類、三萜皂苷、環(huán)烯醚萜、揮發(fā)油等物質(zhì)[3-4]。中藥毒性具有現(xiàn)代生物技術(shù)難以檢測的微小毒性、綜合毒性等特點(diǎn)，是中藥安全性評價(jià)的關(guān)鍵問題之一。如何準(zhǔn)確、快速、高效地評價(jià)中藥的微小毒性，是中藥毒性研究的重要方向[5]。本研究將微毒測試（Microtox）這一能夠檢測綜合毒性，且方法客觀，操作簡單方便，結(jié)果易于重復(fù)，對毒物反應(yīng)快速、靈敏的發(fā)光細(xì)菌檢測法應(yīng)用于金銀花、山銀花的毒性評價(jià)，通過與傳統(tǒng)中藥毒性評價(jià)方法（小鼠急性毒性試驗(yàn)）形成對比研究，進(jìn)一步探索Microtox技術(shù)應(yīng)用于中藥毒性快速檢測的可行性，以期為其在中藥毒性快速檢測領(lǐng)域的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[6-11]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與菌種 SPF級KM種小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK（川）2018-19。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境符合國家大鼠、小鼠、豚鼠、兔屏障系統(tǒng)使用設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)，許可證SYXK（川）2008-100。動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：溫度（20±1）℃，相對濕度（60±5）%，明暗周期12 h，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。費(fèi)氏弧菌干粉（北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，菌種代號：CS234），-20 ℃避光凍存。

1.1.2 藥物 金銀花醇提物，棕褐色濃浸膏，2.86 g生藥/g浸膏，批號：20171208;山銀花醇提物，棕褐色濃浸膏，2.59 g生藥/g浸膏，批號：20171208。以上樣品由成都普斯生物科技股份有限公司按照山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)制備方法提取，金銀花提取得率為35.0%，山銀花提取得率為38.5%。金銀花藥材為忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾，產(chǎn)地為山東臨沂;山銀花藥材為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥花蕾，產(chǎn)地為重慶秀山，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源與種植研究所鑒定。

1.1.3 試劑與儀器 1）試劑：氯化鈉（分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號：2016031501），胰蛋白胨（生物試劑，北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司，批號：20160103），MgSO4·7H2O（批號：2015110601）、NaH2PO4·H2O（批號：20120313）、K2HPO4·3H2O（批號：2015090101）、（NH4）2HPO4（批號：2016053101）、ZnSO4·7H2O（批號：2015110601）、甘油、瓊脂粉（批號：2015051201）、酵母浸出粉（批號：201604180）以上均為成都科龍?jiān)噭┯邢薰咎峁?復(fù)蘇稀釋液（批號：20151020）、滲透壓調(diào)節(jié)液（批號：20151020），購于北京濱松光子技術(shù)股份有限公司;綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≧99.3%，批號：110753-201716）。木犀草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≧94.9%批號：111720-201609）。灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≧98.0%，批號：111889-201603）;川續(xù)斷皂苷乙對照品（中國食品藥品鑒定研究院，純度≧92.2%，批號：111813-201403）;黃芩苷對照品（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，純度≧98.0%，批號：16122621）。2）儀器：生物毒性測試儀（LUMIStox300型）、預(yù)溫槽和測試管（LUMIS-therm型），購于Dr.Bruno Lange GmbH公司;電子天平（上海精天電子儀器有限公司，型號：JA100SA）;搖床培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司，型號：ZWYR-2102）。Waters Acquity UPLC色譜系統(tǒng)（Waters，型號：2695），Agilent 1260 HPLC色譜系統(tǒng)（Agilent，型號：1260）。

1.2 方法

1.2.1 金銀花藥材質(zhì)量控制

1.2.1.1 綠原酸含量測定 取本品粉末（過60目篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定，超聲處理30 min放冷，稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減失，搖勻，過濾，取續(xù)濾液2 mL于10 mL棕色瓶中，加入50%甲醇至刻度，即得。取綠原酸對照品適量;用50%甲醇溶解，即得。于4 ℃冰箱保存。綠原酸對照品濃度為56.07 μg/mL。色譜柱為ACQUITY柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸;柱溫為35 ℃;檢測波長為327 nm，上機(jī)檢測[1]。

1.2.1.2 木犀草苷含量測定 取本品粉末（過60目篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定，超聲處理60 min，放冷，稱重，補(bǔ)足減失，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。于4 ℃冰箱保存。取木犀草苷對照品適量，用70%乙醇溶解，即得（濃度為21.2 μg/mL）。色譜柱為ACQUITY柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸;柱溫為35 ℃;檢測波長為350 nm，上機(jī)檢測[1]。

1.2.2 山銀花藥材質(zhì)量控制

1.2.2.1 綠原酸含量測定 取本品粉末（過60目篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定，超聲處理30 min放冷，稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減失，搖勻，過濾，取續(xù)濾液2 mL于10 mL棕色瓶中，加入50%甲醇至刻度，即得。取綠原酸對照品適量;用50%甲醇溶解，即得。于4 ℃冰箱保存。綠原酸對照品濃度為56.07 μg/mL。色譜柱為ACQUITY柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸;柱溫為35 ℃;檢測波長為327 nm，上機(jī)檢測[1]。

1.2.2.2 灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙含量測定 取灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙適量，用50%甲醇溶液至10 mL，即得?；覛置潭碥找覞舛葹?.61 mg/mL，川續(xù)斷皂苷乙濃度為0.24 mg/mL。色譜柱為Dikma柱（5 μm，150 mm×4.6 mm）;流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸柱溫為30 ℃;檢測器為ELSD，上機(jī)檢測[1]。

1.2.3 小鼠急性毒性試驗(yàn) 采用小鼠急性毒性試驗(yàn)方法[12]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)灌胃測出LD100和LD0，確定給藥組的組間計(jì)量比為1∶0.8，即金銀花醇提物的劑量為158.0、126.4、101.1、80.9、64.7、51.8 g（原生藥）/kg，山銀花醇提物的劑量為144.0、115.2、92.2、73.7、59.0、47.2 g原生藥/kg。KM種小鼠130只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為13個(gè)組（金銀花醇提物6個(gè)劑量組，山銀花醇提物6個(gè)劑量組，空白對照組），每組10只，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水14 h，給藥組以0.4 mL/10 g給藥，灌胃后即可進(jìn)食。給藥后密切觀察小鼠的皮膚、異常肌肉運(yùn)動(dòng)、自發(fā)活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)功能、對外界反應(yīng)、瞳孔、分泌物、大便、眼等毒性反應(yīng)及死亡情況;若有小鼠死亡立即解剖肉眼觀察小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦小腸等臟器的改變。給藥后第2天起，按上述毒性反應(yīng)觀察指標(biāo)每天觀察1次，稱取小鼠體質(zhì)量，連續(xù)14 d，觀察期結(jié)束后處死解剖，按照上述方法肉眼觀察小鼠的臟器是否發(fā)生病理變化。

1.2.4 Microtox技術(shù)的毒性評價(jià) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到金銀花醇提物和山銀花醇提物抑制率在1%～100%的濃度，配制成6.25%、12.5%、25%、40%、50%、60%、75%、85%、100%共9個(gè)濃度（即金銀花0.000 617 2、0.001 234、0.002 469、0.003 95、0.004 938、0.005 925、0.007 406、0.008 394、0.009 875 g原生藥/mL;山銀花0.001 012 5、0.002 025、0.004 05、0.006 48、0.008 1、0.009 72、0.012 15、0.013 77、0.016 2 g原生藥/mL）進(jìn)行檢測，測出pH值，使藥液pH值在5～9的范圍內(nèi)，若不在此范圍內(nèi)用NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，以加入的HCl溶液或NaOH溶液在樣品中的體積不超過總體積的5%為標(biāo)準(zhǔn)，再將各濃度樣品與滲透壓調(diào)節(jié)液以17∶3的比例混合，配制成待測樣品溶液，放置在15 ℃，75%的濕度恒溫恒濕箱1 h后待測。

將細(xì)菌從-20 ℃冰箱中取出，室溫融化，吸取100 μL菌液于裝有約10 mL培養(yǎng)液的50 mL離心管中，放置在23.5 ℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)16 h左右，直至在黑暗中肉眼可觀察到藍(lán)綠色熒光，吸取1 000 μL的菌液于1.5 mL離心管中，低速離心棄去上清液，加入適量復(fù)蘇稀釋液重懸，于恒溫恒濕箱中平衡15 min，取出放于15 ℃預(yù)溫槽10 min，得到測試用發(fā)光強(qiáng)度菌液，初始值在2 000～4 000范圍內(nèi)，即可用于測試。

以復(fù)蘇稀釋液為空白對照，空白對照和每個(gè)樣品濃度均設(shè)置3個(gè)平行管，每批次樣品重復(fù)測定3次。取測試用菌100 μL于測試管中用生物毒性測定儀測定其發(fā)光強(qiáng)度后立即加入1 000 μL復(fù)蘇稀釋液或者待測樣品于測試管中，反應(yīng)10 min后測定其發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算各個(gè)濃度的抑制率，并繪制相應(yīng)的劑量-效應(yīng)動(dòng)力曲線。

根據(jù)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度檢測值，計(jì)算抑制率：

抑制率（%）=空白組發(fā)光菌的平均發(fā)光強(qiáng)度值-樣品組發(fā)光菌的平均發(fā)光強(qiáng)度值空白組發(fā)光菌的平均發(fā)光強(qiáng)度值×100%

1.2.5 2種毒性評價(jià)結(jié)果相關(guān)性分析 計(jì)算金銀花提取物和山銀花提取物基于發(fā)光細(xì)菌檢測法相應(yīng)的IC50值及基于小鼠急性毒性試驗(yàn)的LD50值，2種毒性評價(jià)結(jié)果的相關(guān)程度以相關(guān)系數(shù)r進(jìn)行描述。一般地，|r|>0.95顯著相關(guān);|r|≥0.8高度相關(guān);0.5≤|r|<0.8中度相關(guān);0.3≤|r|<0.5低度相關(guān);|r|<0.3關(guān)系極弱，認(rèn)為不相關(guān)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，計(jì)算出小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)的LD50值，計(jì)算各個(gè)濃度的抑制率并繪制相應(yīng)的劑量—效應(yīng)動(dòng)力曲線，求出IC50值。

2 結(jié)果

2.1 金銀花藥材質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金銀花中綠原酸含量為28.01 mg/g，木犀草苷含量為0.87 mg/g，符合藥典要求。具體結(jié)果如下。見圖1～3，表1。

2.2 山銀花藥材質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山銀花樣品中綠原酸含量為54.23 mg/g，灰氈毛忍冬皂苷乙含量為75.57 mg/g，川續(xù)斷皂苷乙5.33 mg/g，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。見圖4～6，表2。

2.3 小鼠急性毒性試驗(yàn) 金銀花醇提物和山銀花醇提物各劑量組的毒性反應(yīng)較為相似，給藥后毒性癥狀主要表現(xiàn)為靜止俯臥、呼吸抑制、豎毛、稀便、眼瞼下垂或閉目等。隨劑量的降低，動(dòng)物出現(xiàn)上述反應(yīng)的頻次逐漸減少且程度減輕。對死亡動(dòng)物立即解剖，可見小鼠胃腸均有大量尚未吸收的藥液，肉眼觀察各臟器未見明顯異常。存活動(dòng)物給藥后第2天基本恢復(fù)正常。見表3～4。

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行半數(shù)致死量數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)算LD50（Bliss法），得出相應(yīng)的LD5、LD50、LD95及其可信區(qū)間。由表5可見，金銀花醇提物L(fēng)D50為81.29 g/kg，95%可信區(qū)間為72.96～90.21 g/kg;山銀花醇提物L(fēng)D50為91.00 g/kg，95%可信區(qū)間為64.79～151.5 g/kg。

2.4 微毒測試（Microtox）根據(jù)金銀花醇提物和山銀花醇提物的各濃度對費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的影響，求出相應(yīng)的發(fā)光抑制率（%）。見表6。并繪制相應(yīng)的毒性劑量—效應(yīng)動(dòng)力曲線。見圖7，8。

金銀花醇提物和山銀花醇提物基于抑制發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度所測得的IC50值分別為生藥0.001 3 g/mL，0.002 2 g/mL。見表7。

2.5 毒性評價(jià)結(jié)果相關(guān)性分析 將微毒測試法所求得的IC50值進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，與lg（LD50）進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，微毒測試法與小鼠急性毒性試驗(yàn)評價(jià)結(jié)果呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=1.000，在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)，2種毒性評價(jià)方法結(jié)果一致。見表8。

3 討論

現(xiàn)代藥理研究表明金銀花和山銀花提物都具有抗病毒、抗菌、抗炎的作用，金銀花和山銀花藥材外觀的相似度極高、化學(xué)成分也有很大的相似度，但金銀花和山銀花在同一中藥材市場上的價(jià)格金銀花比山銀花的價(jià)格高很多，有許多學(xué)者做了關(guān)于金銀花和山銀花藥理方面的研究，觀察山銀花是否能替代金銀花，但對于金銀花和山銀花毒性研究方面的報(bào)道較少。有文獻(xiàn)報(bào)道，山東、河北、河南的金銀花和湖北、重慶、廣西的山銀花比較，山銀花毒性高于金銀花[13-14];但也有文獻(xiàn)報(bào)道灰氈毛忍冬（山銀花）的毒性比密銀花和濟(jì)銀花的毒性低[15]。本試驗(yàn)條件下，應(yīng)用2種毒性測試方法結(jié)果提示，在本試驗(yàn)條件下，金銀花醇提物毒性大于山銀花醇提物毒性;后續(xù)將擴(kuò)大樣品量進(jìn)一步開展研究。

目前，發(fā)光細(xì)菌檢測法已在水質(zhì)毒性、食品安全性等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用;本實(shí)驗(yàn)室在國內(nèi)率先將發(fā)光細(xì)菌檢測技術(shù)應(yīng)用于中藥毒性評價(jià)領(lǐng)域[16-21]。發(fā)光細(xì)菌檢測技術(shù)具有快速、簡單、靈敏度高、模擬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。基于發(fā)光細(xì)菌檢測進(jìn)行中藥綜合毒性評價(jià)可為更加科學(xué)、合理、全面的中藥安全性評價(jià)提供參考。

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（2020-01-09收稿 責(zé)任編輯：王明）