肝臟疾病的外泌體治療研究進(jìn)展

馮帆 江梅 邵勇

作者單位：400016 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(馮帆，邵勇)；四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(江梅)

肝臟疾病的治療方法較多，但許多慢性肝病仍然無法徹底根治。藥物治療無效時(shí)進(jìn)入終末期的肝臟疾病臨床上常常會選擇肝臟移植等手段，但也面臨很多問題，所以急需新的肝病治療方法。

近年來，外泌體(Exosome)的研究引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。 1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。外泌體是由多種免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的一種特殊類型的微泡，在多囊體(MVB)內(nèi)產(chǎn)生，并在MVB與質(zhì)膜融合之后釋放[1]。外泌體具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，外泌體中含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸、mRNA和miRNA，而且具有信號傳遞的功能。目前許多研究顯示，外泌體參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，并可能用于疾病的治療。本文將外泌體用于肝病治療方面的近年研究進(jìn)展綜述如下。

一、肝臟缺血再灌注損傷(IRI)的外泌體治療

肝臟缺血再灌注(IRI)損傷一般發(fā)生在創(chuàng)傷性休克，肝臟手術(shù)或肝移植術(shù)后。當(dāng)缺血組織重新獲得血液供應(yīng)時(shí)，器官功能不但不能恢復(fù)，反而會加重功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞，這主要是由于恢復(fù)血液供應(yīng)后，過量的自由基攻擊了重新獲得血液供應(yīng)的組織內(nèi)的細(xì)胞造成的。

目前肝臟IRI的主要防治方法為缺血預(yù)處理(IPC)。此方法雖然處理簡單且無藥物副作用，但預(yù)處理的條件和程度卻不易控制。因此，必須尋求新的治療方法。

目前研究顯示，用于肝臟損傷治療來源最多的就是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC),因?yàn)镸SC具有強(qiáng)大的分化和轉(zhuǎn)分化的能力。Nong等[3]將多能干細(xì)胞來源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體(hiPSC-MSCs-Exo)注射到大鼠肝臟I/R損傷模型中，與對照組相比，Exo+I/R組肝細(xì)胞壞死和肝竇充血明顯受到抑制，再灌注后AST，ALT降低，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞減少，MPO水平降低，血清腫瘤壞死因子-a和IL-6水平降低，且凋亡蛋白capspase-3細(xì)胞數(shù)降低而抗凋亡蛋白Bcl-2升高。這些數(shù)據(jù)都顯示hiPSC-MSCs-exo具有抗炎且誘導(dǎo)肝細(xì)胞的抗凋亡作用。

Sun等[4]研究顯示用褪黑素預(yù)處理的MSCs衍生的外泌體比單獨(dú)注射外泌體處理成年大鼠后在抑制炎癥，降低氧化應(yīng)激及減少凋亡蛋白方面效果更好。

二、藥物肝損傷的外泌體治療

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是指在藥物的臨床應(yīng)用過程中由各類化學(xué)藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥(TCM)、天然藥(NM)、保健品(HP)、膳食補(bǔ)充劑(DS)及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等所誘發(fā)的肝損傷，已知全球有1 100多種上市藥物具有潛在肝毒性[5]。目前，外泌體在藥物性肝損傷(DILI)的治療上已取得了一些進(jìn)展。

(一)胚胎干細(xì)胞來源的外泌體治療藥物肝損傷 Tan等[6]將胚胎干細(xì)胞中提取出來的外泌體與CCl4腹腔注射給小鼠，用CCl4和外泌體處理的小鼠AST和ALT增加小于對照組且僅發(fā)現(xiàn)微量壞死細(xì)胞。在體外用乙酰氨基酚(APAP)和過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)肝損傷來測定外泌體對細(xì)胞活力的影響，在兩種損傷模型中外泌體處理組細(xì)胞活性顯著高于未處理組。外泌體處理組增殖細(xì)胞核抗原PCNA和增殖蛋白cyclinD1和cyclinE的肝臟基因表達(dá)顯著上調(diào)，顯示出外泌體的增殖和再生作用。外泌體還通過上調(diào)Bcl-xL蛋白表達(dá)抑制APAP和H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。

(二)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療藥物肝損傷 Tamura等[7]從C57B6小鼠骨髓MSC中收集外泌體，靜脈注射到刀豆蛋白-A(ConA)誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型中，顯示ALT水平降低且壞死區(qū)域減少，促炎細(xì)胞因子IL-2降低，轉(zhuǎn)化生長因子b和肝細(xì)胞生長因子表達(dá)增加。單鏈DNA(ssDNA)是凋亡細(xì)胞的標(biāo)記，只有注射三次外泌體小組觀察到ssDNA指數(shù)的降低。另外，接受三次注射的小鼠組與MSCs在抑制肝損傷的程度上相似。注射外泌體和MSCs組都有Treg數(shù)量增加，但注射三次外泌體小組Treg數(shù)量百分比最高。外泌體也對誘導(dǎo)的肝損傷有抑制作用，且多次注射外泌體的實(shí)驗(yàn)組中Treg數(shù)量增加。

(三)肝細(xì)胞來源的外泌體治療藥物肝損傷 Nojima等[8]研究發(fā)現(xiàn)只有原代肝細(xì)胞來源的外泌體能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，庫普弗細(xì)胞來源的外泌體降低了肝細(xì)胞增殖。

三、肝纖維化的外泌體治療

肝纖維化 (hepaticfibrosis) 是指肝臟內(nèi)彌漫性的纖維結(jié)締組織沉積，是對炎癥壞死等組織損傷的修復(fù)反應(yīng)。引起肝纖維化常見的疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、膽汁淤積性肝病、自身免疫性肝病等。膽汁淤積(cholestasis)是由于膽汁分泌及排泄障礙引起的一種病理生理過程，，長期持續(xù)的膽汁淤積將進(jìn)展為肝纖維化或肝硬化。目前還沒有特異有效的治療肝纖維化的辦法，治療的主要目的就是阻止肝臟損傷，延緩進(jìn)一步惡化的進(jìn)程。臨床上只能針對原發(fā)病和抗纖維化進(jìn)行治療。

(一)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療肝纖維化 Li等[9]用CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(uMSC-Ex)注入小鼠肝臟后顯示I型膠原和III型膠原的表達(dá)減少，AST維持在正常水平而對照組AST顯著提高，ALT則與對照組無差異，血清HA降低，血清TGF-b1降低，TGF-b1可以激活Smad2的磷酸化，并在體內(nèi)導(dǎo)致肝臟EMT。曾韜等[10]通過超速離心收集uMSC-Ex，用雙氧水處理肝細(xì)胞系L02和WRL-68建立肝細(xì)胞損傷模型，25ng/ml的TGF-b1加0.75mM的ATP刺激肝星狀細(xì)胞作為LX2活化模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝損傷模型中uMSC外泌體能上調(diào)肝細(xì)胞中凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)和減少肝細(xì)胞的凋亡，在LX-2激活模型中，加入uMSC外泌體能減少a-SMA的表達(dá)。利用特異性的唾液酸糖苷酶從外部將外泌體a-2，6-唾液酸糖結(jié)構(gòu)切除后，再將酶切后的外泌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)酶切后的外泌體失去作用。說明外泌體中糖蛋白a-2，6-唾液酸糖結(jié)構(gòu)對外泌體的生物學(xué)作用有很大影響。

(二)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療肝纖維化 Lou等[11]通過慢病毒介導(dǎo)的前miR-122轉(zhuǎn)移構(gòu)建了MIR-122修飾的脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC-122)，腹腔注射到CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，顯示AMSC-122抑制膠原合成和成熟，抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)的增殖，血清HA、P-III-P、ALT、AST和肝羥脯氨酸含量降低，Col1A1蛋白水平降低，TGF-b1和a-SMA表達(dá)水平下調(diào)。Qu等[12]也發(fā)現(xiàn)外泌體可以作為載體將miR-181-5p傳遞給HSC-T6，來自miR-181-5p-ADSCs的外泌體下調(diào)HSC-T6細(xì)胞中STAT3和Bcl-2的表達(dá)并激活自噬。與對照組相比，外泌體治療減輕了肝臟損傷，下調(diào)了肝臟中的I型膠原、波形蛋白、a-SMA和纖維連接蛋白。

(三)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療肝纖維化 Rong等[13]用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(HBM-MSCs-Ex)治療小鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)HBM-MSCs-Ex治療組膠原面積低于HBM-MSCs治療組，同樣Ishak纖維化評分，IL-6,IL-1,羥脯氨酸和丙二醛水平也低于HBM-MSCs治療組，說明HBM-MSCs-Ex的治療效果明顯大于HBM-MSCs，兩治療組均能降低血清AST,ALT,總膽紅素，堿性磷酸酶和g-GT水平。

四、肝衰竭的外泌體治療

肝衰竭是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害, 導(dǎo)致合成、代謝、解毒和生物轉(zhuǎn)化功能嚴(yán)重障礙或失代償, 出現(xiàn)以黃疸、凝血功能障礙、腹水、肝腎綜合征、肝性腦病等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。

(一)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療肝衰竭 Liu等[14]用AMSC-Ex治療ALF小鼠模型發(fā)現(xiàn)有明顯的治療效果，而將miR-17敲除后的AMSC-Ex治療效果被取消，說明miR-17在治療ALF中發(fā)揮重要作用。miR-17通過靶向TXNIP，減少巨噬細(xì)胞中NLRP3的炎癥小體活化，改善GalN/TNF-α誘導(dǎo)的ALF，從而對ALF產(chǎn)生保護(hù)作用。王皙等[15]發(fā)現(xiàn)AMSC-Ex對ALF小鼠模型有明顯的治療作用，RNA測序發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)與炎癥反應(yīng)及趨化因子信號通路相關(guān)多種基因顯著下調(diào)，從六種miRNAs中篩選出來對抑制炎癥及趨化因子途徑最明顯的miR-19b-3p，miR-19b-3p靶作用于P47phox-ROS抑制活化巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥促進(jìn)性細(xì)胞因子IL-1a、IL-6、TNF-a，促進(jìn)炎癥抑制性因子IL-10的表達(dá)。

(二)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療肝衰竭 Jiang等[16]將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取的外泌體用PHK67標(biāo)記，與巨噬細(xì)胞共孵育，在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)熒光，表示外泌體可以被小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞吸收，結(jié)果顯示uMSCs-Ex降低脂多糖刺激的RAW-264.7巨噬細(xì)胞中的NLRP3和caspase-1、IL-1b和IL-6的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)ALF導(dǎo)致的肝臟病理改變和炎性細(xì)胞浸潤，AST和ALT也顯著降低。

(三)月經(jīng)血干細(xì)胞來源的外泌體治療肝衰竭 Chen等發(fā)現(xiàn)[17]人月經(jīng)血源性干細(xì)胞來源的外泌體(MenSC-Ex)可以減少體外AML12細(xì)胞(一種小鼠肝細(xì)胞系)的凋亡，也減少LPS/D-GalN誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝功能衰竭(FHF)小鼠模型中肝臟單核細(xì)胞(MNC)和活性凋亡蛋白caspase-3的數(shù)量，具有抗凋亡的作用。

五、肝臟腫瘤的外泌體治療

研究顯示，中國每年超過30萬人死于肝細(xì)胞癌，占全球肝癌死亡人數(shù)的一半，肝移植是全球公認(rèn)的最有效辦法之一[18]，但肝臟需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于供肝數(shù)量。

(一)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療肝臟腫瘤 Lou等[19]用miR-122轉(zhuǎn)染AMSC，提取出來的122-Exo可以改變miR-122-靶基因的表達(dá)使癌細(xì)胞對化療藥物敏感，瘤內(nèi)注射122-Exo可以顯著提高索拉菲尼在體內(nèi)對HCC的抗腫瘤效果，增強(qiáng)HCC化療敏感性。

(二)肝細(xì)胞來源的外泌體治療肝臟腫瘤 Cheng等[20]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞來源的含有p120ctn(一種在許多實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)的膜蛋白)的exosome通過STAT3途徑抑制HCC細(xì)胞的進(jìn)展。Cheng等[21]用褪黑素處理肝癌來源的外泌體(Exo-MT)，發(fā)現(xiàn)處理后的外泌體可以通過STAT3途徑減弱腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞的免疫抑制狀態(tài)。Lin等[22]從轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-NSMase1的L02細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出exosome，發(fā)現(xiàn)NSMase活性增加，NSMase1-Exo通過降低鞘磷脂(SM)/神經(jīng)酰胺(Cer)的比值抑制HCC細(xì)胞生長并誘導(dǎo)凋亡。Cho等[23]將暴露于醋氨酚(APAP)中的小鼠的外源性外泌體內(nèi)化到小鼠肝細(xì)胞中或HepG2肝癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)可以顯著降低受體細(xì)胞的活力。

(三)樹突狀細(xì)胞來源的外泌體治療肝臟腫瘤 Lu等[24]將表達(dá)AFP的樹突狀細(xì)胞(DEXAFP)的外泌體注入HCC小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)DEXAFP誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的抗原特異性免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致異位、原位和致癌物誘導(dǎo)的具有抗原和病理異質(zhì)性的肝癌小鼠明顯的腫瘤生長遲緩和延長的存活率。表現(xiàn)為腫瘤部位表達(dá)c-干擾素(IFN-c)的CD8+T淋巴細(xì)胞明顯增多，IFN-c和白細(xì)胞介素-2水平升高，CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞減少，腫瘤部位白細(xì)胞介素-10和轉(zhuǎn)化生長因子-b水平降低。

外泌體治療肝病雖然已經(jīng)有一定的進(jìn)展，但目前尚停留在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)的階段，臨床應(yīng)用還有一定的距離。隨著外泌體研究的深入，外泌體提取和純化技術(shù)的進(jìn)步，未來外泌體必定能給肝病治療領(lǐng)域帶來新的希望。