微RNA在骨損傷診斷和治療中的研究進(jìn)展

楊文濤 關(guān)德宏

微RNA(miRNA)是短鏈非編碼RNA分子，長度為19～25個核苷酸，廣泛存在于生物體內(nèi)[1]，是一種特殊的生物調(diào)節(jié)因子。成熟的miRNA可與目標(biāo)信使RNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，并誘導(dǎo)目標(biāo)信使RNA降解或抑制其翻譯，調(diào)控靶基因表達(dá)水平[2-3]。研究證實(shí)，miRNA對細(xì)胞的增殖、遷移和分化有重要調(diào)節(jié)作用，在骨發(fā)育和骨再生中也發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]。

隨著人口老齡化日益嚴(yán)重，交通運(yùn)輸業(yè)不斷發(fā)展，骨科疾病發(fā)病率逐年攀升，大面積骨缺損、骨不連的發(fā)生率也有所上升。目前，自體骨移植依然是治療骨缺損的首選方法[5]，但存在骨供應(yīng)量有限，給患者帶來額外痛苦等缺點(diǎn)，而miRNA的發(fā)現(xiàn)則為這些難治性骨折的治療提供了新思路。本文對miRNA在骨損傷診療中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 miRNA表達(dá)失調(diào)與骨損傷

miRNA與骨密度降低、骨質(zhì)疏松、骨折等骨科疾病均存在密切聯(lián)系，骨折發(fā)生和愈合過程中涉及各種調(diào)節(jié)因子，包括miRNA[6-7]。

1.1 miRNA在骨組織中的表達(dá)失調(diào)

Gautvik等[8]進(jìn)行骨折風(fēng)險研究，他們選取不同部位共102例活體骨樣本，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析和miRNA芯片技術(shù)檢測相關(guān)miRNA含量,并進(jìn)行對比分析，最后確定28個miRNA的表達(dá)水平與骨折相關(guān)。他們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中5個miRNA(miR-484、miR-328-3p、miR-27a-5p、miR-28-3p和miR-409-3p)與骨密度正相關(guān)，即這5個miRNA水平降低會增加骨折發(fā)生風(fēng)險。不過，該研究中研究對象均為絕經(jīng)后婦女，5個miRNA是否與雌激素相關(guān)，其變化是否適用于所有性別和年齡的人群，還需深入研究。

Chen等[9]對30例骨質(zhì)疏松性骨折患者的骨折碎片進(jìn)行研究，同時以30例行髖關(guān)節(jié)置換的骨關(guān)節(jié)炎患者的股骨頸區(qū)骨樣本作為正常對照組，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折患者骨折碎片樣本中miR-135b-5p表達(dá)水平明顯高于對照組。進(jìn)一步的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-135-5p可通過調(diào)控骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化。該研究直接以骨質(zhì)疏松性骨折患者的骨折碎片作為研究樣本，極具代表性，但對照組與正常人骨骼樣本的差異可能對研究結(jié)果存在影響，對此還需進(jìn)一步探究。

以上兩項(xiàng)研究中均采用人體骨組織作為樣本，這限制了樣本采集和miRNA的實(shí)時監(jiān)測，但研究結(jié)果對骨科疾病的探索仍具有深刻意義。

1.2 miRNA在血液中的表達(dá)失調(diào)

相對于骨組織樣本，血液樣本易采集，且一定意義上可做到miRNA實(shí)時監(jiān)測。Mandourah等[10]提取正常人、骨質(zhì)疏松患者、骨質(zhì)疏松性骨折患者共139例志愿者的血液樣品，利用RNA測序技術(shù)對370個miRNA進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)40個miRNA出現(xiàn)差異性表達(dá)，最終確定miR122-5p和miR-4516表達(dá)水平下降與骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生存在密切聯(lián)系。

Kocijan等[11]對153例骨折患者(絕經(jīng)前女性46例、絕經(jīng)后女性52例、男性55例)血液中187個miRNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量分析，發(fā)現(xiàn)骨折患者血清中miR-152-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p、miR-324-3p、miR-19b-3p、miR-335-5p、miR-19a-3p和miR-550a-3p 的水平有明顯改變，且與患者的年齡和性別無關(guān)。

Feichtinger等[12]進(jìn)行骨折風(fēng)險預(yù)測研究。他們提取36例輕度骨折患者的血漿，通過RNA測序、實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量分析等技術(shù)對可能產(chǎn)生影響的19個miRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多個miRNA對骨組織微結(jié)構(gòu)有影響，其中miR-29b-3p、miR-324-3p和miR-550a-3p的表達(dá)水平降低，且與骨密度降低直接相關(guān)。該研究提示，一些miRNA的表達(dá)水平在骨折高風(fēng)險人群(骨質(zhì)疏松患者)、骨折患者與健康人中出現(xiàn)明顯差異，這或可用于評估骨折風(fēng)險。

以上研究包含了各年齡段和性別的患者，并實(shí)現(xiàn)一定程度上的實(shí)時監(jiān)測，但人體血清成分復(fù)雜，其變化的影響因素也較多。

2 miRNA調(diào)節(jié)骨愈合

miRNA在細(xì)胞的特定時期表達(dá)，并能靶向調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和遷移等過程[13]。骨組織的再生和血管化過程涉及干細(xì)胞的增殖、分化和遷移，miRNA參與這些過程中[14-15]。

2.1 miRNA對骨再生的調(diào)節(jié)作用

骨的形成和再生主要依賴于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)向成熟成骨細(xì)胞分化[16]，這一基本步驟的實(shí)現(xiàn)需激活包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)和Wnt等在內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均受miRNA調(diào)控[17]。以上信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活常導(dǎo)致下游核蛋白的表達(dá)，如Runx2、Osterix蛋白和環(huán)腺苷酸依賴性轉(zhuǎn)錄因子-4，它們可調(diào)控成骨細(xì)胞的發(fā)育。

Yang等[18]將經(jīng)miR-21修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)/β-磷酸三鈣復(fù)合材料用于填補(bǔ)動物骨缺損模型。術(shù)后6個月顯微CT檢查發(fā)現(xiàn)新骨形成較好，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K )/蛋白激酶B(Akt)/低氧誘導(dǎo)因子-1α途徑促進(jìn)骨再生，他們認(rèn)為miR-21在體外可促進(jìn)BMSC的遷移和成骨分化。Sun等[19]的動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA-21過表達(dá)可增加BMSC中骨橋蛋白和堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨，加速骨折愈合。

Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a可促進(jìn)BMSC的骨鈣沉積，提高ALP和骨鈣素的水平，他們認(rèn)為miR-26a有促成骨分化的作用。此外，他們將miR-26a用于骨不連的大鼠模型中，X線檢查、蘇木精-伊紅染色和Masson染色實(shí)驗(yàn)均表明，miR-26a可明顯增強(qiáng)成骨效果。實(shí)驗(yàn)還對miR-26a促進(jìn)骨折愈合的分子機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果顯示miR-26a通過Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，靶向抑制含骨硬化蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白1的表達(dá)，促進(jìn)MSC的成骨分化，從而促進(jìn)骨不連的愈合。

Zhang等[21]在體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中加入miR-218，采用蛋白質(zhì)印跡法和細(xì)胞計數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-218可促進(jìn)Runx2表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟。Shi等[22]進(jìn)行了進(jìn)一步研究，他們將過表達(dá)miR-218的BMSC移植至股骨骨折小鼠模型中，通過X線和顯微CT檢查，機(jī)械測試，組織染色檢測發(fā)現(xiàn)，miR-218可加速骨折愈合。

Ge等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在骨折早期小鼠體內(nèi)miR-374b的表達(dá)水平明顯增高。隨后的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予miR-374b，MSC中的ALP活性增加，成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)也明顯增加，而利用抗miR-374b敲低miR-374b表達(dá)則出現(xiàn)相反結(jié)果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-374b可通過降解PTEN促進(jìn)MSC的成骨分化，從而促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，miRNA在骨折愈合過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)部分miRNA的表達(dá)可促進(jìn)成骨作用，最終達(dá)到改善骨折愈合的效果。miRNA在骨折延遲愈合、骨不連和骨缺損的治療中具有潛在的應(yīng)用價值。

2.2 miRNA對血管生成的調(diào)節(jié)作用

骨折通常伴有微血管破壞，形成局部低氧環(huán)境，這會刺激血管再生相關(guān)因子分泌，從而促進(jìn)血管系統(tǒng)重建[24]。骨折后，新生血管可為局部組織提供營養(yǎng)，還可運(yùn)輸骨折修復(fù)所需的調(diào)控因子[25]，miRNA便是其中之一。血管生成常與成骨作用一起促進(jìn)骨折愈合[14]。

一項(xiàng)體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，含鋰的生物陶瓷材料(Li-BGC)可直接促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的成血管能力[26]。隨后的動物研究發(fā)現(xiàn)，Li-BGC也可促進(jìn)新生血管向骨內(nèi)生長。進(jìn)一步研究證實(shí)，Li-BGC能促進(jìn)BMSC生成含miR-130a的外泌體，外泌體中的miR-130a作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，使Akt和核因子-κB(NF-κB)通路激活，PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，最終促血管生成。該過程中，miRNA參與BMSC與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)和反饋調(diào)節(jié)，同時具有促血管生成和促骨再生的作用。

Yan等[27]將MSC層整合到鈦合金上，形成MSC片-植入物復(fù)合物(MSIC)，用于研究抗miR-138對復(fù)合體的影響。他們發(fā)現(xiàn)，抗miR-138具有促血管生成和骨鈣沉積的作用。在小鼠皮下植入MSIC進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與加入miR-138和生理鹽水相比，加入抗miR-138的MSIC可形成更為堅固的血管化骨組織，他們認(rèn)為抗miR-138具有促血管生成和促進(jìn)骨再生的作用。

Wang等[28]進(jìn)行成骨細(xì)胞和H-型內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用miRNA測序技術(shù)分析證實(shí)miR-143在血管生成以及成骨過程中具有重要作用。隨后的臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，老年骨折患者血清中miR-143的表達(dá)水平低于年輕患者。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-143敲除小鼠中H-型血管生成和成骨細(xì)胞分化受到明顯抑制，其給予基因敲除小鼠蛋白脫乙酰酶(HDAC)7可改善血管生成和骨再生，推測miR-143靶向作用于HDAC7以促進(jìn)成血管細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化。

以上研究表明，miRNA在MSC和血管相關(guān)細(xì)胞中起著重要調(diào)控作用，可影響骨折過程中的血管生成和成骨作用。骨愈合過程中BMSC和血管相關(guān)細(xì)胞常相互聯(lián)系[29]，其聯(lián)系機(jī)制也值得深入研究。

3 miRNA對骨愈合的潛在診療價值

miRNA與骨折及骨愈合有著密切聯(lián)系，血循環(huán)中的部分miRNA也會隨著骨折的發(fā)生和發(fā)展出現(xiàn)變化。部分與骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)的miRNA或可作為預(yù)測骨折風(fēng)險的評估指標(biāo)[30]。雖然骨愈合延遲及骨不連與患者的年齡以及骨折部位有關(guān)，但尚缺少客觀的預(yù)測指標(biāo)，骨折患者血液或骨折碎片中的miRNA水平或可作為參考，這有利于對高風(fēng)險人群提前制定更為合理且有效的診療決策。

miRNA除可應(yīng)用于疾病診斷中，在骨愈合延遲、骨不連和骨缺損的治療方面也有巨大應(yīng)用潛力[7]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA單獨(dú)應(yīng)用或與干細(xì)胞、生物材料聯(lián)合應(yīng)用，均能發(fā)揮良好的促骨愈合作用，但考慮到應(yīng)用安全性，對miRNA相關(guān)的輔助治療以及臨床應(yīng)用仍需開展進(jìn)一步的研究和評估。

4 結(jié)語

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，學(xué)者們開始注意到miRNA的潛在診療價值。涉及miRNA治療的專利逐年增加，開展相關(guān)研究的生物制藥公司不斷增多。目前，大多數(shù)miRNA相關(guān)藥物仍處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段。盡管miRNA在骨科領(lǐng)域應(yīng)用的研究遠(yuǎn)落后于心血管疾病、癌癥以及慢性傷口愈合等領(lǐng)域[31-32]，但隨著研究的進(jìn)一步開展，miRNA可能在骨相關(guān)疾病的診斷與治療中得到更多應(yīng)用。