分泌粒蛋白Ⅲ抗體治療眼底新生血管的研究進(jìn)展

楊彬彬,靳 荷,丁芝祥

分泌粒蛋白Ⅲ(Secretogranin Ⅲ，Scg3/SgⅢ)是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的血管生長(zhǎng)因子，相關(guān)體內(nèi)、體外研究已證實(shí)Scg3在眼底新生血管的形成中具有重要作用。近年來，將Scg3抗體應(yīng)用于眼底新生血管的治療也取得了一些進(jìn)展，其作用機(jī)制與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)不同，Scg3僅在病理性新生血管中表達(dá)，在正常血管中不表達(dá)，是一種新發(fā)現(xiàn)的具有高選擇性表達(dá)的血管生長(zhǎng)因子。本文從Scg3分子結(jié)構(gòu)、信號(hào)傳導(dǎo)通路以及其在眼底視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管治療中的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管的治療提供一個(gè)新的治療思路。

0 引言

目前眼底的新生血管性疾病——濕性年齡相關(guān)性黃斑病變(wet age-related macular degeneration，wARMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)等是常見的致盲性眼病，根據(jù)Nangia等[1]調(diào)查研究顯示，在全球范圍內(nèi)，wARMD在致盲性眼病中致盲率達(dá)11.72%，DR的致盲率為2.75%，ROP在兒童致盲眼病中為18%[2]。目前針對(duì)視網(wǎng)膜新生血管性疾病治療方法主要包括手術(shù)治療、冷凍治療、視網(wǎng)膜激光光凝及光動(dòng)力療法、抗VEGF等，抗VEGF的應(yīng)用對(duì)治療視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管性疾病取得了突破性的進(jìn)展，然而，其治療效果依然有限，我們需探索更為安全有效的治療方式。分泌粒蛋白Ⅲ(Secretogranin Ⅲ，Scg3)最早在1990年在小鼠神經(jīng)元中作為一種神經(jīng)蛋白被發(fā)現(xiàn)[3]，后來逐漸發(fā)現(xiàn)其還在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中表達(dá)，新近Li等的研究發(fā)現(xiàn)Scg3是一種具有高度特異性表達(dá)的血管生長(zhǎng)因子[4]；抑制Scg3的表達(dá)可以選擇性抑制病理性新生血管，而不影響正常的血管生長(zhǎng)，對(duì)視網(wǎng)膜新生血管及相關(guān)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的治療有著重要的研究意義[5]。本文從Scg3的生物學(xué)特性、分子結(jié)構(gòu)、信號(hào)傳導(dǎo)通路及Scg3在視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管的治療提供一個(gè)新的治療思路。

1 Scg3家族

分泌粒蛋白Ⅲ(Scg3/SgⅢ)屬于顆粒細(xì)胞家族，由嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin A，CgA)、嗜鉻粒蛋白B(Chromogranin B，CgB)和分泌粒蛋白2～7[6]、以及其他相關(guān)蛋白(7B2，NESP55，proSAAS和VGF)[7]組成。顆粒細(xì)胞家族來源的多肽包括有自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌信號(hào)，可以反饋刺激致密核心大囊泡從而形成調(diào)節(jié)激素和生長(zhǎng)因子,進(jìn)而參與調(diào)節(jié)多種生物活性，包括分泌、代謝、血管穩(wěn)態(tài)、心功能、血壓、細(xì)胞免疫及先天免疫等[7-10]。

Kingsley等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Scg3為小鼠1B1075基因的產(chǎn)物，然而缺失1B1075基因的小鼠在生存、生育和運(yùn)動(dòng)行為方面均沒有明顯的影響?；蛟S正是由于Scg3基因的缺失對(duì)小鼠的行為改變并沒有明顯的影響，在早期其并沒有像其他的顆粒細(xì)胞家族成員一樣被深入研究。所以，Scg3是顆粒細(xì)胞家族中被研究最少的因子之一，最近Li等的研究發(fā)現(xiàn)，Scg3是一種新的血管生長(zhǎng)因子，具有高選擇性表達(dá)的特點(diǎn)，可以選擇性的誘導(dǎo)小鼠的糖尿病視網(wǎng)膜血管生成，而不影響正常的毛細(xì)血管[5]。所以，Scg3的作用機(jī)制與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也存在一定差異，VEGF在小鼠的糖尿病視網(wǎng)膜血管和正常血管中均表達(dá)，能夠同時(shí)刺激兩者的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。

2 Scg3的分子結(jié)構(gòu)

Scg3基因位于人類15q21染色體上，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成，是一種親水性酸性氨基酸，3366bp SgⅢ mRNA編碼468個(gè)氨基酸——由7對(duì)連續(xù)的基礎(chǔ)氨基酸組成[7,12]。Scg3還是一種N-糖基化蛋白，在分泌囊泡中可以水解為中等大小的蛋白[13]。最早在1990年的研究中，在小鼠神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)Scg3表達(dá)為一種神經(jīng)蛋白[3]，后來逐漸發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞以及神經(jīng)元中，包括有視網(wǎng)膜神經(jīng)元[3,5,14-16]，同時(shí)，在小鼠垂體瘤細(xì)胞(ArT-20)中，Scg3在轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基體(trans-golgi network，TGN)中與富含膽固醇的膜結(jié)合而成分泌顆粒[10]。

Scg3分子(471 aa)由3個(gè)功能域組成，分別為膽固醇結(jié)合域(Scg3 23-186)、CgA結(jié)合域(Scg3 214-373)和羧肽酶e(carboxypeptidase e，CPe)結(jié)合域(Scg3 374-471)[17]。Scg3作為CgA的特定結(jié)合分子伴侶[14]，Scg3與CgA等顆粒細(xì)胞家族成員一起參與調(diào)控分泌家族的神經(jīng)肽激素、神經(jīng)遞質(zhì)的分泌[17]。通過Northern Blot，Scg3和CgA在腦、下垂體和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中共同表達(dá)，而在非神經(jīng)內(nèi)分泌組織中不表達(dá)，將CgA結(jié)合域從Scg3序列中剔除，也并不影響Scg3在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)至分泌顆粒中[14]。同時(shí)，在顆粒內(nèi)，Scg3能夠與分泌顆粒膜(secretory granule membrane，SGM)型脂質(zhì)體結(jié)合，而CgA則不能，CgA只能在和Scg3共存時(shí)與SGM型脂質(zhì)體結(jié)合，并且，Scg3與脂質(zhì)體結(jié)合活性在一定程度上與膽固醇的比例成正比，在膽固醇比例為60%時(shí)達(dá)到最佳[10]。所以，Scg3通過不同的結(jié)構(gòu)域，可以與CgA和膽固醇同時(shí)結(jié)合。

3 Scg3的信號(hào)傳導(dǎo)通路

Scg3作為新近發(fā)現(xiàn)的新生血管因子，目前對(duì)于其信號(hào)傳導(dǎo)通路的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。依據(jù)Tang等[18]研究，Scg3能夠誘導(dǎo)有絲分裂蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)發(fā)生磷酸化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙，有效地激發(fā)新生血管生長(zhǎng)。MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)于Scg3誘導(dǎo)的促進(jìn)新生血管形成細(xì)胞內(nèi)信號(hào)具有重要意義。Scg3與VEGF類似，已有相關(guān)研究指出MEK/ERK信號(hào)通路通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷徙，對(duì)VEGF介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管生成反應(yīng)具有重要意義[19-21]，但Scg3與VEGF都通過MEK/ERK信號(hào)通路進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活Src的磷酸化，發(fā)揮新生血管生成和血管滲漏作用；但是，兩者最初反應(yīng)結(jié)合的反應(yīng)受體不同，在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路也完全不同[22]。VEGF誘導(dǎo)MEK、ERK、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、Src和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of transcription，Stat3)的磷酸化；Scg3主要激活MEK、ERK和Src的磷酸化[5]。此外，VEGF主要由3個(gè)受體，分別為VEGFR 1、2和3，VEGFR1主要作用是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，VEGFR2為促進(jìn)血管生成和提高血管滲漏性的主要受體[23]，VEGFR3參與淋巴管的生成[24]，Scg3既不與VEGFR1或VEGFR2結(jié)合，也不能激活VEGFR2[5]。由此表明，Scg3與VEGF可能是通過不同的信號(hào)通路部分差異性的發(fā)揮新生血管生成和血管滲漏的作用。而目前對(duì)于Scg3的受體尚未被識(shí)別，依據(jù)Tang等[18]研究表明MEK/ERK為Scg3的關(guān)鍵性信號(hào)通路，而MEK/ERK可以被不同的受體激活，如受體絡(luò)氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)、G蛋白偶聯(lián)受體(G proteincoupled receptors，GPCR)和整合素[25]，因而考慮Scg3受體可能位于RTK、GPCR或整聯(lián)蛋白中，也對(duì)進(jìn)一步研究Scg3的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 Scg3在視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管中的作用

4.1 Scg3與糖尿病視網(wǎng)膜病變 糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，也是目前導(dǎo)致工作年齡人群視力損傷的主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球糖尿病患者中DR的患病率約為34.6%(約9300萬人)[26]。目前，抗VEGF治療是DR的主要治療方式之一，但經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用，抗VEGF對(duì)DR的治療效果仍相當(dāng)?shù)挠邢轠27-28]，同時(shí)，反復(fù)的玻璃體腔注藥可能會(huì)引起角膜水腫、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜纖維化、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮、視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變、眼壓升高、非感染性眼內(nèi)炎、白內(nèi)障、黃斑區(qū)瘢痕形成等并發(fā)癥[29-31]。LeBlanc等經(jīng)過研究證實(shí)，Scg3在糖尿病視網(wǎng)膜血管中高度特異性表達(dá)，特異性高達(dá)97.69%，而在正常周邊毛細(xì)血管中無特異性表達(dá)，同時(shí)，Scg3受體在糖尿病新生視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中顯著升高[22]。血糖升高可以通過活性氧激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)化酶2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管滲漏[32]，LeBlanc等的研究發(fā)現(xiàn)，然而Scg3單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)在糖尿病視網(wǎng)膜病變的小鼠模型中，具有抑制病理性視網(wǎng)膜新生血管形成和減少視網(wǎng)膜血管滲漏的作用[5]，而不影響視網(wǎng)膜周邊正常的毛細(xì)血管。在小鼠模型研究中，發(fā)現(xiàn)Scg3 mAb可以通過眼球筋膜下注射的方式給藥，達(dá)到同樣的眼底治療效果。能夠有效地避免玻璃體腔注藥的并發(fā)癥的發(fā)生，加上Scg3在糖尿病血管的高選擇性表達(dá)的特點(diǎn)，有望成為新的治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物。

4.2 Scg3與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)以視網(wǎng)膜血管異常增生為特征，其主要危險(xiǎn)因素包括胎齡、出生體質(zhì)量、吸氧、機(jī)械通氣等[33]。目前激光光凝術(shù)仍然是治療ROP的首選治療方式。2007年抗VEGF藥物首次被用于治療ROP[34]，然而經(jīng)過多年的研究及臨床應(yīng)用，抗VEGF藥物在治療ROP上療效有限[35-36]，而且抗VEGF藥物可能經(jīng)過眼部周圍的組織滲透到全身循環(huán)，可能會(huì)阻礙患兒大腦、肺、腎和其他周邊血管的生成，從而影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育[37-39]，相對(duì)于成年人的治療，針對(duì)新生兒的治療要求的不僅僅是短時(shí)的治療效果，更需要在未來更長(zhǎng)時(shí)間都可以取得良好的療效，并且盡可能的將副作用或并發(fā)癥降到最低。傳統(tǒng)的冷凍治療及激光光凝雖然都可以降低ROP的致盲率，但兩者均以犧牲周邊視力為代價(jià)，治療后患者大多視力仍不佳，甚至可能伴有并發(fā)癥，如眼底血管迂曲、視盤顳側(cè)近視弧形斑、玻璃體極化膜、外周牽拉性視網(wǎng)膜脫離等[40]。

最近Tang等[4]在新生小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，抗Scg3對(duì)緩解氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen induced retinopathy，OIR)具有高效性與安全性。通過誘導(dǎo)新生小鼠產(chǎn)生OIR，再分別在玻璃體腔內(nèi)注射阿柏西普(Aflibercept)、Scg3 mAb，結(jié)果顯示阿柏西普雖然也能顯著抑制視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)和新生血管簇及其分叉點(diǎn)，但僅能輕度改善視網(wǎng)膜中心缺血區(qū)；而Scg3 mAb不僅可以顯著地抑制RNV和新生血管簇奇跡分叉點(diǎn)，還能顯著改善視網(wǎng)膜中心無血管區(qū)[4]。因而可以證實(shí)Scg3 mAb對(duì)治療ROP的有效性。同時(shí)，因?yàn)榭筕EGF藥物會(huì)滲透到全身循環(huán)中[37]，引起新生兒體質(zhì)量增長(zhǎng)遲緩、腎小球擴(kuò)張等并發(fā)癥，所以，Tang等[4]在進(jìn)一步研究中驗(yàn)證了Scg3 mAb的安全性，應(yīng)用Scg3 mAb的新生小鼠體質(zhì)量能夠正常增長(zhǎng)，并未導(dǎo)致腎小管發(fā)育異常或腎小管損傷等，腎臟組織結(jié)構(gòu)及功能均無明顯異常，也進(jìn)一步說明了抗Scg3在治療ROP上的高度安全性。

Scg3由于其高選擇性表達(dá)的特性，優(yōu)先在病變血管而非正常血管，對(duì)發(fā)育中的視網(wǎng)膜以及其他器官的副作用最小，所以，抗Scg3治療OIR具有高度的安全性和有效性，可能可以在將來應(yīng)用于ROP的治療中。

4.3 Scg3與脈絡(luò)膜新生血管 脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是指脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的增殖血管，因其常累及黃斑部，引起黃斑區(qū)反復(fù)的出血、滲出、瘢痕形成，損害患者的中心視力，影響生活質(zhì)量，同時(shí)，CNV也是眼內(nèi)血管性疾病的共同臨床表現(xiàn)。在傳統(tǒng)抗VEGF的治療中，抗VEGF藥物不僅僅能夠抑制脈絡(luò)膜新生血管的生長(zhǎng)，也在一定程度上影響脈絡(luò)膜的正常毛細(xì)血管。LeBlanc等[41]研究了Scg3在CNV中的作用，Scg3能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷徙，參與調(diào)節(jié)血管生成和血管滲漏[22]。Scg3在小鼠的糖尿病血管中高度特異性表達(dá)，而在正常血管不表達(dá)，對(duì)抗Scg3治療CNV具有重要研究意義[5]。LeBlanc等[41]通過氬激光或基質(zhì)膜誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生CNV，在分別注射Scg3 pAb、Scg3 mAb、阿柏西普，結(jié)果顯示Scg3 pAb、Scg3 mAb均能顯著降低CNV的病變范圍，依據(jù)CNV的三維體積、病灶面積及血管密度顯示，Scg3 pAb、Scg3 mAb對(duì)CNV均具有顯著的抑制作用，其效果與阿柏西普相似。為了避免玻璃體腔注藥帶來的副作用，LeBlanc等[41]采用全身給藥的方式注射Scg3 pAb、Scg3 mAb，結(jié)果顯示和玻璃體腔注藥達(dá)到了同樣的療效。

4.4 Scg3與濕性年齡相關(guān)性黃斑病變 年齡相關(guān)性黃斑病變(age-related macular degeneration，ARMD)是發(fā)達(dá)國(guó)家老年人致盲的主要原因。預(yù)計(jì)到2020年將會(huì)有1.96億例的ARMD患者，到2040年將會(huì)增長(zhǎng)至2.88億，其中亞種病例數(shù)最高(達(dá)1.13億)[42]。臨床上將ARMD分為兩類：干性(萎縮性)ARMD和濕性(新生血管性)ARMD[43]，wARMD對(duì)視力的損害程度遠(yuǎn)高于干性ARMD，其特點(diǎn)是黃斑區(qū)CNV伴視網(wǎng)膜腔內(nèi)或視網(wǎng)膜下新生血管滲漏、出血和視網(wǎng)膜色素上皮層脫離[44]，黃斑區(qū)出血、水腫甚至瘢痕形成，導(dǎo)致視力下降。wARMD的損害主要發(fā)生在視網(wǎng)膜色素上皮層，其中炎癥、氧化應(yīng)激和血管改變以及潛在脈絡(luò)膜的灌注減少是促血管生長(zhǎng)因子產(chǎn)生增加的原因，從而引起新的病理性新生血管[45-46]，新生血管通過Bruch膜進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔生長(zhǎng)，這種異常的新生血管主要是由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子引起的[47]，因此，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體的應(yīng)用可以有效地治療wARMD。

年齡相關(guān)性黃斑病變的發(fā)病機(jī)制目前考慮主要與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)與新生血管形成相關(guān)的機(jī)制、氧化應(yīng)激、自噬、線粒體DNA的損傷等有關(guān)[48-50]。目前均有針對(duì)這些機(jī)制而采取的治療措施。雷珠單抗、阿柏西普等抗VEGF藥物治療雖然給ARMD患者帶來了突破性的研究進(jìn)展，然而，抗VEGF治療并不能從根本上改變疾病的進(jìn)程或預(yù)防疾病的發(fā)展，只能延緩其進(jìn)展[48]，且抗VEGF治療對(duì)于黃斑中心凹萎縮的干性ARMD患者無效，長(zhǎng)期的抗VEGF治療可能會(huì)破壞黃斑區(qū)功能結(jié)構(gòu)致地圖樣萎縮和纖維化[51-53]。

Scg3目前作為一種新近發(fā)現(xiàn)的血管生長(zhǎng)因子被廣泛研究；LeBlanc等研究發(fā)現(xiàn)Scg3與VEGF具有不同的受體，為Scg3抗體可以作為wARMD的替代治療或聯(lián)合治療以提高治療效果提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[18]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，抗Scg3治療可以有效地抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中Scg3誘導(dǎo)的增殖和Src磷酸化；玻璃體腔內(nèi)或皮下注射Scg3 mAb均能顯著減低激光或基底膜誘導(dǎo)的CNV滲漏、CNV病變面積及血管密度[41]。同時(shí)，皮下注射的給藥方式能有效地避免玻璃體腔內(nèi)主要可能帶來的并發(fā)癥與風(fēng)險(xiǎn)[41]。LeBlanc等研究還發(fā)現(xiàn)，Scg3 mAb對(duì)發(fā)育中的視網(wǎng)膜以及其他器官的副作用最小[4]，相比VEGF而言具有更高的安全性和有效性，所以，抗Scg3有望成為第一個(gè)在內(nèi)皮細(xì)胞配體引導(dǎo)下，高選擇性靶向治療CNV的血管生成抑制劑。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，抗Scg3治療在治療眼底視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管中具有重要作用。近年來對(duì)Scg3的深入研究，對(duì)了解Scg3的生物構(gòu)成及其作用機(jī)制具有重要意義。目前的動(dòng)物研究表明抗Scg3在治療眼底視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管上副作用最小，安全性最高，但其長(zhǎng)期的安全性還有待進(jìn)一步研究。我們還可以推測(cè)抗Scg3治療不僅對(duì)治療ROP有效，甚至有望治療其他新生血管性疾病，例如角膜新生血管、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、新生血管性青光眼等，同時(shí)也將更加全面地深入研究Scg3的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制。