組織工程結(jié)膜支架的研究進(jìn)展

唐浚杰，劉小勇，周 清，陳 劍

結(jié)膜重建常用于各種化學(xué)熱燒傷所導(dǎo)致的嚴(yán)重結(jié)膜缺損，而組織工程結(jié)膜能有效解決在結(jié)膜移植中自體結(jié)膜移植材料缺乏及異體結(jié)膜移植材料存在免疫排斥反應(yīng)等難題。具有良好生物相容性及足夠生物力學(xué)強(qiáng)度的支架材料是構(gòu)建組織工程結(jié)膜的重要條件。本文對(duì)組織工程結(jié)膜支架材料的最新研究進(jìn)展及目前存在的問題進(jìn)行總結(jié)。

0 引言

結(jié)膜是由眼瞼緣間部末端開始，覆蓋于眼瞼后和眼球前節(jié)鞏膜表面的一層半透明黏膜組織，組織學(xué)上由鱗狀上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及疏松結(jié)締組織組成。結(jié)膜直接與外界接觸，很容易受各種外傷損害，嚴(yán)重?zé)釤齻?、化學(xué)燒傷以及嚴(yán)重的眼表疾病如眼瘢痕性類天皰瘡、Stevens-Johnson綜合征等，可導(dǎo)致結(jié)膜大面積受損，嚴(yán)重影響結(jié)膜上皮的分泌功能和眼表的完整性，造成廣泛粘連和瘢痕形成。瞼球粘連的治療需要手術(shù)移除瘢痕組織及重建深部穹窿，切除瘢痕組織后暴露的鞏膜需要覆蓋結(jié)膜組織。結(jié)膜重建手術(shù)最大的限制因素是，當(dāng)患者雙眼均缺乏可提供移植的健康結(jié)膜組織時(shí)需要用到結(jié)膜組織代替物。為了解決結(jié)膜移植材料短缺及免疫排斥反應(yīng)等難題，學(xué)者們開始把目光轉(zhuǎn)向組織工程結(jié)膜的研究。組織工程結(jié)膜主要由種子細(xì)胞、支架材料及調(diào)控微環(huán)境構(gòu)建而成[1]。符合臨床需求的組織工程結(jié)膜的支架材料需要滿足以下條件：足夠的力學(xué)強(qiáng)度，良好的生物相容性。與組織工程角膜不同的是，組織工程結(jié)膜的支架材料并不需要透明的材料，從而大大增加了材料選擇的范圍。大量的研究已經(jīng)嘗試把各種不同類型的支架材料運(yùn)用到組織工程結(jié)膜中，其中主要包括生物材料支架、蛋白材料支架、聚合物材料支架及混合材料支架[2]。

1 生物材料支架

1.1羊膜 羊膜具有光滑，無血管、神經(jīng)及淋巴，具有彈性，含有多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子等特點(diǎn)。羊膜是目前臨床結(jié)膜重建最常用的結(jié)膜代替物，其優(yōu)點(diǎn)包括促進(jìn)上皮細(xì)胞修復(fù)、減少炎癥反應(yīng)和瘢痕形成等[3]，而且Yang等[4]發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化成類結(jié)膜樣上皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)研究表明，普通羊膜或脫細(xì)胞羊膜均可用于結(jié)膜重建[5]。Jie等[6]選取新西蘭大白兔作為動(dòng)物模型，使用脫細(xì)胞羊膜進(jìn)行結(jié)膜重建術(shù)并以正常羊膜移植為對(duì)照，結(jié)果提示脫細(xì)胞羊膜可有效促進(jìn)上皮細(xì)胞復(fù)層及杯狀細(xì)胞分化，并且有助于減少炎癥反應(yīng)及瘢痕形成。羊膜移植目前在臨床上廣泛應(yīng)用于眼表重建，但是羊膜移植仍然存在著不足之處：(1)羊膜移植片在炎癥浸潤(rùn)的環(huán)境中會(huì)快速降解從而降低了上皮再生的成功率，這限制了羊膜移植在眼化學(xué)傷、燒傷等嚴(yán)重的炎癥環(huán)境中的使用；(2)羊膜供體的個(gè)體差異使羊膜移植片的厚度與質(zhì)量存在差異，同時(shí)存在著傳染病感染的風(fēng)險(xiǎn)。 羊膜移植的缺點(diǎn)使其適用范圍受到限制，進(jìn)而促使研究者把目光投向新型支架材料用于眼表重建。

1.2脫細(xì)胞基質(zhì) 脫細(xì)胞基質(zhì)是指通過化學(xué)法、表面活性劑法、蛋白酶法等去除細(xì)胞、DNA以及抗原的三維結(jié)構(gòu)組織[7]。脫細(xì)胞基質(zhì)支架最大的優(yōu)點(diǎn)是其擁有組織特異性的生物力學(xué)強(qiáng)度與生物相容性，同時(shí)它能直接還原細(xì)胞生長(zhǎng)的三維環(huán)境，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖與分化。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，脫細(xì)胞結(jié)膜相比羊膜有以下優(yōu)點(diǎn)：更好的愈合效果，更好的眼表力學(xué)穩(wěn)定性[7-8]。Witt等[9]選取人脫細(xì)胞結(jié)膜及豬脫細(xì)胞結(jié)膜進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并與羊膜進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示脫細(xì)胞結(jié)膜更有利于傷口愈合而且力學(xué)穩(wěn)定性更佳，但是免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)在脫細(xì)胞結(jié)膜組及羊膜組基本無差異。脫細(xì)胞的豬結(jié)膜來源廣泛而且脫細(xì)胞豬結(jié)膜在各項(xiàng)生物性能上與人脫細(xì)胞結(jié)膜基本相近[9]，所以從倫理及經(jīng)濟(jì)效益角度上考慮，豬脫細(xì)胞結(jié)膜在結(jié)膜重建中是更好的選擇。脫細(xì)胞牛心包組織作為可降解生物補(bǔ)片已經(jīng)在臨床上應(yīng)用于泌尿系重建、乳房切除術(shù)后重建等[10-11]。Huang等[12]嘗試使用脫細(xì)胞牛心包組織在動(dòng)物模型上進(jìn)行結(jié)膜重建，結(jié)果顯示結(jié)膜上皮細(xì)胞能在脫細(xì)胞牛心包補(bǔ)片上有效生長(zhǎng)，脫細(xì)胞牛心包補(bǔ)片移植組的恢復(fù)速度更快，心包組織中含有的肌源性成纖維細(xì)胞亦有助于膠原結(jié)構(gòu)的重建，但是由于結(jié)膜Tenon囊與鞏膜間有一層較厚的膠原組織限制了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，脫細(xì)胞牛心包基質(zhì)無法有效構(gòu)建上皮細(xì)胞復(fù)層，在一定程度上限制了其在眼表重建中的臨床應(yīng)用。脫細(xì)胞基質(zhì)是近年組織工程研究的熱點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：(1)材料來源廣泛，研究者可利用非眼表脫細(xì)胞組織進(jìn)行眼表重建，如心包組織及羊膜等，意味著更多的脫細(xì)胞組織有望用于眼表重建。(2)脫細(xì)胞基質(zhì)高度還原細(xì)胞生長(zhǎng)骨架，表現(xiàn)出較好的生物相容性，有利于細(xì)胞的增殖及分化。(3)制備方法簡(jiǎn)單高效。但是天然基質(zhì)中所含的各類可溶性生長(zhǎng)因子成分在脫細(xì)胞過程中難以保留。結(jié)合其優(yōu)缺點(diǎn)，脫細(xì)胞基質(zhì)作為支架材料用于眼表重建的前景十分廣闊。

2 蛋白材料支架

2.1膠原蛋白 結(jié)膜的基底膜由Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白-1、巢蛋白-2以及血小板反應(yīng)蛋白-4組成[13]，該理論為組織工程結(jié)膜的支架材料提供了新的選擇。其中關(guān)于Ⅰ型膠原蛋白的研究較多，但是單純的膠原蛋白的孔狀結(jié)構(gòu)呈隨機(jī)排列，使其缺乏彈性從而導(dǎo)致支架缺乏足夠的力學(xué)強(qiáng)度[14]。部分學(xué)者開始嘗試用改良復(fù)合型膠原蛋白制作支架，如塑化壓縮型膠原(plastic compressed collagen，PCC)及膠原vitrigel膜(collagen vitrigel, CV)。Drechsler 等[15]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人結(jié)膜上皮細(xì)胞能在PCC上有效增殖、分化， Witt等[16]使用PCC在結(jié)膜缺損兔模型上進(jìn)行結(jié)膜重建，結(jié)果顯示PCC移植片上能有效形成上皮復(fù)層及杯狀細(xì)胞表達(dá)，而且無瘢痕形成，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中PCC表現(xiàn)出足夠的力學(xué)強(qiáng)度與彈性，而且手術(shù)操作性良好。CV屬于Ⅰ型膠原膜，它的制作過程分為三步：凝膠化、玻璃化、脫水。CV的力學(xué)及光學(xué)性質(zhì)可由玻璃化過程的時(shí)間、溫度及濕度控制。Zhou等[17]成功使用CV作為結(jié)膜替代物用于結(jié)膜重建，它的優(yōu)點(diǎn)包括：足夠的彈性、透明、生物相容性佳、方便手術(shù)操作等。隨著技術(shù)的改進(jìn)，復(fù)合型膠原蛋白支架填補(bǔ)了原來單純的膠原蛋白支架的缺點(diǎn)，目前PCC用于眼表重建已經(jīng)完成體外及動(dòng)物體內(nèi)的研究，其力學(xué)強(qiáng)度及生物相容性滿足臨床需求，且無感染風(fēng)險(xiǎn)，后續(xù)研究可關(guān)注其運(yùn)用于臨床實(shí)踐中的效果。

2.2纖維蛋白 纖維蛋白主要來源于血漿蛋白，因此具有明顯的血液和組織相容性。它的主要生理功能為止血，另外還可促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合。纖維蛋白還可作為一種骨架，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，并具有一定的殺菌作用。纖維蛋白作為組織工程支架材料已廣泛應(yīng)用于各種組織，如骨、心臟、神經(jīng)、皮膚、角膜等[18]。Safinaz等[19]利用自體纖維蛋白制作組織工程結(jié)膜支架，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示自體纖維蛋白支架與羊膜移植效果接近。自體纖維蛋白支架的優(yōu)點(diǎn)在于材料獲取容易、高效和生物相容性佳，而且其降解速率可由抗蛋白酶肽控制。目前纖維蛋白支架應(yīng)用于組織工程結(jié)膜的實(shí)驗(yàn)研究數(shù)量較少，臨床應(yīng)用效果有待觀察。

3 聚合物材料支架

聚合物支架材料包括乙醇酸、乳酸、6-己內(nèi)酯、1,3-碳酸三甲烯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸等。其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和聚己內(nèi)酯(PCL)已通過美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局審核可應(yīng)用于人體。聚合物支架的優(yōu)點(diǎn)有：生物降解率可以由聚合物組成成分進(jìn)行調(diào)控，嚴(yán)格無菌的制作過程可避免傳染病感染的風(fēng)險(xiǎn)，良好的力學(xué)強(qiáng)度。Ang等[20]使用超薄PCL進(jìn)行兔眼結(jié)膜重建，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示超薄PCL膜有足夠的力學(xué)強(qiáng)度，易于手術(shù)操作。結(jié)膜上皮細(xì)胞能在氫氧化鈉處理后的超薄PCL膜上有效附著、增殖、復(fù)層，杯狀細(xì)胞在超薄PCL膜上亦有增殖、分化。He等[21]對(duì)多種聚合物支架進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞僅能在部分聚合物支架中有效表達(dá)，而杯狀細(xì)胞在移植片上的有效增殖分化意味著更高的臨床應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)橹亟ǖ慕Y(jié)膜若缺乏杯狀細(xì)胞將難以構(gòu)成穩(wěn)定的淚膜。Huhtala等[22]在聚乳酸材料上培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞、兔結(jié)膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞、牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞、人結(jié)膜上皮細(xì)胞等，檢測(cè)聚乳酸材料的細(xì)胞毒性及生物相容性，結(jié)果顯示聚乳酸材料擁有可靠的生物相容性。Campillo-Fernandez等[23]運(yùn)用多種聚合物材料培養(yǎng)結(jié)膜上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸聚合物能讓結(jié)膜上皮細(xì)胞更好地增殖、分化。

聚合物材料支架的研究深入，而且通過了大量的安全監(jiān)測(cè)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，但是僅有少量聚合物材料能同時(shí)滿足高力學(xué)強(qiáng)度、良好的生物相容性等條件。雖然聚合物材料現(xiàn)已應(yīng)用于臨床，但是該類材料造價(jià)昂貴，難以在臨床上廣泛普及。

4 混合材料支架

4.1電紡技術(shù) 電子紡織技術(shù)可以通過編制納米纖維制作類似細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的支架。獨(dú)特的納米纖維結(jié)構(gòu)可以協(xié)助細(xì)胞増殖及分化，并且能夠讓支架與外周環(huán)境有效交換營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物[24-25]。Barati等[26]使用天然絲蛋白與合成左旋聚乳酸(PLLA)進(jìn)行電紡編織構(gòu)建支架，并在其表面成功誘導(dǎo)結(jié)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞(insulin producing cells, IPCs)，證明電紡技術(shù)所構(gòu)建的混合材料支架同樣具有良好的生物相容性。Yao等[27-28]利用電子紡織技術(shù)對(duì)聚合物支架進(jìn)行改良，分別使用膠原蛋白、纖維蛋白與PLGA進(jìn)行電紡編織，這類支架結(jié)合了聚合物材料支架與蛋白材料支架的優(yōu)點(diǎn)，生物相容性佳，高力學(xué)強(qiáng)度，而且結(jié)膜上皮細(xì)胞能在其表面生長(zhǎng)增殖，同時(shí)不產(chǎn)生明顯炎癥反應(yīng)，該類支架的降解產(chǎn)物為氨基酸、乳酸及己酸，均可代謝且無細(xì)胞毒性?？偨Y(jié)電紡技術(shù)用于眼表重建的優(yōu)點(diǎn)：(1)精準(zhǔn)編織及改良空間結(jié)構(gòu)以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需求。(2)材料來源廣泛且組合選擇豐富。因此，電紡技術(shù)編織混合材料制作支架的概念可進(jìn)一步發(fā)展，嘗試不同材料聯(lián)合構(gòu)建的效果以完善支架性質(zhì)。

4.2 3D打印技術(shù) 3D打印技術(shù)采用逐層打印的方法，從微觀到宏觀進(jìn)行結(jié)構(gòu)制作，能有效構(gòu)建有利于組織形成和促進(jìn)宿主組織整合的仿生結(jié)構(gòu)環(huán)境，因此3D打印技術(shù)能運(yùn)用在組織工程支架的制造當(dāng)中。Dehghani等[29]以凝膠、彈性蛋白及透明質(zhì)酸為材料，利用3D打印技術(shù)制作組織工程結(jié)膜支架，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該支架便于手術(shù)操作，細(xì)胞在其表面能有效粘附、增殖及分化，抗炎效果佳，降解周期長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)中使用的凝膠是膠原來源的一種蛋白，它能模仿結(jié)膜基底膜中Ⅳ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，彈性蛋白與透明質(zhì)酸的添加減少了免疫抗原成分并還原了細(xì)胞生長(zhǎng)的生理環(huán)境。3D打印技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與電紡技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)接近，均可對(duì)支架微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造以滿足生物力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)可利用多種生物材料用于構(gòu)建骨架以滿足生物相容性。期待在未來的研究中，該類新型材料制造技術(shù)可以脫細(xì)胞基質(zhì)為模板進(jìn)行快速?gòu)?fù)制以高效還原天然基質(zhì)結(jié)構(gòu)用于眼表重建。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，符合臨床需求的組織工程結(jié)膜支架需滿足以下條件：良好的生物相容性，足夠的生物力學(xué)強(qiáng)度。臨床上傳統(tǒng)使用的羊膜作為支架進(jìn)行結(jié)膜重建，面臨著降解速率快、細(xì)胞分化率低等問題難以解決。聚合物材料支架正在逐步進(jìn)入臨床使用，但是普及度較低。新型蛋白質(zhì)材料支架以CV、PCC為代表，經(jīng)過化工處理后表現(xiàn)出優(yōu)良性質(zhì)，可期待該類支架的進(jìn)一步進(jìn)展。3D打印技術(shù)與電紡技術(shù)等高新技術(shù)應(yīng)用于組織工程具有巨大前景，它們可以利用多種不同來源的材料對(duì)模型進(jìn)行快速構(gòu)建。脫細(xì)胞基質(zhì)保留了細(xì)胞生長(zhǎng)原始環(huán)境，是當(dāng)前各項(xiàng)技術(shù)追求還原的結(jié)構(gòu)，而且脫細(xì)胞基質(zhì)材料來源廣泛，制備過程快捷方便，是目前組織工程結(jié)膜支架的熱門研究方向。