雞球蟲(chóng)病三價(jià)四株活疫苗實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)

雷 璇，鄭明學(xué)，郭鈺玨，白 瑞，張 黎，張雪松，康慧鑫，李瑞琪，殷莉陽(yáng)，楊洪靜，王 辰，郭露露

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

雞球蟲(chóng)病會(huì)給世界禽類產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前控制雞球蟲(chóng)病的方法是使用抗球蟲(chóng)藥物和球蟲(chóng)病活疫苗，但抗球蟲(chóng)藥物導(dǎo)致了很多問(wèn)題的出現(xiàn)[2-3]，且強(qiáng)毒株球蟲(chóng)病活疫苗會(huì)使雞只出現(xiàn)較大的損傷，影響其生長(zhǎng)性能。雞球蟲(chóng)病三價(jià)四株活疫苗采用早熟弱毒株，致病性弱，對(duì)雞的生長(zhǎng)性能影響小且含2種巨型艾美耳蟲(chóng)珠，具有較廣的抗蟲(chóng)范圍。為保證雞球蟲(chóng)病三價(jià)四株活疫苗的免疫效果，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)該疫苗進(jìn)行了最小免疫劑量試驗(yàn)、最小首免日齡試驗(yàn)、最小二免間隔期試驗(yàn)、免疫產(chǎn)生期和持續(xù)期試驗(yàn)以及網(wǎng)上平養(yǎng)和地面平養(yǎng)試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 疫苗和蟲(chóng)株 雞球蟲(chóng)病三價(jià)四株活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲(chóng)PTSX株+巨型艾美耳球蟲(chóng)PMSX株+巨型艾美耳球蟲(chóng)PMSD株+堆型艾美耳球蟲(chóng)PASX株)(每毫升疫苗液中含PTSX3.0×105個(gè)孢子化卵囊、PMSX3.0×104個(gè)孢子化卵囊、PMSD3.0×104個(gè)孢子化卵囊、PASX1.2×105個(gè)孢子化卵囊)，以上蟲(chóng)株均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室保存與提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雛雞由北京Merial SPF種蛋孵化而來(lái)。

1.3 最小免疫劑量試驗(yàn) 將網(wǎng)上平養(yǎng)的4日齡SPF雛雞隨機(jī)分為12組，10只/組，分別為一次免疫攻毒組(T11～T14)、二次免疫組(T21～T24)、攻毒對(duì)照組(C1、C2)和空白對(duì)照組(C01、C02)。使用不同劑量的雞球蟲(chóng)病三價(jià)四株活疫苗分別于4日齡對(duì)T11～T14和T21～T24組首免，14日齡對(duì)T21～T24組二免，各組免疫劑量見(jiàn)表1。T11～T14和C1組于一免14 d、T21～T24和C2組于二免14 d空腹稱重后攻擊檢驗(yàn)用混合強(qiáng)毒(PTSX4.0×104、PASX20.0×104、PMSX15.0×104、PMSD15.0×104個(gè)孢子化卵囊/只)；C01(18日齡空腹稱重)和C02(28日齡空腹稱重)不接種不攻毒。攻毒后連續(xù)7 d觀察雞只臨床狀況(精神狀態(tài)、食欲和死亡情況等)并記錄。攻毒第7天末剖檢所有雞只，觀察記錄十二指腸、小腸中段和盲腸的病理變化，并進(jìn)行病變記分，計(jì)算平均值。選擇能達(dá)到免疫效力標(biāo)準(zhǔn)的最低劑量作為最小免疫劑量。

1.4 最小首免日齡試驗(yàn) 將網(wǎng)上平養(yǎng)的4日齡SPF雞隨機(jī)分為9個(gè)組，每組10只，包括1個(gè)空白對(duì)照組(C0)、4個(gè)不免疫攻毒組(C1～C4)和4個(gè)免疫攻毒組(T1～T4)。免疫攻毒組以最小免疫劑量，分別于2、3、4日齡和5日齡進(jìn)行一次免疫，一免第10天以2倍最小免疫劑量進(jìn)行二次免疫，免疫后第14天同1.3項(xiàng)攻檢驗(yàn)強(qiáng)毒，攻毒后觀察和測(cè)定指標(biāo)除1.3項(xiàng)外，同時(shí)計(jì)算每組雞只的平均增重、相對(duì)增重以及死亡率，選擇能達(dá)到免疫效力標(biāo)準(zhǔn)的最小免疫日齡作為最小首免日齡。

1.5 最小二免間隔期測(cè)定 將網(wǎng)上平養(yǎng)的SPF雞隨機(jī)分為11個(gè)組，每組10只，分別為1個(gè)空白對(duì)照組(C0)、5個(gè)不免疫攻毒組(C1～C5)和5個(gè)免疫攻毒組(T1～T5)。免疫攻毒組以最小免疫劑量分別于4日齡進(jìn)行一次免疫，一次免疫后在第7、8、9、10天和第11天以2倍最小免疫劑量進(jìn)行二免，免疫后第14天同1.3項(xiàng)攻檢驗(yàn)強(qiáng)毒。攻毒觀察和測(cè)定指標(biāo)同1.4項(xiàng)，選擇能達(dá)到免疫效力標(biāo)準(zhǔn)的最低二免間隔作為最小二免間隔期。

1.6 免疫產(chǎn)生期和持續(xù)期試驗(yàn) 將網(wǎng)上平養(yǎng)的SPF雞隨機(jī)分為13個(gè)組，每組10只，分別為1個(gè)空白對(duì)照組(C0)、6個(gè)不免疫攻毒組(C1～C6)和6個(gè)免疫攻毒組(T1～T6)，T1～T6組以1倍和2倍最小免疫劑量分別于4日齡和14日齡進(jìn)行一次、二次免疫，二免后第6、10、14、28、42、56天攻混合強(qiáng)毒(劑量同一免)。所有雞只在飼養(yǎng)過(guò)程中按常規(guī)進(jìn)行雞新城疫、禽流感、傳染性法氏囊、傳染性支氣管炎免疫接種。攻毒觀察指標(biāo)和方法同1.4項(xiàng)，選擇以免疫后免疫力最早能達(dá)到效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間為免疫產(chǎn)生期；以免疫后免疫力可保持達(dá)到效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的最長(zhǎng)時(shí)間為免疫持續(xù)期。

1.7 網(wǎng)上平養(yǎng)和地面平養(yǎng)對(duì)免疫效果的影響 SPF雞隨機(jī)分為4個(gè)組，每組10只，分別為空白對(duì)照組(C0)、不免疫攻毒組(C1)、網(wǎng)上平養(yǎng)免疫攻毒組(T1)和地面平養(yǎng)免疫攻毒組(T2)，免疫攻毒組以推薦免疫劑量1羽份和2羽份分別于4日齡、14日齡進(jìn)行一次和二次免疫，二次免疫后第14天同1.3項(xiàng)攻檢驗(yàn)強(qiáng)毒。攻毒后進(jìn)行觀察，指標(biāo)和方法同1.4項(xiàng)，判斷該疫苗是否適合于網(wǎng)上和地面平養(yǎng)。

1.8 檢測(cè)指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.8.1 檢測(cè)指標(biāo)

(1)增重：

平均增重=(每組總終體重-每組總初體重)/每組總雞只數(shù)

相對(duì)增重率(RWG)=(試驗(yàn)組的平均增重/空白對(duì)照組的平均增重)×100%

(2)死亡率：

死亡率=(每組死亡雞只數(shù)/每組總雞只數(shù))×100%

(3)腸道病變記分:參考Johnson和Reid法[4]和《獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2008版)[5]分別在第7天對(duì)十二指腸、空腸和盲腸進(jìn)行病變記分。

1.8.2 免疫效果判定標(biāo)準(zhǔn) 參照《獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2008版)和佛山正典的雞球蟲(chóng)病三價(jià)活疫苗的標(biāo)準(zhǔn)[6]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室早熟株和檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株的特性，將本疫苗效力檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)定為：攻毒對(duì)照組，雞的十二指腸、盲腸的平均病變記分≥3.00，空腸平均病變記分≥2.00，死亡率為40.0%～50.0%；免疫攻毒組，雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分應(yīng)≤1.50，其中至少8只雛雞3個(gè) 腸段的病變記分應(yīng)≤1.0，死亡率≤10.0%。

2 結(jié)果

2.1 最小免疫劑量 一次免疫后，各組雞均未見(jiàn)明顯異常，隨免疫劑量增加，免疫組雞平均增重、相對(duì)增重率逐漸降低，免疫組攻毒前的相對(duì)增重率在80%左右，見(jiàn)表2；攻毒后除一免(T11、T12)兩組和攻毒對(duì)照組(C1組)死亡率為10.0%、10.0%和40.0%外，其余各組均無(wú)死亡。攻毒后，免疫攻毒組各腸道平均病變記分隨免疫劑量增加逐漸降低，免疫組腸道平均病變記分極顯著低于攻毒對(duì)照組(P<0.01)。當(dāng)雞球蟲(chóng)病三價(jià)四株活疫苗一次免疫劑量≥7 200個(gè)孢子化卵囊/只時(shí)，免疫攻毒組至少9只雞各腸道病變記分均≤1.0，達(dá)到良好免疫效果，見(jiàn)表3。

二次免疫試驗(yàn)在免疫后未見(jiàn)明顯異常，攻毒后除C2組死亡率為40.0%外，其余各組均無(wú)死亡。攻毒后，隨免疫劑量增加，腸道平均病變記分逐漸降低；除T21組外，其余各免疫組腸道平均病變記分均≤1.0，極顯著低于攻毒對(duì)照組(P<0.01)。當(dāng)雞球蟲(chóng)病三價(jià)四株活疫苗一免/二免劑量分別≥1 600和3 200個(gè)孢子化卵囊/只時(shí)，免疫攻毒組至少9只雞各腸道病變記分均≤1.0，死亡率≤10.0%，達(dá)到了良好免疫效果，免疫組攻毒前的相對(duì)增重率均高于90%，見(jiàn)表2和表3。

表2 一次免疫與二次免疫接種對(duì)雞增重的影響Table 2 Effects of first and second immunization on average weight gain in chickens

表3 一次免疫與二次免疫攻毒組的腸道病變情況Table 3 Intestinal pathological changes in groups of first and second immunization

2.2 最小首免日齡 免疫雞只在免疫期內(nèi)糞便未見(jiàn)異常也沒(méi)有出現(xiàn)死亡。攻毒后，隨著首免日齡的增大RWG也相對(duì)提高。首免日齡≥4日齡(T3和T4組)免疫攻毒組雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分均≤1.50，均顯著低于(P<0.05)不免疫攻毒組雞(C1～C4組)。其中至少9只雛雞3個(gè)腸段的病變記分均≤1.0，死亡率≤10.0%，符合效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表4。

表4 最小首免日齡測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of minimum first immunization ages test

2.3 最小二免間隔 RWG隨著二免間隔的增大而提高。所有免疫攻毒組均符合效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)即免疫攻毒組雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分均≤1.50，且至少8只雛雞3個(gè)腸段的病變記分≤1.0，死亡率≤10.0%，見(jiàn)表5。

表5 最小二免間隔測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of minimum second immunization interval test

2.4 免疫產(chǎn)生期和持續(xù)期測(cè)定 雛雞在一次免疫后第10～14天(T1～T6組)產(chǎn)生了部分的免疫力，但不符合效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。二次免疫后≥6 d攻毒組(T1～T6組)雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分均≤1.50，其中至少8只雛雞3個(gè)腸段的病變記分均≤1.0，死亡率≤10.0%，均符合免疫攻毒組的效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表6。

表6 免疫產(chǎn)生期和持續(xù)期測(cè)定結(jié)果Table 6 Results of producing immunity time and immunity duration test

2.5 網(wǎng)上與地面平養(yǎng)的效果測(cè)定 網(wǎng)上平養(yǎng)免疫攻毒組(T1)和地面平養(yǎng)免疫攻毒組(T2)雞只平均增重和RWG無(wú)顯著差異(P>0.05)。且T1和T2組雞均沒(méi)有出現(xiàn)死亡，雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分均≤1.50，其中至少8只雛雞3個(gè)腸段的病變記分均≤1.0，符合效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表7。

表7 網(wǎng)上平養(yǎng)與地面平養(yǎng)對(duì)疫苗免疫的影響Table 7 The influence of rearingon floorand in battery on the vaccine immunity

3 討論

雞球蟲(chóng)病活疫苗的免疫效力在一定劑量范圍內(nèi)會(huì)隨著免疫劑量的增大而提高[7]。免疫接種球蟲(chóng)卵囊后機(jī)體對(duì)球蟲(chóng)的免疫力隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低，但也會(huì)隨著再次接種而增強(qiáng)，且在二次免疫中一免提供的免疫力更強(qiáng)，也能夠保持更長(zhǎng)時(shí)間，因此對(duì)于增強(qiáng)免疫力反復(fù)接種球蟲(chóng)卵囊是一個(gè)較好的方法[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨接種劑量的增高，雞只的免疫保護(hù)力也增高。當(dāng)一次免疫時(shí)劑量≥7 200個(gè) 孢子化卵囊/只和二次免疫時(shí)一免/二免劑量分別≥1 600和3 200個(gè)孢子化卵囊/只時(shí)均符合免疫標(biāo)準(zhǔn)，在免疫效果合格的情況下，二次免疫接種劑量小于一次免疫。當(dāng)PASX、PMSX、PMSD以及PTSX的首次免疫劑量分別≥400、100、100、1 000個(gè)孢子化卵囊/只，二次免疫劑量分別≥800、200、200、2 000個(gè) 孢子化卵囊/只時(shí)，可達(dá)到良好免疫效果，符合本疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。因此，在進(jìn)行該疫苗的免疫時(shí)，PASX、PMSX、PMSD以及PTSX的一次免疫最小劑量分別為400、100、100、1 000個(gè)孢子化卵囊/只，二次免疫最小劑量分別為800、200、200、2 000個(gè)孢子化卵囊/只。

在日齡較小時(shí)雞免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，不能產(chǎn)生對(duì)球蟲(chóng)的有效免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致雞只不能產(chǎn)生足夠的免疫力，但免疫日齡過(guò)大，在球蟲(chóng)病多發(fā)期尚不能產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，容易導(dǎo)致球蟲(chóng)病的暴發(fā)[9-10]。因此，需要選擇雛雞接種后能夠產(chǎn)生良好抵抗力的最小日齡。本試驗(yàn)選擇2～5日齡為首免范圍，結(jié)果顯示，隨著首免日齡的增大，免疫力也會(huì)隨之提高。當(dāng)首免日齡≥4日齡時(shí)，免疫效果符合本疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，因此選取4日齡為最小首免日齡。在研究雞球蟲(chóng)早熟株的首免日齡時(shí)，王麗[11]和呂強(qiáng)華[12]發(fā)現(xiàn)雛雞的首免日齡在4～6日齡范圍內(nèi)，均可以獲得良好免疫力，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

一免后，體內(nèi)抗體仍可以在一段時(shí)間內(nèi)提供足夠的免疫力[8]。而體內(nèi)抗體持續(xù)性決定二免間隔時(shí)間，為了使機(jī)體內(nèi)的抗體水平迅速提高，則需要在最適時(shí)間進(jìn)行二次免疫，從而提高免疫力。王麗[11]和顏靜蕊[13]的研究結(jié)果顯示，E.acervulina和E.necatrix的早熟株二免間隔為7～11 d時(shí)，雛雞能夠獲得足夠的保護(hù)力。本試驗(yàn)選擇7～11 d為二免間隔來(lái)測(cè)定該疫苗的最小二免間隔，結(jié)果表明，所有組別均符合疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，也就說(shuō)明雛雞在7～11 d的二免間隔時(shí)間內(nèi)，均可獲得良好的免疫力。因此，7 d為本疫苗的最小二免間隔。

本疫苗按照最小免疫劑量和最小首免日齡來(lái)進(jìn)行免疫，二免在第6～56天攻毒，結(jié)果顯示雛雞均產(chǎn)生了良好的免疫效果，所有觀測(cè)指標(biāo)均符合疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。因此，本疫苗的免疫產(chǎn)生期為二免后的第6天，持續(xù)期至少可達(dá)到第56天，表明該疫苗可以保護(hù)商品白羽肉雞的整個(gè)生長(zhǎng)期(45 d左右)。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，網(wǎng)上平養(yǎng)和地面平養(yǎng)對(duì)該球蟲(chóng)疫苗免疫雛雞的生長(zhǎng)性能的影響無(wú)顯著差異，對(duì)免疫效力也無(wú)顯著影響，證明雞球蟲(chóng)病三價(jià)四株活疫苗可用于網(wǎng)上平養(yǎng)和地面平養(yǎng)2種飼養(yǎng)方式的雞群。