蜂蜜接合酵母及后發(fā)酵對黑糯米酒風(fēng)味的影響

費永濤，姜弘佳，胡方正，彭立影，劉功良，白衛(wèi)東，肖更生

蜂蜜接合酵母及后發(fā)酵對黑糯米酒風(fēng)味的影響

費永濤1,2，姜弘佳1，胡方正1，彭立影1，劉功良1,2※，白衛(wèi)東1,2，肖更生1

（1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣州 510225；2. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣州 510225）

釀造菌種以及后發(fā)酵條件會影響黑糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)的積累與產(chǎn)生，該研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜技術(shù)對黑糯米酒中氨基酸、有機酸和揮發(fā)性香味成分進(jìn)行測定，探究釀造曲種（麥曲、蜂蜜結(jié)合酵母加麥曲和安琪酵母加麥曲）及后發(fā)酵條件（時間和溫度）對黑糯米酒風(fēng)味的影響，從而改善黑糯米酒的風(fēng)味。研究結(jié)果表明蜂蜜接合酵母加麥曲制備的黑糯米酒可以將乳酸占比控制在20%左右，避免乳酸的過量積累，同時顯著提高蘋果酸（2.5 mg/mL）和琥珀酸（1.1 mg/mL）含量（0.05），賦予酒體整體的協(xié)調(diào)性。蜂蜜接合酵母加麥曲樣品制備黑糯米酒中氨基酸（以甜味和鮮味氨基酸為主）的總量為113 mg/L，要高于麥曲制備的黑糯米酒中氨基酸的含量（0.05）。此外，該研究發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)是黑糯米酒中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中糠醛在安琪酵母加麥曲和蜂蜜接合酵母加麥曲黑糯米酒中相對含量分別達(dá)到9.11%和10.00%，高于麥曲黑糯米酒中5.83%的糠醛含量（0.05），因此，蜂蜜接合酵母加麥曲作為釀造曲種更能改善黑糯米酒風(fēng)味。利用最佳的釀造曲種組合，對黑糯米酒的后發(fā)酵時間（0，20，30，40，50 d）和溫度（20，24，28℃）進(jìn)行優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)，酒中氨基酸總量在后發(fā)酵30 d達(dá)到1 024 mg/L，但后發(fā)酵40 d酒中苦味氨基酸迅速減少，同時有機酸種類和含量更為協(xié)調(diào)，并且揮發(fā)性香氣成分中醇、酯和醛類相對含量達(dá)到85.7%，因此，后發(fā)酵40 d有利于黑糯米酒風(fēng)味的形成。相比20 ℃的后發(fā)酵溫度，在24 ℃條件下，黑糯米酒中氨基酸種類和含量快速增加，分別達(dá)到13種和383 mg/L，并且醇、酯和醛類等主要風(fēng)味物質(zhì)相對含量較高，24 ℃的后酵溫度有利于必須氨基酸和主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的積累。研究結(jié)果為蜂蜜接合酵母的應(yīng)用及黑糯米酒風(fēng)味提升提供借鑒。

發(fā)酵；風(fēng)味；溫度；蜂蜜接合酵母；酒曲；黑糯米酒

0 引 言

黑糯米中含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)以及酚類等物質(zhì)[1]，具有滋陰補腎、健脾暖胃、抵抗衰老、強身健體等功效[2-3]。以黑糯米為主要原料釀造的黑糯米酒同樣含有人體所需的豐富營養(yǎng)成分，具有馥郁芬芳的黑糯米香氣，滋味醇厚協(xié)調(diào)，風(fēng)格獨特[4-7]。微生物發(fā)酵是制備黑糯米酒過程中最重要的環(huán)節(jié)，酒的口感與風(fēng)味在很大程度上會受酒曲中的微生物的種類及代謝產(chǎn)物影響，因此酒曲的選擇以及釀造菌種的添加對酒的品質(zhì)具有重要的影響[8-10]。大量研究發(fā)現(xiàn)多種菌株混合釀造的酒所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)成分比單一菌種更豐富[11-14]。蘇偉等[15]對貴州不同地區(qū)黑糯米酒曲的品質(zhì)進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)不同曲種釀造的黑糯米酒，酒的風(fēng)味和營養(yǎng)成分有顯著差別（<0.05）。同時，發(fā)酵條件如溫度、時間和原料等對酒的風(fēng)味也有顯著的影響[16-17]。母應(yīng)春等[17]利用新基質(zhì)原料（如枸杞、山藥、覆盆子等）制作黑糯米酒的酒曲，發(fā)現(xiàn)不同釀造溫度和時間釀造微生物菌群結(jié)構(gòu)和酶促反應(yīng)速率有顯著的差別（0.05），進(jìn)而會影響黑糯米酒的風(fēng)味。此外，有機酸種類和含量對酒的風(fēng)味也有顯著的影響（0.05），同時有機酸也是酒體酯類物質(zhì)重要的前體物質(zhì)之一[18]。氨基酸的組成也會對酒體風(fēng)味有顯著的影響，例如苦味與澀味氨基酸大量積累會給米酒帶來苦澀的味道，同時鮮味與甜味氨基酸也會給酒體帶來鮮甜味[19-20]。前人針對提升黑糯米酒風(fēng)味的研究主要集中在酒曲的篩選、酒曲原料的改進(jìn)以及釀造條件的優(yōu)化方面[15-17]，而通過在酒曲中添加釀造菌種來改善黑糯米酒風(fēng)味的研究鮮有報道。

本文以麥曲、麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母及麥曲協(xié)同安琪酵母3種曲種組合方式分別釀造黑糯米酒，探討釀造曲種對黑糯米酒中的有機酸、氨基酸含量及香氣成分等風(fēng)味物質(zhì)的影響。在此基礎(chǔ)上，研究后發(fā)酵條件對麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造的黑糯米酒品質(zhì)的影響，擬為黑糯米酒的工藝研究提供理論基礎(chǔ)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥曲：廣東紫金黃龍酒業(yè)有限公司；蜂蜜接合酵母LGL-1：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院實驗室篩選出的耐高糖酵母菌株，保存于中國典型物保藏中心，編號為M2015545；安琪酵母（黃酒高活性干酵母）：安琪酵母股份有限公司；黑糯米：貴州永紅酒業(yè)有限公司。

蜂蜜接合酵母培養(yǎng)基配方：70.0 g葡萄糖、2.0 g瓊脂粉、2.0 g蛋白胨、1.0 g酵母提取粉，100 mL去離子水。甲醇、乙腈、鄰苯二甲醛（O-Phthalaldehyde，OPA）、硼酸鹽緩沖液、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品等試劑均為色譜純；酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、磷酸、磷酸氫二銨、氯化鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9602恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GM-1.0A隔膜真空泵：天津津騰實驗設(shè)備有限公司；KQ5200V超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；6890N質(zhì)譜儀、5973氣相色譜儀、1260液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化、擴培

酵母菌的活化擴培方法參考課題組前期報道[21]，從-80 ℃冰箱取出保藏的蜂蜜接合酵母LGL-1，28 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min。制備葡萄糖質(zhì)量濃度為700 g/L的試管斜面固體培養(yǎng)基，高溫滅菌后，待培養(yǎng)基凝固，挑取一環(huán)蜂蜜接合酵母LGL-1在培養(yǎng)基斜面劃線培養(yǎng)96 h，至出現(xiàn)菌落。安琪酵母的活化方法同蜂蜜接合酵母LGL-1，培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L。

擴大培樣：挑取兩環(huán)活化的蜂蜜接合酵母LGL-1菌株于10 mL葡萄糖質(zhì)量濃度為300 g/L的培養(yǎng)液中，將安琪酵母接種到葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L的培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h后，將10 mL發(fā)酵液倒入90 mL葡萄糖質(zhì)量濃度為 300 g/L的培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min 恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)48 h，即成接種液，經(jīng)平板稀釋檢測法測定，接種液的活菌數(shù)量為1.5×109個/mL。

1.3.2 黑糯米酒制備工藝

黑糯米酒的發(fā)酵分為前發(fā)酵和后發(fā)酵，前發(fā)酵流程如圖1所示，選取沒有霉變，品質(zhì)均一的黑糯米，用水沖洗3遍，然后將洗干凈的黑糯米進(jìn)行浸泡處理，液面覆蓋米粒，在室溫（25 ℃）下浸泡24 h；對浸泡過的黑糯米進(jìn)行蒸煮，干凈的紗布將浸泡好的黑糯米包好，置于高壓滅菌鍋內(nèi)，121 ℃蒸煮20 min，蒸完的米粒應(yīng)該無夾生、有彈性但不粘手，達(dá)到熟而不爛，將蒸好的米飯攤開到濾布上，室溫冷卻至30 ℃左右；按1.0%的比例將麥曲加入淋涼好的米飯中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，裝入發(fā)酵容器內(nèi)，稍壓實以防塌窩，搭窩并用保鮮膜封口后放入生化培養(yǎng)箱，進(jìn)行糖化，時間為36 h。將上述活化的酵母菌液，按10%的比例分別加入到糖化液中，同時將未添加酵母菌種空白對照，在28 ℃下發(fā)酵6 d，前發(fā)酵結(jié)束后將黑糯米酒放置在24 ℃培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行后發(fā)酵。

1.3.3 后發(fā)酵條件對黑糯米酒風(fēng)味的影響

探究蜂蜜接合酵母LGL-1和安琪酵母對黑糯米酒品質(zhì)的影響，將前文活化的蜂蜜接合酵母LGL-1和安琪酵母菌液，按10%的比例分別加入到由麥曲作為菌種發(fā)酵制備的糖化液中，同時將未添加酵母菌種作為空白對照，在28 ℃下發(fā)酵6 d，前發(fā)酵結(jié)束后將黑糯米酒放置在24 ℃培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行后發(fā)酵，時間為40 d，測定黑糯米酒中有機酸、氨基酸以及揮發(fā)性風(fēng)味成分。

圖1 黑糯米酒生產(chǎn)工藝流程

此外，研究后發(fā)酵時間及溫度對黑糯米品質(zhì)的影響，將麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母LGL-1對黑糯米進(jìn)行前發(fā)酵，結(jié)束后將前發(fā)酵得到的黑糯米酒置于24 ℃培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行20、30、40、50 d后發(fā)酵試驗，測定黑糯米酒中有機酸、氨基酸以及揮發(fā)性風(fēng)味成分；將麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母LGL-1對黑糯米進(jìn)行前發(fā)酵，結(jié)束后將前發(fā)酵得到的黑糯米酒置于20、24、28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行40 d后發(fā)酵試驗，測定黑糯米酒中有機酸、氨基酸以及揮發(fā)性風(fēng)味成分。

1.3.4 黑糯米酒中有機酸的測定

利用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）對中黑糯米酒中的有機酸含量進(jìn)行測定，參考國標(biāo)GB 5009.157—2016[22]。吸取5 mL黑糯米酒樣在6 000 r/min條件下離心5 min，將上清液經(jīng)0.22m有機濾膜過濾后，超聲波除氣10 min，備用。

色譜條件：色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6 mm×250 mm，5m；流速：0.9 mL/min；檢測波長：213 nm；柱溫：30 ℃；流動相配比：0.01 mol/L磷酸氫二銨（pH值3.0）溶液與甲醇的體積比為2∶98。

有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取酒石酸1600 mg，蘋果酸400 mg，乳酸387.2 mg，乙酸504 mg，檸檬酸200 mg，琥珀酸480 mg，用超純水定容至100 mL。根據(jù)樣品中有機酸含量分別稀釋，經(jīng)0.22m有機濾膜過濾進(jìn)樣。以有機酸濃度為值，同一樣品檢測10次濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差為值，計算回歸方程和決定系數(shù)，其中酒石酸：1=139.61+4.14（2=1.000 0），蘋果酸：2=168.922+2.49（2=1.000 0）乳酸：3=83.1643+5.91（2=0.999 9），乙酸：4=115.54+17.29（2=0.999 7），檸檬酸：5=109.435+8.39（2=0.999 9），琥珀酸：6=169.876-4.45（2=0.997 9）。將酒樣與有機酸標(biāo)準(zhǔn)品以8∶2的體積比混合，分別測定酒樣、有機酸標(biāo)準(zhǔn)品和混合樣品的有機酸含量，試驗重復(fù)3次。

1.3.5 黑糯米酒中氨基酸的測定

黑糯米酒中氨基酸的測定方法參考陳林等[23]報道，略有改動。使用OPA試劑對離心得到的發(fā)酵上清液進(jìn)行在線衍生化。

色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse AAA氨基酸分析柱，4.6 mm×150 mm，5m，柱溫值35 ℃，流動相A為0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液（pH值7.8），流動相B為甲醇+乙腈+水（體積比為45∶45∶10）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別以1、3、5、7、9L進(jìn)樣量吸取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，以進(jìn)樣量為值，峰面積為值計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，其中天冬氨酸：1=143.391+ 4.24（2=0.999 5），谷氨酸：2=151.952+9.78（2=0.999 8），絲氨酸：3=190.033+1.29（2=0.999 9），組氨酸：4=74.734+5.17（2=0.952 5），甘氨酸：5= 162.735+0.24（2=0.996 2），蘇氨酸6=163.116+8.04（2=0.997 3）精氨酸：7=177.447+2.00（2=0.999 9），丙氨酸：8=201.288+6.61（2=0.999 8），酪氨酸：9=167.649+2.54（2=0.9933），半胱氨酸：10=281.2210+1.22（2=0.9998），纈氨酸：11=138.3611+5.15（2=0.9999），蛋氨酸：12=240.7412+1.56(2=0.999 9)，苯丙氨酸：13=111.3213+1.04(2=0.999 9)，異亮氨酸：14=223.0514+3.39(2=0.999 8)，亮氨酸：15=142.0115+8.65(2=0.995 8)，賴氨酸：16=385.8816-5.80(2=0.999 6)。將酒樣與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品以100∶1的體積比混合，分別測定酒樣、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和混合樣品的氨基酸含量。

1.3.6 黑糯米酒中揮發(fā)性香氣成分的測定

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對黑糯米酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測定，具體方法參考已報道文獻(xiàn)[24]，略有修改。

樣品預(yù)處理：取8 mL酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2 g氯化鈉和轉(zhuǎn)子，置于40 ℃恒溫磁力攪拌器中，將老化過的萃取頭插入萃取瓶，頂空萃取40 min。萃取完成后先收回萃取頭再拔出針頭，采取手動進(jìn)樣方式將針頭插入質(zhì)譜進(jìn)樣口，開始程序后立即推出萃取頭，解吸5 min后收回萃取頭，拔出針頭。

色譜條件：色譜柱DB-5(30 mm×0.25 mm，0.25m)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：35 ℃保持3 min，以每分鐘10 ℃升至110 ℃，保持3 min，再以每分鐘5 ℃升至150 ℃，保持2 min，最后以每分鐘7 ℃升至230 ℃，保持6 min；載氣：He；流速：1 mL/min；壓力53.5 kPa，進(jìn)樣量1L；不分流。

質(zhì)譜條件：電子能量：70 eV；離子源溫度230 ℃；采集模式：全掃描；四級桿溫度：150 ℃。

定性定量分析：使用Proteo Wizard軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，同時利用XCMS做保留時間矯正、峰識別、峰積分等工作。使用OSI-SMMS軟件配合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)鑒定。采用峰面積歸一化法計算各化學(xué)成分的相對含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±SD）表示，采用Origin 9.0進(jìn)行處理，采用統(tǒng)計軟件 SPSS 22.0 進(jìn)行ANOVA 分析，0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機酸和氨基酸的測定

黑糯米酒中主要存在酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸這6種有機酸，本研究采用HPLC的方法成功檢測出黑糯米酒中的6種有機酸，測定結(jié)果如圖2所示。

注：蘋果酸3.593 min，乳酸4.297 min，乙酸4.546 min，檸檬酸5.300 min，琥珀酸6.171 min。

在黑糯米酒發(fā)酵過程中，微生物分泌蛋白酶將黑糯米中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸，本研究采用HPLC的方法成功檢測出黑糯米酒中的16種氨基酸的相對含量，測定結(jié)果如圖3所示。

注：天冬氨酸1.526 min，谷氨酸3.109 min，絲氨酸5.937 min，甘氨酸7.107 min，蘇氨酸7.494 min，精氨酸8.109 min，苯丙氨酸8.439 min，酪氨酸9.618 min，纈氨酸11.318 min，蛋氨酸11.507 min，苯丙氨酸12.683 min，異亮氨酸12.805 min，亮氨酸13.134 min，賴氨酸13.826 min。

2.2 釀造曲種對黑糯米酒風(fēng)味的影響

2.2.1 釀造曲種對黑糯米酒有機酸和氨基酸的影響

有機酸作為酒中重要的香氣物質(zhì)之一，不僅可以豐富酒的口感及香氣，同時可以抑制雜菌的生長[25-26]。本文對不同釀造曲種黑糯米酒中有機酸含量進(jìn)行了測定，如圖4所示，在3組黑糯米酒中，檸檬酸、蘋果酸、乳酸和乙酸是黑糯米酒中主要的有機酸，與前期報道的糯米酒中有機酸的種類一致[26]。以麥曲釀造黑糯米酒中有機酸的總量為13.5 mg/L，可以檢測到5種有機酸，其中乳酸含量最高，占比達(dá)到63%；麥曲結(jié)合安琪酵母釀造的黑糯米酒中有機酸的總量為11.6 mg/L，乳酸占比也達(dá)到57%；以麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造的黑糯米酒有機酸總量為8.7 mg/L，而乳酸占比只有20%左右，適量的酸類物質(zhì)可以提高酒的整體協(xié)調(diào)性，酸過高會使酒的口感粗糙，且會壓制酯類物質(zhì)的香氣，酸過低不利于酒體呈香[27]。此外，麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造的黑糯米酒中，可以檢測到6種有機酸并且各種有機酸含量分布較為均勻，黑糯米酒的口感更為協(xié)調(diào)，同時蘋果酸的含量為2.5 mg/mL，顯著高于其他兩組（1.9 mg/L）（0.05），蘋果酸接近天然蘋果的酸味，具有味道柔和，滯留時間長等特點，賦予酒體特殊的香味[28]。麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造的黑糯米酒中可以檢測到琥珀酸，含量為1.1 mg/L，主要由蜂蜜接合酵母的三羧酸循環(huán)產(chǎn)生，琥珀酸能調(diào)和酒體，增加酒的醇厚感[29]。因此，蜂蜜接合酵母在發(fā)酵過程中可降低乳酸的過多積累，適宜濃度的乳酸在釀造過程中不僅能降低pH值促進(jìn)糖化，還可提高蘋果酸和琥珀酸含量，賦予酒體整體的協(xié)調(diào)性。

注：不同字母表示同類有機酸和氨基酸含量差異顯著（P<0.05）。

黑糯米酒含有人體所需的豐富營養(yǎng)成分，氨基酸是最重要的營養(yǎng)成分之一[6]，本研究針對不同曲種發(fā)酵制備的黑糯米酒中氨基酸含量進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4所示，在前酵階段添加酵母菌種的兩組黑糯米酒中氨基酸的總量分別為152 mg/L和113 mg/L，顯著高于未添加酵母的黑糯米酒中的氨基酸總量（57 mg/L）（<0.05），主要由于額外添加的酵母菌能夠分泌蛋白酶、肽酶等將酒醪中的蛋白質(zhì)進(jìn)一步降解為多種氨基酸，提高黑糯米酒中氨基酸的含量[30]。蘇偉等[31]利用超高效液相色譜-四級桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-QE-MS）法也在黑糯米酒中檢測到大量氨基酸，如亮氨酸、賴氨酸和甘氨酸等，提高了黑糯米酒的營養(yǎng)和風(fēng)味。以麥曲協(xié)同安琪酵母釀造的黑糯米酒中氨基酸種類最多，含7種氨基酸，且精氨酸、組氨酸和異亮氨酸等苦味氨基酸所占比重最大，精氨酸的濃度超過10 mg/L，精氨酸作為重要的苦味氨基酸[32]，大量存在酒體中會給酒帶來苦澀的味道；以麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造的黑糯米酒中有6種氨基酸，濃度適中，均勻協(xié)調(diào)，精氨酸的濃度大幅下降。由此可見，在黑糯米酒釀造過程中額外添加酵母，能不同程度豐富酒中氨基酸種類，提高氨基酸含量。

2.2.2 釀造曲種對黑糯米酒香氣成分的影響

本研究對黑糯米酒中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示。以麥曲釀造的黑糯米酒中檢測到29種香氣成分，其中醇類7種，占12.78%，酯類3種，占4.94%，醛類4種，占29.23%，酮類8種，占13.44%，揮發(fā)性酸類4種，占14.36%，酚類2種，占5.72%。蘇偉等[33]利用電子舌結(jié)合GC/MS分析黑糯米酒中的風(fēng)味物質(zhì)，共檢測到50種香氣成分，其中醇類8種，酯類11種，醛類4種，烷烴類20種，酮類1種，酸類2種，酚類3種，與本研究的風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果差異較大，尤其是在烷烴類、醛類以及酯類方面，主要由于使用的種曲以及工藝不同導(dǎo)致的，該研究還發(fā)現(xiàn)黑糯米酒中主要風(fēng)味物質(zhì)為2,3-丁二醇、1,3-丁二醇、丙三醇、苯乙醇，而這些風(fēng)味物質(zhì)在本研究中都檢測到，這些醇類的風(fēng)味物質(zhì)是黑糯米酒共性的風(fēng)味物質(zhì)。以麥曲協(xié)同安琪酵母釀造的黑糯米酒中檢測到30種香氣成分，其中醇類6種，占12.20%，酯類4種，占4.71%，醛類5種，占32.96%，酮類7種，占15.29%，酸類3種，占6.3%，酚類2種，占4.35%；以麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造的黑糯米酒中檢測到31種香氣成分，醇類6種，占14.51%，酯類3種，占4.33%，醛類5種，占34.91%，酮類8種，占17.18%，酸類5種，7.67%，酚類2種，占4.64%。相對麥曲釀造的黑糯米酒中揮發(fā)性有機酸的含量（14.36%），添加酵母菌種的兩組揮發(fā)性有機酸的含量明顯減少，分別為6.30%和6.19%，與前面有機酸含量測定結(jié)果基本一致。在不同曲種釀造的黑糯米酒中，醛類物質(zhì)的相對含量高于醇類、酯類和酮類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，占比在30%左右，其中以麥曲協(xié)同安琪酵母和麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造黑糯米酒中的糠醛相對含量分別9.11%和10.00%，約為以麥曲釀造黑糯米酒的2倍。研究表明糠醛在醬香型白酒中含量最高，并且醬香、糊香、焦香和曲香與糠醛具有較好的相關(guān)性[34]。綜上所述，麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造的黑糯米酒在有機酸、氨基酸和揮發(fā)性香氣成分方面比麥曲協(xié)同安琪酵母釀造的黑糯米酒更有優(yōu)勢，后續(xù)將以麥曲和蜂蜜接合酵母組合作為釀造曲種，探究后發(fā)酵時間和溫度對黑糯米酒中有機酸、氨基酸以及風(fēng)味成分的影響。

表1 不同曲種釀造的黑糯米酒中香氣成分

注：-表示未檢出。小寫字母表示同一物質(zhì)不同處理間差異顯著（0.05）。

Note: “-” means the aroma ingredients was undetected. The lowercase letters indicate the significant difference between different groups (0.05).

2.3 后發(fā)酵對黑糯米酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

2.3.1 后發(fā)酵時間對黑糯米酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

后發(fā)酵對酒的風(fēng)味及口感起到重要作用，在這個過程中微生物的代謝活動仍在進(jìn)行[35]，發(fā)酵時間對酒體中有機酸、氨基酸以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有重要的影響。本研究對不同后發(fā)酵時間黑糯米酒中有機酸、氨基酸及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量進(jìn)行測定，如圖5所示。在后發(fā)酵過程中，黑糯米酒的有機酸總酸質(zhì)量濃度從初始的9.2 mg/L增加到第30天的20.8 mg/L，后酵期間是有機酸積累的重要階段，有利于風(fēng)味的形成。在測定的有機酸中，琥珀酸在后酵階段含量變化明顯，從開始的1.6 mg/L增加到30天的15.7 mg/L，在第40天降到了4.1 mg/L，而琥珀酸并未在麥曲以及麥曲協(xié)同安琪酵母釀造的黑糯米酒檢測到，同時在已報道的黑糯米酒中也未發(fā)現(xiàn)琥珀酸大量的存在[5,6,17]，因此琥珀酸可能主要由蜂蜜接合酵母代謝產(chǎn)生。此外，在后酵期間，乳酸含量的變化也較為顯著，從初始的1.8 mg/L增加到40 d的8.0 mg/L（0.05），有研究報道發(fā)現(xiàn)，麥曲中還有大量的乳桿菌屬，是米酒釀造過程中的優(yōu)勢菌群之一[36]，在后酵階段，該菌屬會代謝產(chǎn)生大量的乳酸并不斷積累，對黑糯米酒的風(fēng)味形成起了重要的作用。后酵期間有機酸的組成以琥珀酸為主，然后乳酸、乙酸和蘋果酸不斷積累，琥珀酸迅速減少，到40 d后變?yōu)槎喾N有機酸協(xié)調(diào)存在，使黑糯米酒的口感更加協(xié)調(diào)。

在后發(fā)酵0～20 d時，黑糯米酒中的氨基酸種類由6種增加到14種，同時總含量由初始的79 mg/L迅速增加到30 d的1 024 mg/L（0.05），含量增加較為顯著的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸（<0.05），如圖5b所示，主要由于后酵前期微生物菌群分泌大量蛋白酶類，醪液中蛋白質(zhì)被水解為氨基酸[30]。在后發(fā)酵20～50 d黑糯米酒中各種氨基酸的種類基本保持不變，但是到后發(fā)酵第40天時，黑糯米酒中各種氨基酸總含量顯著降低，甜味氨基酸和苦味氨基酸含量都在明顯降低（<0.05），其中呈苦味精氨酸未被檢測到，主要由于后酵后期微生物菌群在不斷進(jìn)行新陳代謝，大量氨基酸被消耗掉。研究人員也發(fā)現(xiàn)不同后發(fā)酵時間黑糯米酒中氨基酸的含量存在顯著的差異，如半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代和異亮氨酸等[37]。

由圖5c可知，黑糯米酒在后發(fā)酵期間，醛類物質(zhì)是黑糯米酒中揮發(fā)性成分相對含量最高的，它們的相對含量在后酵第40天達(dá)到最大值55.8%，此外，醇類的相對含量由后發(fā)酵初始值14.1%增加到第40天的22.5%，同時酯類物質(zhì)也由4.3%增加到7.4%，這三種主要的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量達(dá)到85.7%。而酮類、酸類和酚類物質(zhì)則變化不明顯（>0.05）。因此，后發(fā)酵時間為40 d更有利于酒中醇類、酯類、醛類等風(fēng)味成分的積累。從有機酸、氨基酸和揮發(fā)性香味物質(zhì)綜合評價，后酵40 d更有利于黑糯米酒風(fēng)味物質(zhì)的形成。

2.3.2 后發(fā)酵溫度對黑糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)的影響

本研究對不同發(fā)酵溫度下黑糯米酒中有機酸、氨基酸及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量進(jìn)行測定，如圖6所示。隨著后發(fā)酵溫度的升高，黑糯米酒中有機酸總含量逐漸增加，從20℃下的9.8 mg/L提高到24℃的17.8 mg/L，而從24℃到28 ℃，有機酸總量增加不明顯（>0.05）。在測定的5種有機酸中，乳酸和琥珀酸含量明顯升高（<0.05），而檸檬酸隨著后發(fā)酵溫度的升高含量逐漸降低，由1.1 mg/L降低到0.3 mg/L，降低后發(fā)酵溫度有助于適當(dāng)提高酒體中檸檬酸的含量，檸檬酸是微生物的三羧酸（Tricarboxylic Acid Cycle，TCA）循環(huán)中間產(chǎn)物，且會被黑糯米酒發(fā)酵過程中的微生物利用進(jìn)入TCA循環(huán)并轉(zhuǎn)化，因此檸檬酸含量相對較低。相比其他溫度，28 ℃更有利于霉菌、酵母和細(xì)菌的生長，代謝速率加快，TCA循環(huán)加快，檸檬酸含量降低明顯。

注：發(fā)酵溫度為24 ℃，不同字母表示有機酸、氨基酸和風(fēng)味成分含量差異顯著（P<0.05）。

注：后發(fā)酵時間為40 d。不同字母表示有機酸、氨基酸和風(fēng)味成分含量差異顯著（P<0.05）。

由圖6b可知，后發(fā)酵溫度為20 ℃，黑糯米酒的氨基酸含量相對較低，總量為229 mg/L，只檢測到8種氨基酸；在24 ℃的環(huán)境中氨基酸總含量增加顯著（<0.05），總量達(dá)到了383 mg/L，且氨基酸種類增加了5種，分別是蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸，達(dá)到13種；在28 ℃的溫度下，氨基酸總量和種類與24 ℃對比而言相對穩(wěn)定。研究表明，酵母自溶可釋放出蛋白酶A、多肽及氨基酸，分解醪液中的蛋白質(zhì)，使得醪液中的氨基酸含量上升[38]，溫度對酵母自溶速度有很大的影響，溫度越高，酵母自溶速度加快[31]。因此，后發(fā)酵溫度過低不利于酒中氨基酸的產(chǎn)生與積累。

后發(fā)酵過程中，適當(dāng)?shù)牡蜏貤l件有利于促進(jìn)酒液中的有機酸與醇繼續(xù)發(fā)生酯化反應(yīng)生成乙酸乙酯、乳酸乙酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯和己酸乙酯等各種酯類，對豐富酒體品質(zhì)有重要的作用[31]。由圖6d可知，當(dāng)后發(fā)酵溫度由20 ℃升溫至28 ℃，黑糯米酒中醇類、酯類、醛類、酮類與酚類物質(zhì)所占比例均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在24 ℃時這5種香氣成分所占比例均達(dá)到最高。因此，后發(fā)酵溫度為24 ℃時有利于酒中醇類、酯類、醛類、酮類、酚類物質(zhì)的積累。

3 結(jié) 論

本研究分別以麥曲、麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母以及麥曲協(xié)同安琪酵母3種曲種組合方式釀造黑糯米酒，分析不同曲種組合對酒中風(fēng)味物質(zhì)的影響，研究了不同后發(fā)酵時間和后發(fā)酵溫度對以麥曲協(xié)同蜂蜜接合酵母釀造的黑糯米酒品質(zhì)的影響。得到以下結(jié)論：

1）蜂蜜接合酵母組合在發(fā)酵過程中可維持有機酸的均衡，賦予酒體整體的協(xié)調(diào)性，可以提高酒體中氨基酸含量，避免苦味氨基酸的過量積累，促使糠醛的產(chǎn)生，提高黑糯米酒的醬香和曲香。

2）蜂蜜接合酵母組合后發(fā)酵30 d的酒體中有機酸以琥珀酸為主，后酵40 d酒體多種有機酸協(xié)調(diào)存在，氨基酸含量在40 d后含量維持相對穩(wěn)定并有利于酒中醇類、酯類、醛類等風(fēng)味成分的積累。后酵40 d更有利于黑糯米酒風(fēng)味物質(zhì)的形成。

3）蜂蜜接合酵母組合后發(fā)酵20 ℃的酒體中氨基酸含量較低，檢測到8種氨基酸，在24 ℃下酒體中氨基酸總含量及種類顯著增加（<0.05），同時黑糯米酒中醇類、酯類、醛類、酮類與酚類物質(zhì)所占比例均達(dá)到最高。因此，24 ℃的后發(fā)酵溫度能夠促進(jìn)黑糯米酒中風(fēng)味物質(zhì)的形成。

綜上所述以蜂蜜接合酵母加麥曲作為釀造曲種，在24 ℃下后發(fā)酵40 d，有利于黑糯米酒風(fēng)味物質(zhì)的形成，但是風(fēng)味物質(zhì)形成與曲種之間關(guān)系尚不明確，同時由于蜂蜜結(jié)合酵母的產(chǎn)酒率不高，需要開展誘變育種相關(guān)的工作來提高該菌的產(chǎn)酒率。

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Effects ofand post-fermentation on the flavor of black glutinous rice wine

Fei Yongtao1,2, Jiang Hongjia1, Hu Fangzheng1, Peng Liying1, Liu Gongliang1,2※, Bai Weidong1,2, Xiao Gengsheng1

(1.,510225,; 2.,510225,)

Flavor of black glutinous rice wine depends significantly on starter cultures and the post-fermentation conditions. In this study, a systematic investigation was made to explore the effects of brewing koji (wheat koji, wheat koji+angie yeast and wheat koji+) and post-fermentation(time and temperature) on the flavor of black glutinous rice wine, where the amino acids, organic acids, and volatile aroma components were determined using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and high performance liquid chromatography (HPLC). Angie yeast andwere added to the wheat koji for co-fermentation. The lactic acid of black glutinous rice wine that prepared byand wheat koji accounted for 20% of the total organic acid, lower than that prepared by wheat koji and its combination with angie yeast（0.05）.was found to inhibit the excessive accumulation of lactic acid, while to increase content of malic acid (2.5 mg/mL) and succinic acid (1.1 mg/mL) （0.05）, bringing the overall compatible flavors to the black glutinous wine. Meanwhile, the content of amino acids was 113 mg/L in the black glutinous rice wine prepared bywith wheat koji, which was significantly higher than that prepared by wheat koji. In addition, it was found that aldehydes were the main volatile flavor substances in black glutinous rice wines that prepared by three different starter cultures. The relative contents of furfuraldehyde were 9.11 % and 10.00 % in black glutinous rice wine that prepared by angie yeast andstarters, respectively, twice as much as that prepared by wheat koji（0.05）. Therefore, the flavors of black glutinous rice wine that prepared bystarter group was better than that prepared by other two groups.combined with wheat koji was used to produce black glutinous rice wine, in order to further investigate the effects of post-fermentation time and temperature on the flavor of black glutinous rice wine. After 30 days of post-fermentation, the content of amino acids was highest with 1073 mg/mL in the wine, and the content decreased and kept stable at 40 days of fermentation. Meanwhile, it was found that the bitter amino acids in the wine rapidly decreased at 40 days of fermentation. Besides, the varieties and contents of organic acids in the wine were more coordinated, and the relative contents of alcohols, esters and aldehydes in the volatile aroma components were the highest (85.7%). Therefore, the flavor of black glutinous rice wine was best at 40 days of fermentation. When the post-fermentation temperature was 20 ℃, the content of amino acids was 229 mg/L with only 8 kinds of amino acids. At 24 ℃, the total content of amino acids reached 383 mg/L and the varieties of amino acids increased to 13. The relative content of esters and aldehydes reached the highest in the black glutinous rice wine at this temperature. The post-fermentation temperature of 24 ℃ was favorable for the accumulation of amino acids and main volatile flavor substances. Therefore, this finding can provide a sound reference to improve the flavor of black glutinous rice wine using

fermentation; flavor; temperature;; koji; black glutinous rice wine

費永濤，姜弘佳，胡方正，等. 蜂蜜接合酵母及后發(fā)酵對黑糯米酒風(fēng)味的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2020，36(24)：301-309.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.035 http://www.tcsae.org

Fei Yongtao, Jiang Hongjia, Hu Fangzheng, et al. Effects ofand post-fermentation on the flavor of black glutinous rice wine[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(24): 301-309. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.035 http://www.tcsae.org

2020-07-23

2020-10-20

廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃項目（2018B020206001）；2019年廣東省省級農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新及推廣項目（2019KJ01）；鄉(xiāng)村振興服務(wù)團(tuán)隊項目（KA200194310）

費永濤，副教授，研究方向為食品微生物學(xué)。Email：chsyt@126.com

劉功良，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為食品生物技術(shù)。Email：gongliangliu@126.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.035

Q93

A

1002-6819(2020)-24-0301-09