鹽分脅迫下腐植酸對(duì)棉花幼苗生長和抗氧化系統(tǒng)的影響

于曉東 郭新送 范仲卿 宋 摯 丁方軍 朱福軍 蘇秀榮，4?

1 農(nóng)業(yè)部腐植酸類肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 泰安 271000

2 山東省腐植酸高效利用示范工程技術(shù)研究中心 泰安 271000

3 山東農(nóng)大肥業(yè)科技有限公司 泰安 271000

4 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 泰安 271018

我國鹽漬土的分布范圍比較廣，約為3.6×107hm2，占全國可利用土地面積的41.9%。少量鹽分可促進(jìn)作物對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，促進(jìn)作物生長，但當(dāng)濃度過高時(shí)則對(duì)作物產(chǎn)生毒害作用[1，2]。濱海鹽漬化土壤鹽分含量一般超過0.2%（以全鹽含量計(jì)算），達(dá)到輕度鹽漬化及以上水平，對(duì)于棉花作物來講，鹽分含量超過0.4%就會(huì)嚴(yán)重制約生長。鹽脅迫下，植物體內(nèi)積累活性氧（ROS），導(dǎo)致細(xì)胞膜破環(huán)，但同時(shí)也會(huì)激活抗氧化酶的活性，以降低ROS 對(duì)細(xì)胞的氧化損傷[3，4]。研究表明，在鹽脅迫環(huán)境的影響下，施用腐植酸可促進(jìn)作物對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，尤其對(duì)種子萌芽、幼苗生長以及根系具有積極作用[5，6]。彭正萍等[7]也指出，腐植酸類物質(zhì)能對(duì)非生物脅迫表現(xiàn)出抗脅迫效應(yīng)，促進(jìn)鹽漬環(huán)境下作物的生長。García A C等[8]在水稻上的研究表明，鹽分脅迫下，腐植酸提高了抗氧化酶活性，加強(qiáng)了對(duì)氧自由基的清除，從而增強(qiáng)幼苗的抗氧化能力。另有研究表明，在鹽堿土培育的盆栽大豆上噴施腐植酸，降低了大豆葉片丙二醛（MDA）含量，有效提高了大豆抗鹽堿能力[9]。

本研究以濱海鹽漬化潮土為供試土壤，進(jìn)行棉花盆栽試驗(yàn)，對(duì)比不同腐植酸對(duì)棉花生長特性和抗氧化系統(tǒng)的影響，以期為腐植酸提高鹽漬土棉花抗性的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采自濱州沾化縣馮家鎮(zhèn)李家村（地理坐標(biāo)為東經(jīng)117°45′～118°21′，北緯37°34′～38°11′）0 ～40 cm 土層，土壤為濱海中度鹽漬化潮土，基本理化性狀如表1 所示。

表1 供試土壤基本理化性狀Tab.1 Basic physical and chemical properties of tested soil

1.2 供試作物

棉花，品種為“蘇雜6 號(hào)”，適宜鹽堿土栽培。

1.3 供試材料

試驗(yàn)用常規(guī)肥料為棉花專用復(fù)合肥（N-P2O5-K2O=20-10-15）。腐植酸原料為風(fēng)化煤腐植酸（未活化），產(chǎn)自新疆奇臺(tái)，含水量19%，水溶性腐植酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（干基）1.5%，總腐植酸含量為56%，游離腐植酸含量為50%。以上材料均由山東農(nóng)大肥業(yè)科技有限公司提供。

活化腐植酸的制備：稱取風(fēng)化煤100 g，置于液化反應(yīng)釜中，加入500 mL 水，加濃鹽酸10 mL，加熱至沸，冷卻至45 ℃以下，經(jīng)過濾、洗脫，保留沉淀。再向反應(yīng)釜中加入500 mL 水，并加入25 mL 氫氧化鈉溶液（氫氧化鈉濃度為20%），調(diào)至轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度60 ℃，恒溫加熱60 min，冷卻，靜置分層。將反應(yīng)釜中上清液取出，用1 ∶6 硫酸調(diào)節(jié)pH 至1.5 ～2，過濾后棄濾液，用去離子水洗滌濾渣至無SO42-為止。將濾渣烘干、粉碎即得活化腐植酸。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于山東省泰安肥城市山東農(nóng)大肥業(yè)科技有限公司蔬菜大棚內(nèi)進(jìn)行，共設(shè)置5 個(gè)處理，分別為常規(guī)施肥處理（CK），常規(guī)施肥+未活化腐植酸低量處理（T1），常規(guī)施肥+未活化腐植酸高量處理（T2），常規(guī)施肥+活化腐植酸處低量理（T3），常規(guī)施肥+活化腐植酸高量處理（T4），各處理詳見表2。首先將花盆底部用紗網(wǎng)覆蓋出水口并均勻鋪滿1 kg 細(xì)沙，再將稱好的土和肥料倒在編織袋內(nèi)，充分混合均勻，裝入花盆中，每盆裝土15 kg，所有的肥料均一次性基施。每個(gè)處理9 次重復(fù)，隨機(jī)排列。棉花直接種播，待兩片真葉后間苗定植，每盆留3 棵棉花幼苗，總共45 盆。定植后統(tǒng)一管理，分別在處理后25、35、45 天進(jìn) 行破壞性采樣，并進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

表2 試驗(yàn)方案Tab.2 Experimental scheme kg/hm2

1.5 測(cè)定項(xiàng)目及數(shù)據(jù)處理

收獲植株并將地上部和地下部分開，植株根系先用5 mmol/L CaCl2沖洗，再用蒸餾水沖洗干凈，稱鮮重；然后在110 ℃下殺青，80 ℃烘干至恒重，測(cè)干重。光合色素含量的測(cè)定：用95%的乙醇研磨棉花葉片，25 mL 定容后，分別在665、649 和470 nm 下測(cè)定吸光值[10]；超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定：采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[11]；過氧化物酶（POD）活性測(cè)定：采用愈創(chuàng)木酚法[11]；過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定：采用紫外吸收法[12]；MDA 含量測(cè)定：采用硫代巴比妥酸法[13]；超氧陰離子（O2?·）產(chǎn)生速率測(cè)定：采用羥氨氧化法[14]。

采用Excel 2003 軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)和繪表，采用DPS 7.05 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著極差法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果分析

2.1 腐植酸對(duì)棉花幼苗生長的影響

鹽分脅迫下，不同處理的棉花幼苗長勢(shì)差異顯著（表3）。施用腐植酸的棉花株高、葉片葉綠素相對(duì)含量（SPAD 值）均顯著高于常規(guī)施肥處理，活化腐植酸處理的棉花株高、SPAD 值顯著高于未活化腐植酸處理。活化腐植酸低量與高量處理對(duì)棉花株高、SPAD 值無顯著差異。未活化腐植酸低量與高量處理對(duì)株高無顯著差異，但高量處理SPAD值顯著高于低量處理。與對(duì)照相比，施用活性腐植酸能夠顯著增加莖粗，活性腐植酸高量處理下莖粗大于活性腐植酸低量處理，但差異不顯著。未活化腐植酸處理25 天時(shí)，與常規(guī)施肥比，莖粗無顯著差異，但高量處理莖粗最大；未活化腐植酸處理35 天和45 天時(shí)，與常規(guī)施肥比，莖粗差異顯著，高量處理莖粗大于低量處理，但兩者差異不顯著。

表3 不同處理的棉花幼苗株高、莖粗和葉片SPADTab.3 Cotton seedling’s plant height, stem and leaf SPAD under different treatments

2.2 腐植酸對(duì)棉花幼苗生物量的影響

棉花幼苗生長45 天后，測(cè)得植株生物量如表4 所示。與常規(guī)施肥相比，未活化與活化腐植酸均顯著提高了棉花幼苗地上部和地下部干、鮮重，且干、鮮重的變化趨勢(shì)相同。未活化與活化腐植酸在高量處理下地上部干鮮重均顯著高于低量處理，而地下部干鮮重在活化與未活化處理間差異不顯著。腐植酸用量相同情況下，活化腐植酸處理的棉花地上部與地下部生物量均顯著高于未活化腐植酸處理，低量處理下，活化腐植酸處理的棉花地上部和地下部鮮干重分別提高了50.50%、63.20%、5.10%和12.09%；高量處理下，活化腐植酸處理的棉花地上部和地下部鮮干重分別提高了17.76%、18.26%、7.28%和11.96%。表明活化腐植酸更有利于促進(jìn)幼苗期棉花生物量的累積，進(jìn)而為后期生殖生長提供充足的保障。

表4 不同處理的棉花幼苗生物量Tab.4 Cotton seedling’s biomass under different treatments 克/盆

2.3 腐植酸對(duì)棉花葉片內(nèi)光合色素含量的影響

不同處理的棉花葉片內(nèi)光合色素含量見表5，與常規(guī)施肥相比，施用未活化和活化腐植酸均顯著提高了棉花葉片內(nèi)葉綠素a 和葉綠素b 含量以及a/b，對(duì)類胡蘿卜素含量的影響不顯著。低量處理下，活化腐植酸較未活化腐植酸的綠素a 和葉綠素b 分別提高了5.37%、8.16%；高量處理下，活化腐植酸較未活化腐植酸的葉綠素a 和葉綠素b 分別提高了11.8%、14.01%，表明活化腐植酸對(duì)棉花葉片光合色素的提高能力優(yōu)于未活化腐植酸。未活化腐植酸高量與低量處理間的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量差異均不顯著；活化腐植酸高量處理的葉綠素a 含量顯著高于活化腐植酸低量處理，葉綠素b 和類胡蘿卜素含量差異不顯著。

表5 不同處理的棉花葉片內(nèi)光合色素含量Tab.5 Content of photosynthetic pigment in cotton leaves under different treatments

2.4 腐植酸對(duì)棉花葉片和根系內(nèi)抗氧化酶活性的 影響

不同處理對(duì)棉花葉片和根系內(nèi)抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性影響差異較大（圖1），各處理的葉片內(nèi)SOD 和CAT 活性高于根系，而POD 活性與之恰恰相反。與常規(guī)施肥相比，施用未活化與活化腐植酸均顯著提高了棉花葉片內(nèi)SOD、CAT 和POD 活性；活化腐植酸低量與高量處理的棉花根系內(nèi)SOD、CAT 和POD 活性均顯著高于常規(guī)施肥處理，而未活化腐植酸低量處理的棉花根系內(nèi)SOD、CAT 和POD 活性與常規(guī)施肥處理差異表現(xiàn)不顯著。

圖1 不同處理的棉花葉片和根系內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性Fig.1 Activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) in cotton leaves and roots under different treatments

未活化腐植酸與活化的腐植酸對(duì)棉花葉片和根系內(nèi)抗氧化酶活性影響差異較大。與未活化腐植酸處理相比，活化腐植酸處理顯著提高了棉花葉片和根系內(nèi)SOD 活性，且活化腐植酸對(duì)根系SOD 活性的提高能力較葉片明顯。低量處理下，活化腐植酸處理的棉花葉片和根系內(nèi)SOD 活性較未活化腐植酸處理分別提高了3.41%和37.58%；高量處理下，活化腐植酸處理的棉花葉片和根系內(nèi)SOD 活性分別提高了4.14% 和19.56%。未活化與活化腐植酸處理的棉花葉片和根系內(nèi)POD 活性變化趨勢(shì)與SOD 相似，低量處理下，活化腐植酸處理的棉花葉片和根系內(nèi)POD 活性分別提高了44.43%和3.29%，而增加活化腐植酸用量的棉花葉片和根系內(nèi)POD 活性有所下降，但差異不顯著。未活化與活化腐植酸處理的棉花葉片CAT 活性無顯著差異，而與未活化腐植相比，活化腐植酸顯著提高了棉花根系內(nèi)CAT 活性，提高幅度分別達(dá)到98.46%（腐植酸低用量）和63.96%（腐植酸高用量）。

2.5 腐植酸對(duì)棉花葉片和根系內(nèi)過氧化物含量的影響

植物在生長過程中遭受逆境脅迫時(shí)體內(nèi)代謝平衡發(fā)生紊亂，導(dǎo)致體內(nèi)積累大量有害過氧化物質(zhì)（MDA、·等），致使氧化還原平衡受損。鹽分脅迫下，未活化與活化腐植酸均顯著降低了棉花葉片和根系內(nèi)MDA 含量和產(chǎn)生速率，但降低能力與腐植酸的種類和用量有關(guān)（圖2）。低量處理下，未活化與活化腐植酸處理間的棉花葉片MDA 含量無顯著差異，而高量處理下，活化腐植酸較未活化腐植酸棉花葉片MDA 含量降低了47.18%，差異顯著。在棉花根系中，低用量的活化腐植酸處理，MDA 含量顯著低于未活化腐植酸處理，降低幅度達(dá)到20.12%，而高用量的活化腐植酸與未活化腐植酸處理間無顯著差異。

圖2 不同處理的棉花葉片和根系內(nèi)MDA 含量和產(chǎn)生速率Fig.2 Content of malondialdehyde (MDA) and superoxide anion production rate in cotton leaves and roots under different treatments

3 討論

3.1 鹽分脅迫下腐植酸對(duì)棉花生長特性的影響

在鹽脅迫環(huán)境下，施用腐植酸可促進(jìn)作物對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，從而促進(jìn)作物生長[5]。本試驗(yàn)研究表明，在鹽分脅迫下，未活化與活化腐植酸均可顯著提高棉花幼苗株高、莖粗、SPAD 值，提高棉花幼苗地上部和地下部干、鮮重。腐植酸用量相同情況下，活化腐植酸處理的棉花株高、莖粗、SPAD值及地上部與地下部生物量均顯著高于未活化腐植酸處理，表明活化腐植酸更有利于促進(jìn)幼苗期棉花生長發(fā)育，促進(jìn)生物量的累積，進(jìn)而為后期生殖生長提供充足的保障。腐植酸對(duì)植物生長的促進(jìn)作用，來源于其對(duì)根系生長的刺激作用。這是由于腐植酸含有細(xì)胞激肽酶等有機(jī)生物激素，能夠促進(jìn)蛋白合成和細(xì)胞的生長[15～18]，從而促進(jìn)根系生長，促進(jìn)根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而促進(jìn)植物生長發(fā)育。

腐植酸可促進(jìn)棉花葉片葉綠素的形成，并能防止葉片早衰[6]。通常，鹽分脅迫下植物葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量下降，并隨著脅迫時(shí)間的延長，葉片會(huì)失綠[19]。Marosz A[20]研究表明，鹽分脅迫條件下，施用腐植酸能降低土壤介質(zhì)的電導(dǎo)率，促進(jìn)作物幼苗的生長，提高其葉綠素含量。本研究中施用未活化和活化腐植酸顯著提高了棉花葉片葉綠素含量，而對(duì)類胡蘿卜素含量的影響不顯著。等用量腐植酸情況下，活化腐植酸較未活化腐植酸的葉綠素a 含量提高，高用量情況下差異顯著，而低用量情況下，無顯著差異；等用量腐植酸情況下，活化腐植酸較未活化腐植酸的葉綠素b 含量高，但無顯著差異。表明活化腐植酸對(duì)棉花葉片光合色素的提高能力優(yōu)于未活化腐植酸。高用量腐植酸對(duì)棉花葉片葉綠素b 和類胡蘿卜素含量影響差異不大，說明腐植酸添加量并非越多越好，而是有一個(gè)適宜的濃度，這與Yigit F 等[21]的研究結(jié)果一致。

3.2 鹽分脅迫下腐植酸對(duì)棉花抗氧化系統(tǒng)的影響

韓冰等[22]研究表明，鹽脅迫下，葉片POD活性升高，CAT 和SOD 活性降低。腐植酸會(huì)通過刺激植物各器官中蛋白質(zhì)和酶的合成，增強(qiáng)植物體內(nèi)POD、CAT、SOD 等與活性氧代謝相關(guān)的酶活性[23]。本研究中，活化腐植酸處理的棉花葉片和根系內(nèi)SOD 和POD 活性較未活化腐植酸處理有不同程度的提高；而活化與未活化腐植酸處理的棉花葉片CAT 活性無顯著性差異，但活化腐植酸顯著提高了棉花根系內(nèi)CAT 活性，提高幅度達(dá)到63.96%～98.46%。這可能是腐植酸經(jīng)過活化處理后小分子量組分增多，一些類似羧基、羰基、甲氧基等含氧官能團(tuán)增多，這些小分子量組分是腐植酸中最具活性的部分，更容易被植物所吸收。郭偉等[24]研究指出腐植酸可降低植物體內(nèi)MAD含量，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的活性氧含量，本研究中未活化與活化腐植酸均顯著降低了棉花葉片和根系內(nèi)MDA 含量和產(chǎn)生速率，與前人研究結(jié)果一致。這說明腐植酸可以通過提高棉花體內(nèi)抗氧化酶的活性來促進(jìn)過氧化物的分解，降低植物體內(nèi)過氧化物的累積量，減輕膜質(zhì)氧化損傷，最終提高植物抗逆境脅迫能力。

4 結(jié)論

（1）鹽分脅迫下，施用腐植酸顯著提高了棉花幼苗的生物量，且活化腐植酸更有利于促進(jìn)幼苗期棉花生物量累積，較未活化腐植酸處理的棉花生物量提高了7.28%～63.20%。

（2）鹽分脅迫下，施用腐植酸顯著提高了棉花葉片葉綠素含量，活化腐植酸對(duì)棉花葉片光合色素的提高能力優(yōu)于未活化腐植酸，等腐植酸用量的情況下，活化腐植酸較未活化腐植酸處理，棉花葉片葉綠素含量提高了5.37%～14.01%。

（3）鹽分脅迫下，施用腐植酸可通過提高棉花體內(nèi)抗氧化酶的活性來促進(jìn)過氧化物的分解，降低植物體內(nèi)過氧化物的累積量，從而提高棉花對(duì)鹽分的抗逆能力，其中活化腐植酸對(duì)提高棉花抗鹽脅迫的效果優(yōu)于未活化腐植酸。