骨肉瘤的免疫檢查點(diǎn)及其抑制劑應(yīng)用的研究進(jìn)展

趙迎春 馮 娥 田云云

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨科，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：kh_zyc@163.com)

【提要】 骨肉瘤是骨骼最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，目前治療骨肉瘤的方法可用于約70%的患者，然而轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者的生存率在過去30年中基本沒有改變，亟須尋找新的治療方法。腫瘤免疫治療主要通過增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫功能來抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞，在各種腫瘤中已經(jīng)顯示出良好的臨床結(jié)果，有望成為治療骨肉瘤的新策略。本文對骨肉瘤中的免疫檢查點(diǎn)及其抑制劑的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為骨肉瘤的防治研究提供思路。

骨肉瘤是骨骼最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于四肢長骨干骺端，具有易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移、病情進(jìn)展快、預(yù)后差的特點(diǎn)[1]。在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率約為百萬分之三，易感人群為兒童和青少年[2]。目前，骨肉瘤的治療方法包括外科保肢手術(shù)治療、新輔助化療、靶向治療和免疫治療等，盡管這些治療手段能夠治療約70%的骨肉瘤患者[3]，但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者的生存率在過去30年中基本沒有改變，這使得骨肉瘤治療效果仍處于瓶頸期，亟須尋找新的治療方法[4]。近年來，腫瘤免疫治療備受學(xué)者們的關(guān)注。病理狀態(tài)下，癌細(xì)胞能夠發(fā)生免疫逃逸[5]。而腫瘤免疫治療主要通過增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫功能，抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞。目前，腫瘤免疫治療在多種腫瘤中顯示出良好的臨床效果，包括黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌和頭頸癌[6]，然而針對骨肉瘤的研究尚少見。本文對骨肉瘤中的免疫檢查點(diǎn)及其抑制劑應(yīng)用于骨肉瘤治療的研究進(jìn)展綜述如下。

1 骨肉瘤中的免疫檢查點(diǎn)

1.1 程序性死亡受體-1/程序性死亡配體-1 目前已有許多學(xué)者檢測了骨肉瘤細(xì)胞系和骨肉瘤組織中程序性死亡配體1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)的表達(dá)量，結(jié)果顯示雖然在骨肉瘤細(xì)胞系中的PD-L1表達(dá)量高低不一，但與親代細(xì)胞系相比，PD-L1表達(dá)量越高則骨肉瘤耐藥性越強(qiáng)[7-8]?；诖耍瑢W(xué)者們針對PD-L1開展了許多生物學(xué)研究，包括利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)靶向骨肉瘤細(xì)胞系中PD-L1基因的研究，結(jié)果表明PD-L1可調(diào)控骨肉瘤的生長及其對多比柔星和紫杉醇的耐藥性[9-10]。研究顯示，23.7%的人類骨肉瘤組織高表達(dá)PD-L1，50%的人類骨肉瘤組織表現(xiàn)出中等表達(dá)，并且PD-L1的表達(dá)量與轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞相關(guān)[11]。一項(xiàng)Meta分析也表明，骨肉瘤組織中PD-L1表達(dá)量比其他肉瘤組織高14%～75%，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移、患者病死率、不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。這說明PD-L1高表達(dá)可能是骨肉瘤患者的預(yù)后不良因素。

利用抗程序性死亡受體1(programmed cell death 1,PD-1)和抗PD-L1阻斷療法治療骨肉瘤小鼠模型顯示出良好的治療效果，相較于對照組(采用生理鹽水注射)而言，經(jīng)抗PD-1抗體處理的骨肉瘤人源小鼠模型更不容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[13]。采用由抗PD-1、抗PD-L1和抗腫瘤壞死因子受體超家族成員4(CD134)組成的三聯(lián)抗體治療的移植骨肉瘤小鼠，生存時(shí)間顯著延長，并且CT掃描和組織學(xué)隨訪結(jié)果顯示50%小鼠未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[7]。以上研究結(jié)果提示抗PD-1和抗PD-L1阻斷療法治療骨肉瘤具有顯著的效果，這給晚期骨肉瘤患者帶來了希望。

1.2 細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4 細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)，即CD125，是在T淋巴細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)受體，在T細(xì)胞活化期起著關(guān)鍵作用。正常情況下，為了減輕過度活化免疫應(yīng)答，當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類或Ⅱ類抗原呈遞給T細(xì)胞受體時(shí)，T細(xì)胞開始活化，并以CD28[T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)結(jié)合]形式的共刺激信號擴(kuò)增[14]。T細(xì)胞活化以后，CTLA-4可能從細(xì)胞內(nèi)區(qū)域轉(zhuǎn)運(yùn)到T細(xì)胞表面，以比CD28更大的親和力結(jié)合B7-1和B7-2，進(jìn)而下調(diào)免疫應(yīng)答，達(dá)到外周免疫耐受[15-16]。

CTLA-4抑制信號非常復(fù)雜，它們還可以抑制T細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞介素-2轉(zhuǎn)錄、抑制含有Src同源結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸酶表達(dá)，以及抑制B7-1和B7-2的反式內(nèi)吞作用[15]。CTLA-4也在調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞上表達(dá)，控制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的功能并促進(jìn)免疫耐受。研究表明，阻斷CTLA-4受體會增加CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的活化并減弱T淋巴細(xì)胞活性[16]。Leach等[17]的研究表明，在結(jié)腸癌或纖維肉瘤的小鼠模型中，抗CTLA-4抗體與腫瘤溶解物負(fù)載的樹突狀細(xì)胞相結(jié)合，可增強(qiáng)CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的活化并降低T淋巴細(xì)胞表達(dá)，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和延長小鼠存活時(shí)間。目前為止，抗CTLA-4阻斷療法已成功用于治療晚期黑色素瘤和其他腫瘤，如非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌和前列腺癌[6]。另外有研究顯示，人單克隆IgG1抗CTLA-4抗體(也稱為伊匹單抗)能夠顯著延長轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的中位總生存期[18]?；诖送黄菩缘难芯拷Y(jié)果，學(xué)者們正在探索CTLA-4對其他實(shí)體瘤的潛在作用，包括骨肉瘤。一項(xiàng)使用伊匹單抗治療兒童晚期實(shí)體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明，33例患兒中有6例病情進(jìn)展穩(wěn)定，其中8例骨肉瘤患兒中有2例發(fā)生免疫相關(guān)不良事件，但其預(yù)后尚可；然而，發(fā)生免疫相關(guān)不良事件的患兒其總生存期長于沒有發(fā)生免疫相關(guān)不良事件的患兒[19]。

1.3 B7同源物3 B7同源物3(B7 homology 3，B7-H3)，即CD276，是B7-CD28家族的抑制蛋白，在抑制T細(xì)胞活化、增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子中起重要作用。B7-H3在其他免疫細(xì)胞中也有表達(dá)，包括抗原提呈細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。多種腫瘤均存在B7-H3過表達(dá)現(xiàn)象，如黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤和橫紋肌肉瘤[20-21]。有學(xué)者報(bào)告[22]，91.8%的骨肉瘤組織中表達(dá)B7-H3，其表達(dá)量顯著高于鄰近的健康組織、骨軟骨瘤和纖維異常增生組織；另外，B7-H3表達(dá)水平與浸潤腫瘤的淋巴細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞侵襲，且高表達(dá)B7-H3的骨肉瘤患者存活和復(fù)發(fā)時(shí)間短于低表達(dá)的患者。

鑒于以上研究成果，目前開展了許多針對抗B7-H3抗體功效的研究。Enoblituzumab是一種人源IgG1單克隆拮抗劑B7-H3抗體，已被用于治療B7-H3表達(dá)陽性的難治性腫瘤患者，如黑色素瘤和晚期實(shí)體腫瘤，結(jié)果顯示患者病情穩(wěn)定(至少12周)且2%～69%的腫瘤體積縮小，具有良好的耐受性且沒有劑量依賴性毒性[22]。MGD-009是一種人源雙重親和力和重新靶向蛋白，可與T細(xì)胞上的CD3及其靶細(xì)胞上的B7-H3結(jié)合，其已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，該藥主要針對間皮瘤、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌或軟組織肉瘤患者[7]。

1.4 自然殺傷細(xì)胞激活受體組2成員D及其相關(guān)配體 自然殺傷細(xì)胞激活受體組2成員D(natural killer cell group 2 member D，NKG2D)及其配體(natural killer cell group 2 member D ligand，NKG2DL)在先天免疫中起關(guān)鍵作用。從功能上講，NKG2D是屬于CD94/NKG2家族的共刺激跨膜蛋白受體，存在于CD8+T淋巴細(xì)胞、γδ T細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞中。NKG2DL主要在感染和惡性轉(zhuǎn)化情況下表達(dá)上調(diào)，很少在正常細(xì)胞中表達(dá)。在細(xì)胞水平上，NKG2D/NKG2DL的結(jié)合，通過磷脂酰肌醇-3激酶和生長因子受體結(jié)合蛋白2-鳥嘌呤核苷酸交換因子1途徑，觸發(fā)自然殺傷細(xì)胞活化，導(dǎo)致細(xì)胞毒性顆粒釋放，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，屬于一種保護(hù)機(jī)制，而晚期癌細(xì)胞可以通過下調(diào)或脫落NKG2DL來逃避免疫監(jiān)視[24]。NKG2DL表達(dá)、其下游通路和自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性有望成為癌癥研究的新領(lǐng)域。

研究顯示，在22個骨肉瘤細(xì)胞系中，NKG2DL呈中等至高水平表達(dá)，其中14個原發(fā)性骨肉瘤細(xì)胞系都對由自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的NKG2D/NKG2DL相互作用誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感，然而NKG2DL的高表達(dá)與敏感性增加無相關(guān)性；該研究還表明，螺內(nèi)酯可上調(diào)原發(fā)性骨肉瘤細(xì)胞系中NKG2DL的表達(dá)，并顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的NKG2D/NKG2DL相互作用誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的敏感性[25]。另一項(xiàng)研究顯示，NKG2D-嵌合抗原受體陽性(chimeric antigen receptor positive，CAR+)T淋巴細(xì)胞在體外和小鼠骨肉瘤中對骨肉瘤細(xì)胞系的細(xì)胞溶解活性顯著增加，同時(shí)保留了健康細(xì)胞[26]。此外，有研究顯示，采用γδT細(xì)胞免疫治療結(jié)合DNA去甲基化藥物地西他濱治療骨肉瘤的效果良好，因?yàn)榈匚魉麨I增強(qiáng)了骨肉瘤細(xì)胞中NKG2DL表達(dá)，從而增強(qiáng)了骨肉瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒性γδT細(xì)胞的易感性[27]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，14種不同的骨尤文肉瘤細(xì)胞系廣泛表達(dá)NKG2DL，使用慢病毒將CD3ζ/CD28衍生的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與NKG2D融合后，可以產(chǎn)生能夠引起骨尤文肉瘤細(xì)胞死亡的NKG2D-CAR+T淋巴細(xì)胞[28]。

1.5 人類白細(xì)胞抗原G 人類白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen G，HLA-G)在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中具有重要作用。 HLA-G對自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫應(yīng)答具有抑制作用，并且在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和各種癌癥細(xì)胞中均有表達(dá)。研究顯示，在34.0%的骨尤文肉瘤活組織中檢測到HLA-G的表達(dá)，雖然HLA-G的表達(dá)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞增加密切相關(guān)，但與其他臨床參數(shù)無關(guān)[29]。因此，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的HLA-G表達(dá)可能會減弱腫瘤細(xì)胞對自然殺傷細(xì)胞的抵抗力，從而提高骨尤文肉瘤免疫治療的效果。

2 骨肉瘤中的聯(lián)合免疫治療

2.1 PD-1和CTLA-4聯(lián)合阻滯療法 免疫檢查點(diǎn)阻滯免疫療法的理想效果是對當(dāng)前治療方法無反應(yīng)的患者實(shí)現(xiàn)長期疾病控制，而聯(lián)合阻滯治療是針對機(jī)體在可耐受的毒性作用下提高療效的一種新治療方案。Postow等[30]聯(lián)合應(yīng)用伊匹單抗和納武單抗治療142例未接受治療的黑色素瘤晚期患者，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的總體有效率為61%，而單獨(dú)使用伊匹單抗組的總體有效率為11%，其中兩組的完全反應(yīng)比例為0.22 ∶0?；诖嗽囼?yàn)結(jié)果，美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了這兩種藥物聯(lián)合治療晚期黑色素瘤，并促進(jìn)了該療法用于治療其他腫瘤的研究，例如骨肉瘤。

有學(xué)者使用抗PD-L1與抗CTLA-4抗體聯(lián)合治療骨肉瘤小鼠，結(jié)果顯示所有小鼠未發(fā)生骨肉瘤轉(zhuǎn)移，其中60%的小鼠長期無病存活，而接受抗PD-L1阻滯單藥治療的小鼠并沒有實(shí)現(xiàn)長期無病生存，這表明聯(lián)合阻滯療法具有明顯優(yōu)勢[31]。一項(xiàng)針對轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究顯示，單獨(dú)使用納武單抗組的確診反應(yīng)率為5%，伊匹單抗與納武單抗聯(lián)合治療組為16%；聯(lián)合治療組的中位無進(jìn)展生存期和總生存期分別為4.1個月和14.3個月，優(yōu)于單獨(dú)使用納武單抗組的1.7個月和10.7個月；單獨(dú)使用納武單抗組、聯(lián)合治療組中分別有19%、26%的患者發(fā)生了嚴(yán)重的免疫相關(guān)不良事件，但兩組均未發(fā)生與治療相關(guān)的死亡[7]。這項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)了聯(lián)合治療具有顯著療效且安全性可控。

2.2 免疫檢查點(diǎn)阻滯和放射治療聯(lián)合療法 目前放射治療被認(rèn)為是單純局部抑制腫瘤的經(jīng)典手段，單獨(dú)使用放射治療可以增強(qiáng)全身免疫反應(yīng)并減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，即“遠(yuǎn)隔效應(yīng)”。這種抗腫瘤免疫反應(yīng)很大程度上是由CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)以及免疫檢查點(diǎn)阻滯反應(yīng)增強(qiáng)所引起。因此，放射治療聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻滯療法或可更好地改善腫瘤患者的臨床結(jié)局，且已在骨肉瘤并發(fā)微轉(zhuǎn)移的患者中得到了證實(shí)[32-33]。

已有臨床試驗(yàn)正在積極研究免疫檢查點(diǎn)阻滯(特別是PD-1、PD-L1和CTLA-4)聯(lián)合放療治療各種腫瘤患者，例如晚期黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、肝癌、前列腺癌和淋巴瘤[34]。但是還沒有臨床試驗(yàn)顯示在未接受過治療的腫瘤患者中，免疫檢查點(diǎn)阻滯治療聯(lián)合放療優(yōu)于任一單純療法，并且這種聯(lián)合治療方案所招募的骨肉瘤志愿者很少。目前有一項(xiàng)正在進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)比較了納武單抗和定向放射聯(lián)合治療與單獨(dú)使用納武單抗治療晚期脊索瘤的效果，然而該試驗(yàn)仍處于研究階段，尚未公布任何結(jié)果。

2.3 免疫檢查點(diǎn)阻滯聯(lián)合靶向治療或化療療法 目前聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻滯治療、化療或靶向治療的研究已經(jīng)擴(kuò)展到軟組織肉瘤，然而這些聯(lián)合療法對于骨肉瘤的研究相對較少。一項(xiàng)回顧性研究顯示，納武單抗聯(lián)合帕唑帕尼(酪氨酸激酶血管內(nèi)皮生長因子抑制劑)治療28例軟組織肉瘤或骨肉瘤患者，其中包括4例骨肉瘤患者，在治療超過4個周期后，一半的患者臨床受益[35]。

3 展 望

免疫檢查點(diǎn)抑制劑因其在骨肉瘤治療中的潛在作用而引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，并且隨著臨床試驗(yàn)的開展，免疫檢查點(diǎn)抑制劑仍會成為長期的研究方向。目前，研究表明骨肉瘤患者中PD-1和PD-L1的表達(dá)水平差異較大，并且與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[36]。然而，根據(jù)PD-1和PD-L1的表達(dá)水平尚不能可靠地預(yù)測患者對治療的反應(yīng)。與單一免疫檢查點(diǎn)阻滯治療相比，聯(lián)合其他療法的免疫檢查點(diǎn)阻滯治療方案已顯示出優(yōu)越的臨床效果。因此有必要找到合適的聯(lián)合阻滯劑藥物，既保證免疫相關(guān)不良事件在骨肉瘤患者的可承受范圍內(nèi)，又具有最大的臨床效益，這將是未來的研究新領(lǐng)域。