綿羊冷凍精液稀釋液成分的研究進(jìn)展

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750000）

隨著我國(guó)農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)羊業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)一項(xiàng)重要的產(chǎn)業(yè)，但是我國(guó)綿羊品種良種化程度較低，生產(chǎn)力水平不夠，應(yīng)建立健全良種繁育體系，適應(yīng)現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的需要。我國(guó)自60年代以來(lái)，對(duì)綿羊冷凍精液的研究和應(yīng)用都取得了較大的進(jìn)步，綿羊的人工授精是我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)中常用的技術(shù)之一，利用人工授精可以擴(kuò)大優(yōu)良綿羊品種的利用率、減少引種費(fèi)用和飼喂種公羊的費(fèi)用，而且還可以提高母羊的受胎率。稀釋液成分對(duì)精子有良好的保護(hù)作用，可以防止低溫對(duì)精子的危害、具有提供緩沖物質(zhì)、供能、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)等作用。近年來(lái)，為了提高綿羊精液的冷凍品質(zhì)以及冷凍效果，許多研究者在稀釋液成分方面研究日益增多。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外綿羊精液稀釋液相關(guān)成分研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 抗凍保護(hù)劑

精液的冷凍是指精液保存在液氮（-196℃）或者干冰（-79℃）的超低溫條件下，使精子的代謝幾乎停止，處于休眠狀態(tài)。為了防止超低溫對(duì)精子的傷害，抗凍保護(hù)劑可以使精子在低溫冷凍時(shí)保護(hù)精子，延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間。抗凍保護(hù)劑根據(jù)細(xì)胞膜的通透性可分為高膜透過(guò)性和低膜透過(guò)性兩種類型。在沒(méi)有防凍劑的情況下，精子在凍融過(guò)程會(huì)發(fā)生精細(xì)胞脫水、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷、蛋白質(zhì)變性等危害，探索良好的抗凍保護(hù)劑非常重要。常見(jiàn)的抗凍劑有卵黃、甘油、乙二醇、二甲亞砜、肌醇、有機(jī)鹽以及一些糖類等。

1.1 高膜透過(guò)性防凍劑

目前在綿羊精液中添加的膜透過(guò)性較高防凍劑種類較多，主要以甘油、乙二醇、酰胺類物質(zhì)為主。甘油作為一種通透性很強(qiáng)的保護(hù)劑，是綿羊精液最早使用的抗凍保護(hù)劑，一般濃度為4%～6%，其在精液中可以降低細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，阻止精子細(xì)胞蛋白質(zhì)的變性。甘油進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)外，可以減緩細(xì)胞的脫水速度，避免精子細(xì)胞發(fā)生滲透性損傷，但甘油會(huì)損傷精子的結(jié)構(gòu)并影響一些酶的活性[1-5]。在篩選比較甘油、乙二醇、乙酰胺對(duì)公羊精液的保存效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，5%甘油比其他冷凍保護(hù)劑的質(zhì)膜完整性更高，甘油（5%）和乙二醇（3%或5%）的聯(lián)合使用，可以使精子運(yùn)動(dòng)能力更大，并且研究發(fā)現(xiàn)5%甘油對(duì)精子質(zhì)膜可以提供更好的保護(hù)[6]。劉玉峰等[7]發(fā)現(xiàn)用濃度為5%的乙二醇冷凍綿羊精液可以提高凍后精子的頂體完整率，其冷凍效果優(yōu)于甘油。但研究也表明用乙二醇作為豬精液的冷凍保護(hù)劑，導(dǎo)致精液尾部畸形精子較多，可能對(duì)精子也有一定的損害作用[8]。精子經(jīng)過(guò)冷凍后細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要，研究發(fā)現(xiàn)十二烷基硫酸鈉（SDS）可以保護(hù)精子膜結(jié)構(gòu)，能夠保護(hù)精子的頂體與質(zhì)膜的完整率[9]。同時(shí)宋玉坤等[10]發(fā)現(xiàn)在綿羊冷凍精液中添加1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）可以顯著提高冷凍解凍后精子的成活率。曹訪等[11]對(duì)不同冷凍保護(hù)劑（乙二醇甲醚、乙二醇、丙三醇、1，2-丙二醇、甲醇、二甲基亞砜等）進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，乙二醇與丙三醇對(duì)精液的冷凍保存效果最佳。在缺乏蛋黃的山羊精液中添加二丁基羥基甲苯（BHT）可以提高冷藏精液的活力，以及凍融精子的活力（48.5%）和受精能力（62.5%），所以二丁基羥基甲苯可以代替來(lái)自動(dòng)物源性的蛋黃，減少某些疾病的傳播[12]。

1.2 低膜透過(guò)性防凍劑

低膜透過(guò)性防凍劑不但不需要添加基礎(chǔ)液，還可以起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用，常見(jiàn)的有蔗糖、乳糖、麥芽糖、肌醇、抗壞血酸鈉以及TEST液等。卵黃作為非滲透性的防凍劑，因?yàn)槠浜新压檀迹缙谘芯堪l(fā)現(xiàn)它可保護(hù)精子免受冷休克的破壞作用，保持精子的活力，減少頂體酶的損失[13]，蛋黃可以降低甘油的濃度，減少甘油對(duì)精子的損傷，是稀釋液中常加的一種物質(zhì)。毛冉等[14]通過(guò)比較不同糖類（葡萄糖、D-半乳糖、果糖和蔗糖）對(duì)綿羊精液的保存效果，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、D-半乳糖和果糖的混合糖效果較好，蔗糖組效果較差。海藻糖是一種非滲透性的二糖，容易形成氫鍵，可以降低水分子的轉(zhuǎn)動(dòng)速度，避免生物膜的脫水損傷，研究發(fā)現(xiàn)在精液中添加海藻糖可以減少冰晶對(duì)細(xì)胞的傷害[15,16]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)一些無(wú)動(dòng)物源性的抗凍保護(hù)劑逐漸被開(kāi)發(fā)，如用大豆卵磷脂替代卵黃，能夠延長(zhǎng)綿羊精液低溫保存的時(shí)間，以及一些其他植物的提取成分也可以作為抗凍劑，且效果明顯[17-20]。

2 抗氧化劑

活性氧對(duì)維持精子正常的生理功能至關(guān)重要。一般在精液中添加的抗氧化劑有維生素、氨基酸、酶、植物提取物等，這些抗氧化劑的機(jī)理大部分是與自由基的結(jié)合，形成抗氧化成分，以保護(hù)精子。公羊精子在體外也具有抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽還原酶，以及非酶抗氧化劑等。在酶的作用下，精子在體外可以減少氧化[21]。

2.1 維生素族抗氧化劑

抗壞血酸作為一種常用的抗氧化劑，它可能通過(guò)防止對(duì)精子DNA的氧化損傷來(lái)維持精子細(xì)胞的遺傳完整性[22]。維生素B12是另一種水溶性維生素，它以輔酶的形式參與各種代謝過(guò)程，維生素B復(fù)合物可以提高精液解凍后的活力，并在冷凍保存過(guò)程中保護(hù)精子膜的完整性[23]。同樣Hu等[24]發(fā)現(xiàn)維生素B12可以保護(hù)精子在冷凍過(guò)程中免受膜脂質(zhì)的過(guò)氧化作用，所以在精液冷凍過(guò)程中，可以添加B12 能減少精子在冷凍過(guò)程中的損傷，從而提高精子的活力。維生素E是一種親脂性抗氧化劑，可保護(hù)組織中的多不飽和脂肪酸免于過(guò)氧化，在冷凍精液中添加維生素E可改善精液的活力和精子膜完整性[25,26]。

2.2 酶與氨基酸類抗氧化劑

部分酶類在精液中可以起到很好的抗氧化作用，如超氧化物歧化酶（SOD）可以保護(hù)頂體的完整性，增強(qiáng)線粒體的活性，以期延緩精子的壽命[27]。過(guò)氧化氫酶已被用于抗氧化劑運(yùn)用在綿羊精液當(dāng)中，以提高精液的抗氧化能力并保持精子功能[28]。研究發(fā)現(xiàn)在冰凍融化的公羊精液中，添加谷胱甘肽可以提高精子的活力，增加谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性[29]。

氨基酸類抗氧化劑也存在于精漿當(dāng)中，常見(jiàn)的有脯氨酸、牛磺酸、亞牛磺酸、組氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、半胱氨酸等。脯氨酸可以減少脂質(zhì)的過(guò)氧化作用，并能夠穿透精子，從而抑制細(xì)胞內(nèi)冰的形成，Sharon等[30]將谷氨酰胺和脯氨酸作為冷凍精液的抗氧化劑加入到精液中，發(fā)現(xiàn)可以防止冷凍對(duì)精子的傷害并改善冷凍前后的精子的性狀。蛋氨酸是谷胱甘肽的前體氨基酸，可保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，蛋氨酸與棉子糖共同使用可以防止冷凍對(duì)精子DNA的損傷[31]。半胱氨酸容易穿透細(xì)胞膜，增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的合成，防止在精液儲(chǔ)存或冷凍狀態(tài)下精子喪失運(yùn)動(dòng)性，在精液中添加半胱氨酸和?；撬峥梢蕴岣呔禹旙w和整體形態(tài)的完整性、增加精液的抗氧化力[32]。褪黑素是色氨酸的衍生物，它通過(guò)與自由基的結(jié)合并通過(guò)一系列過(guò)程形成抗氧化成分，增加一些抗氧化酶類的活性、提高精子DNA的完整性、保護(hù)頂體的完整性等優(yōu)點(diǎn)，常添加在精液中作為一種抗氧化劑[33-35]。

2.3 植物提取物抗氧化劑

近年來(lái)，研究者從植物中提取有效成分用來(lái)作抗氧化劑，并起到了很好的效果。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚類復(fù)合物，其可以參與精液的氧化還原調(diào)節(jié)，自身可以產(chǎn)生抗逆性的物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以提高家畜凍精的品質(zhì)[36,37]，呂春榮等[38]發(fā)現(xiàn)在山羊冷凍稀釋液中添加適量濃度的白藜蘆醇可以改善山羊凍精質(zhì)量。從大豆植物中提取的大豆異黃酮，因?yàn)槠浜蟹恿u基，可以與自由基結(jié)合，從而抑制氧化，研究發(fā)現(xiàn)在種公羊精液稀釋液中（常溫）添加0.10 mmol/L的大豆異黃酮可提高精液保存效果[39]。吳琳[40]發(fā)現(xiàn)在豬常溫精液中添加抗氧化劑丹參酮IIA、蘆丁和靈芝多糖顯著增強(qiáng)精子的活率，且顯著促進(jìn)精子的抗氧化酶能力，降低了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生。李宇[41]發(fā)現(xiàn)在山羊精液中添加中藥抗氧化劑提取物3.0 mg/ml淫羊藿多糖，可以提高凍融后精子的質(zhì)量，改善精子的總抗氧化水平，對(duì)精液冷凍保存具有保護(hù)作用。沒(méi)食子酸是一種天然抗氧化劑，研究發(fā)現(xiàn)在精液中添加它可以顯著提高后精子的活率，并降低精液中活性氧以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的含量[42]。鞣花酸屬于多酚二內(nèi)酯的一種，它能夠通過(guò)清除精子細(xì)胞內(nèi)的自由基，提高總抗氧化能力，減低精子的損傷[43]。椰子油里含有多種抗氧化劑成分，研究發(fā)現(xiàn)在Tris基礎(chǔ)液中添加8%的椰子油與不同濃度的蛋黃結(jié)合使用可以提高牛精液的冷凍保存效果[44]。

2.4 其他抗氧化劑

精子的氧化損傷是凍融精子活力下降的主要原因之一，二丁基羥基甲苯（BHT）作為抗氧劑經(jīng)常作食品添加劑，能延遲食物的酸敗，研究發(fā)現(xiàn)在冷凍精液中添加BHT可以改善精子的運(yùn)動(dòng)能力和存活能力，增加頂體的完整性[45]。M Eslam[46]等發(fā)現(xiàn)添加棕櫚油酸酯可改善綿羊精液在儲(chǔ)存過(guò)程中精子的活性，提高總抗氧化劑活性水平，所以棕櫚油酸酯可以作為公羊精液在存儲(chǔ)中的抗氧化劑。尿酸鹽是動(dòng)物精液中的主要抗氧化劑之一，在精液中添加它可以中和自由基，保持一些酶的活性，有助于保存和增強(qiáng)精子的活力，保持其形態(tài)，但過(guò)量的尿酸鹽能降低精液中一些酶的活性[47]。

3 維持滲透壓物質(zhì)

滲透壓對(duì)精子有很大的影響，精子與周圍的環(huán)境基本是等滲的，如果精清部分的鹽類物質(zhì)濃度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致精子脫水，反之，會(huì)導(dǎo)致精子膨脹，造成精子運(yùn)動(dòng)變慢，甚至死亡。冷凍保存會(huì)影響精子的滲透耐受性和細(xì)胞內(nèi)離子濃度[48]，所以良好的滲透壓物質(zhì)能平衡精子內(nèi)外滲透壓，以保護(hù)精子的正常形態(tài)。常見(jiàn)的維持滲透壓物質(zhì)有糖類和鹽類，其中糖類物質(zhì)有葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖等，糖類物質(zhì)不但可以調(diào)節(jié)精液的滲透壓，還可以為精子提供能源物質(zhì)，使其保持活力。鹽類物質(zhì)有檸檬酸鹽、重碳酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等，不但可以調(diào)節(jié)精液的滲透壓，還可以穩(wěn)定精液的pH值。國(guó)內(nèi)外主要以Tris為緩沖物質(zhì)，效果良好，且對(duì)精子損傷較小。環(huán)糊精是直鏈淀粉轉(zhuǎn)化而來(lái)，其可以降低揮發(fā)性的作用，研究發(fā)現(xiàn)用環(huán)糊精處理山羊精液會(huì)增加精子膽固醇含量，不但可以提高解凍后精子的活力和頂體完整性，還可以提高精液的滲透耐受性[49]。

4 抗菌物質(zhì)

精液本身或者在采精、精液稀釋以及人工授精的同時(shí)，會(huì)受到細(xì)菌或有害微生物的污染，常見(jiàn)的細(xì)菌有沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬等。精液中添加抗菌藥物，可控制細(xì)菌的污染和生長(zhǎng)，提高精子的活力，且隨著藥物濃度的增加，抑菌效果越明顯[50]。常見(jiàn)的抗菌藥物有鏈霉素、青霉素、林可霉素、慶大霉素、土霉素等，該制菌物質(zhì)一般屬于廣譜抗生素，對(duì)精子的損傷很小。精液中的微生物可以使精子質(zhì)膜的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷，影響受精率[51]。茆達(dá)干等[27]為了篩選較好的抗菌藥物，在山羊精液中分別添加恩諾沙星、慶大霉素、氧氟沙星、青鏈霉素菌特靈等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在精液中添加 50 μg/ml的恩諾沙星的低溫保存效果優(yōu)于其他抗生素。但長(zhǎng)期抗生素會(huì)增強(qiáng)抗生素的耐藥性，會(huì)進(jìn)一步增加細(xì)菌的感染性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外都在尋找可以代替抗生物的最佳替代品，如一些植物提取物、人工合成物等。淫羊藿苷是一種中草藥提取物，其不但有抗氧化的作用，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也有一定的抑菌作用，且效果與慶大霉素相似[52]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)中草藥提取物綠原酸、石榴提取物安石榴甙、Lε-聚賴氨酸都可以抑制精液中細(xì)菌，對(duì)精液有一定的保護(hù)作用[53-55]。

5 小結(jié)與展望

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，科技工作者為了提高綿羊冷凍精液的保存品質(zhì)，在稀釋液中添加了種類繁多的添加物，以期找到更好地添加劑。人工授精技術(shù)為是綿羊的改良的一項(xiàng)重大革新，為畜牧生產(chǎn)提供了便捷，而冷凍精液可長(zhǎng)期保存，運(yùn)輸簡(jiǎn)易，且生物安全系數(shù)高。稀釋液是精子的保護(hù)劑，可以減少精子在冷凍過(guò)程中的損傷，部分稀釋液成分因動(dòng)物的種類的不同其效果也有差異，起作用效果機(jī)制還不太明確。目前研究主要集中在尋找具有多種性能的添加劑并探究其作用機(jī)制，如一些糖類不但可以提供能源，還能起到防凍作用，一些植物的提取物也有良好的效果，以及用一些無(wú)動(dòng)物源性的添加劑來(lái)代替卵黃，減少某些疾病的傳播。所以加強(qiáng)精液冷凍技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的使用，會(huì)為羊業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)更多的效益，而稀釋液的種類、品質(zhì)、技術(shù)也會(huì)進(jìn)一步提升。