干細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞的途徑探討

陳 瑾，徐國興

0引言

干細胞(stem cell)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞。它可以分化成多種功能細胞，具有經(jīng)培養(yǎng)不定期地分化并產(chǎn)生特化細胞的能力。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)和成體干細胞(somatic stem cell)。越來越多的證據(jù)表明，當成體干細胞被移植入受體中，它們表現(xiàn)出很強的可塑性[1]。1999年有學者分離出小鼠的肌肉干細胞，體外培養(yǎng)5d后，與少量的骨髓間質(zhì)細胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細胞會分化為各種血細胞系[2]。這種現(xiàn)象被稱為干細胞的橫向分化(trans-differentiation)[3]。關(guān)于橫向分化的調(diào)控機制還不清楚。大多數(shù)觀點認為干細胞的分化與微環(huán)境密切相關(guān)。成體干細胞可以橫向分化為其他類型的細胞和組織，為干細胞的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。ES、成體干細胞能夠被定向誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜色素上皮細胞[4-6]、感光細胞等，由此可獲得轉(zhuǎn)分化的大量視網(wǎng)膜色素上皮細胞源，體內(nèi)干細胞及視網(wǎng)膜色素上皮細胞移植有望應(yīng)用于各種視網(wǎng)膜退行性疾病的細胞替代治療。本文就各種干細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞的途徑及應(yīng)用進行探討。

1視網(wǎng)膜色素上皮細胞的生理與臨床

視網(wǎng)膜色素上皮是神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間含有黑色素的上皮細胞層，為單細胞層。其生理功能：吸收散射光線；控制視網(wǎng)膜下腔的液體和營養(yǎng)物質(zhì)；視色素再生與合成；合成生長因子和其他代謝物；維持視網(wǎng)膜的貼附；胞飲和消化光感受器的代謝廢物；維持電穩(wěn)態(tài)；創(chuàng)傷和手術(shù)后的再生和修復(fù)。臨床上許多視網(wǎng)膜疾病所發(fā)生的色素改變都發(fā)生在色素上皮層[7]。

視網(wǎng)膜變性等疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)以及青光眼等，將導(dǎo)致視覺功能的損傷，尤其是視細胞的丟失將導(dǎo)致視覺功能的永久喪失。目前各種治療方法尚無明確療效，收效甚微。近年來，基因和干細胞研究取得了長足的進步，學者們將研究重點放在了視網(wǎng)膜細胞的移植上，特別是視細胞和視網(wǎng)膜色素上皮，為上述疾病的治療提供了可能?；蛑委熂夹g(shù)在眼科取得了巨大的進展,干細胞的發(fā)現(xiàn)為科學家們開辟了一條全新的道路。干細胞具有多向分化的潛能，故有望通過特定的體內(nèi)外誘導(dǎo)干細胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞的方法，為視網(wǎng)膜色素上皮退行性病變提供有效的細胞替代治療手段，將有功能的細胞代替損傷的細胞，從而恢復(fù)其功能。通過視網(wǎng)膜干細胞移植,使其整合入視網(wǎng)膜各層并且分化為目標細胞,以重建視網(wǎng)膜功能[8]。

2干細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞的途徑

2.1 ES誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞1998年,Thomson等[9]和Gearhart等[10]分別用ES和胚胎生殖細胞建立了人的ES系,在體細胞與生殖細胞間架起了橋梁,為研究ES的發(fā)育,在體外培養(yǎng)人體細胞和組織,利用ES治療疾病提供了廣闊的發(fā)展前景。

ES來源于囊胚期胚胎內(nèi)細胞團，具有無限增殖、多向分化等特性，研究者們通過創(chuàng)造特定的體外培養(yǎng)條件，可將ES定向誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜色素上皮細胞，已有大量研究成果證實這一方法的可行性，成功誘導(dǎo)出視網(wǎng)膜色素上皮細胞[11-15]，并有望成為視網(wǎng)膜退行性病變替代治療的細胞首選獲取途徑。

2.2成體干細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞成體干細胞是存在于人與哺乳動物已分化組織與器官中，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的尚未分化的不成熟細胞群體。在適當?shù)恼T導(dǎo)條件下，可分化出組成該器官組織的各種細胞類型，替代生理性衰亡細胞在組織受損時起代償性增生作用，維持機體的正常結(jié)構(gòu)和功能。在體外可跨系、甚至跨胚系分化為某些成熟細胞。與ES相比，成體干細胞在應(yīng)用上有更大的優(yōu)勢[16]：(1)存在于人體各種組織和器官中，取材方便，不涉及倫理問題。(2)正常情況下處于靜止狀態(tài)，只有在病理情況下才顯示出一定的自我更新潛能，其導(dǎo)致細胞“永生化”甚至癌變的可能性較小。(3)可產(chǎn)生一個含有多種細胞成分的特定組織，移植入患者體內(nèi)后，有望產(chǎn)生該器官所有類型的目標細胞，達到在結(jié)構(gòu)和功能上的修復(fù)或替代。(4)一些類型的成體干細胞可向體內(nèi)損傷甚至遠離其發(fā)源地的部位遷移，成為前體細胞并分化為終末成熟細胞，用來修復(fù)組織損傷。也可將其作為目的基因的理想載體。(5)某些成體干細胞可分泌生長因子，發(fā)揮動員或保護該組織其他細胞的作用以加強移植效果。人們可以利用基因工程手段對成體干細胞進行操作，以補充患者組織中缺乏的某些成分。

成體干細胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復(fù)及維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究結(jié)果表明，即使在含量豐富的骨髓細胞，每10000～15000個骨髓細胞中只有一個造血干細胞[17]，人和動物皮膚中的干細胞含量僅為7%～8%[18]。目前發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞的成體干細胞主要包括骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、脂肪干細胞等。

2.2.1 MSCs誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞成人的MSCs主要來源于骨髓，具有多向分化潛能，可作為誘導(dǎo)分化視網(wǎng)膜色素上皮細胞的種子細胞[19-20]。 MSCs不表達造血干細胞表面抗原CD34、CD14及白細胞表面抗原CD45，而表達SH2、SH3、CD29、CD106和CD166等表面抗原[21]。血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)作為結(jié)締組織生長因子，對體外MSCs生長有促進作用[22]。在合適的條件下，MSCs易誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)組織細胞如成骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、造血干細胞等。已有研究表明，大鼠MSCs可在體外成功誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞[23]。

MSCs誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞可通過眼內(nèi)注入法和體外誘導(dǎo)法來實現(xiàn)。(1)眼內(nèi)直接注入法：有研究表明，將MSCs直接注入RCS大鼠視網(wǎng)膜下，MSCs能與視網(wǎng)膜色素上皮層及視網(wǎng)膜神經(jīng)層整合[24-28]，并能表達視網(wǎng)膜色素上皮特征性標志物，如細胞角蛋白(cytokeratin，CK)與S-100[29]。誘導(dǎo)分化而來的視網(wǎng)膜色素上皮細胞可挽救部分病變的視網(wǎng)膜色素上皮細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞[30]。另有學者通過向患有視網(wǎng)膜色素變性RCS大鼠的鼠尾靜脈注射MSCs[31]，注入的細胞可遷移至視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，此法相對無創(chuàng)，可減少高眼壓、眼內(nèi)炎等風險，并能延緩視力喪失。通過眼內(nèi)直接注入法雖能使誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細胞表達相關(guān)標記物，且能夠遷移至視網(wǎng)膜色素上皮層，但由于分化的細胞缺乏視網(wǎng)膜色素上皮細胞典型形態(tài)及細胞功能，其療效尚待進一步觀察。(2)體外誘導(dǎo)法：為使誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜色素上皮細胞能夠獲得正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞的典型形態(tài)及細胞功能，近年來，學者們對體外誘導(dǎo)分化系統(tǒng)進行了大量的研究和探索，包括與視網(wǎng)膜色素上皮細胞共培養(yǎng)進行聯(lián)合誘導(dǎo)[32-33]，或添加誘導(dǎo)劑[34-36]進行誘導(dǎo)。2013年，Duan 等[32]利用Transwell膜隔離培養(yǎng)豬視網(wǎng)膜色素上皮和人MSCs，共培養(yǎng)14d后骨髓干細胞內(nèi)出現(xiàn)色素顆粒，并表達視網(wǎng)膜色素上皮細胞標記物，具有吞噬功能和一定的分泌功能。盡管體外誘導(dǎo)法取得了一定的成果，但誘導(dǎo)分化的細胞僅具備正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞的部分功能，目前尚存在誘導(dǎo)率低，移植后存活率低等問題。

2.2.2脂肪干細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞來源于不同部位的脂肪干細胞的數(shù)量和分化潛能不同，白色脂肪內(nèi)的含量多于棕色脂肪，而與腹部、大腿和乳房來源的脂肪組織相比，人的前臂組織中含有更多的脂肪干細胞。用不同的誘導(dǎo)方法可以跨胚層定向分化形成軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元細胞，肝細胞、上皮細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞等。與來自骨髓的間充質(zhì)干細胞不同，脂肪干細胞的分化能力不會隨著提供者年齡的增加而降低。迄今為止，脂肪干細胞體外誘導(dǎo)為視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜色素上皮細胞方法主要還是采用體外誘導(dǎo)，包括與視網(wǎng)膜色素上皮細胞共培養(yǎng)或聯(lián)合光細胞感受器進行誘導(dǎo)，或添加誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)[37-38]，誘導(dǎo)劑含有各種生長因子，如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、視黃酸和牛黃酸 、胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ, IGF-Ⅰ)、轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor, TGF)、PDGF等,這些生長因子培養(yǎng)液制備成脂肪干細胞的誘導(dǎo)液,聯(lián)合誘導(dǎo)劑的應(yīng)用,可以創(chuàng)造一個更好的細胞誘導(dǎo)微環(huán)境。研究證實了脂肪干細胞可以體外誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器細胞，但脂肪干細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮不能做到充分的分化，誘導(dǎo)出來的細胞功能也與正常成熟的細胞存在差異。Rezanejad等[37]研究發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞僅能誘導(dǎo)分化出少量的視網(wǎng)膜色素上皮細胞，且不具有正常細胞的形態(tài)功能。脂肪干細胞對視網(wǎng)膜退行性疾病的細胞替代治療方面具有巨大潛力。

3小結(jié)與展望

ES是細胞的源頭,具有多向分化功能或全能性,并能夠定向分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞,因此在視網(wǎng)膜退行性疾病的細胞替代治療方面前景廣闊。但它存在著取材不便、移植免疫排斥的限制和倫理學方面的困擾。而成體干細胞只能在體外有限誘導(dǎo)擴增為視網(wǎng)膜色素上皮細胞,通過體外的擴增培養(yǎng)雖能夠提高轉(zhuǎn)化效率, 然而體外轉(zhuǎn)化是否會引起干細胞遺傳特性的改變尚不清楚，但這類干細胞存在于宿主體內(nèi),可直接從患者自身獲得,故無移植免疫排斥的限制也無倫理學方面的困擾。

干細胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞的研究目前尚處于實驗階段，雖然取得了一定的成果，為一些視網(wǎng)膜退行性病變?nèi)缫暰W(wǎng)膜色素變性等疾病的替代治療帶來希望，但同時應(yīng)認識到在干細胞實驗研究中出現(xiàn)的一些問題，如誘導(dǎo)多能干細胞分化的機制尚未完全明確；多能干細胞在誘導(dǎo)分化中可導(dǎo)致組織瘤變風險；移植后的免疫排斥問題；可能導(dǎo)致早衰等。

細胞移植是治療視網(wǎng)膜色素上皮細胞變性疾病最具前景的方法，但是如何獲得經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化，數(shù)量充足且低免疫排斥和低成瘤風險的視網(wǎng)膜色素上皮細胞是目前細胞治療視網(wǎng)膜色素上皮變性疾病的所面臨的主要問題。隨著干細胞組織工程的研究進一步發(fā)展，干細胞細胞移植將為視網(wǎng)膜色素上皮變性疾病等致盲性眼病的治療開辟新的途徑。