環(huán)狀RNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展和診療中的研究進(jìn)展*

2020-03-03 13:13:22宗曾艷孔凡虹王萌萌綜述張秀明審校

國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 2020年1期

宗曾艷，孔凡虹，王萌萌，熊丹綜述,張秀明△ 審校

(1.深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳 518001;2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232000)

環(huán)狀RNA(circRNAs)是1976年使用電子顯微鏡在RNA病毒研究中首次被發(fā)現(xiàn)的[1]，此后在人類中也檢測到了circRNA[2]。過去很長時(shí)間里，因?yàn)槭軝z測技術(shù)的制約，circRNA一直被認(rèn)為是RNA在剪切過程中產(chǎn)生的無作用的錯(cuò)誤產(chǎn)物，隨著生物信息和高通量測序技術(shù)的進(jìn)步，研究人員發(fā)現(xiàn)并且鑒定了大量circRNA。與線性RNA不同，是閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能抵抗核糖核酸酶(RNase)降解，更具有穩(wěn)定性，可能在人體中有著特殊作用，現(xiàn)在的很多研究已經(jīng)證實(shí)，circRNA在心血管，糖尿病，神經(jīng)系統(tǒng)等疾病中均有表達(dá)上調(diào)或下調(diào)現(xiàn)象[3-5]，尤其在很多腫瘤疾病中也有異常表達(dá)，在不同的腫瘤類型和分期中發(fā)揮著抑癌基因，原癌基因或者兩者共兼的作用[6]，人們對于環(huán)狀 RNA 作為腫瘤診斷，治療等的潛力也正在逐步進(jìn)行挖掘。

1 circRNA的特征及產(chǎn)生機(jī)制

1.1circRNA的特征基于目前的研究，circRNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有一些獨(dú)特的特征，第一，circRNA種類繁多，含量豐富，半衰期長，對來自人類、獼猴和小鼠的多種組織的circRNA序列進(jìn)行大規(guī)模研究，分別從這3個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)了104 388、96 675和82 321個(gè)circRNA，在一些特殊情況下它的表達(dá)量甚至能達(dá)到其相應(yīng)的線性mRNA的10倍以上[7-8]，并且還提示細(xì)胞質(zhì)中的circRNA半衰期比與之對應(yīng)的線性RNA平均20 h的半衰期更長，大多是在48 h以上，它們在各種組織、細(xì)胞、體液中都有豐富的表達(dá)[9]。第二，具有很好的穩(wěn)定性，這是因?yàn)槠洫?dú)特的首尾緊閉連續(xù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺乏與各種細(xì)胞蛋白相互作用所必需的帽和尾結(jié)構(gòu)，而不易被核酸外切酶降解，使其更加穩(wěn)定[2]，利于檢驗(yàn)人員在血漿、組織及外泌體中檢測到，并因此有望成為腫瘤標(biāo)志物。第三，circRNA還具有細(xì)胞，組織和發(fā)育階段特異度，circRNA在造血細(xì)胞，血小板，紅細(xì)胞及其成熟過程中差異表達(dá)，發(fā)揮著尚未得到充分認(rèn)識(shí)的作用[10]。RYBAK-WOLF等[11]的研究中對29種不同類型或不同階段的神經(jīng)細(xì)胞和組織的核糖體缺失RNA進(jìn)行了全面測序和分析，發(fā)現(xiàn)circRNA在大腦中具有高特異度表達(dá)。circRNA含量在神經(jīng)組織[12]，尤其是突觸等永久細(xì)胞中豐度很高，其水平受神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)節(jié)[13]，而在不穩(wěn)定細(xì)胞中豐度很低。在PATOP等[14]的研究中，證明了由于circRNA高的復(fù)制率使其含量被稀釋，使得circRNA豐度和細(xì)胞增殖之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。第四，circRNA在物種進(jìn)化中顯示出高度保守性。例如，常表達(dá)于人類中的一些circRNA，能在小鼠中檢測到，有時(shí)甚至能在果蠅的大腦中發(fā)現(xiàn)[11]。斑馬魚29% circRNA序列與人類、小鼠和腔棘細(xì)胞circRNA序列具有同源性[15]。

1.2circRNA的產(chǎn)生機(jī)制在真核生物中，circRNA大多是由mRNA前體反剪接而來，反剪接是指上游外顯子的5′端與下游外顯子的3′端交替循環(huán)，產(chǎn)生共價(jià)閉合環(huán)狀。circRNA的來源途徑有多種，大多取決于供體的轉(zhuǎn)錄本，可能來源于外顯子[7]，內(nèi)含子[16]，外顯子-內(nèi)含子[17]或者來自基因間的區(qū)域[18]，外顯子circRNA含量最多，主要存在于真核生物細(xì)胞胞質(zhì)中，內(nèi)含子模式的主要存在于細(xì)胞核。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的外顯子circRNA主要形成過程有直接索尾連接和外顯子跳躍兩種。直接索尾連接是打破傳統(tǒng)的線性RNA剪切，而由外顯子反向剪切，將5′帽和3′尾端連接起來形成內(nèi)源性環(huán)狀閉合的RNA[19]；外顯子跳躍，是指上游外顯子3′端的剪接受體位點(diǎn)連接到下游外顯子5′帽剪接供體位點(diǎn)，形成含有一個(gè)或多個(gè)躍遷外顯子的RNA套索，然后，套索中的內(nèi)含子序列被移除，從而產(chǎn)生成熟的外顯子circRNA[20]，以第一種最為常見。

2 circRNA的調(diào)控機(jī)制

2.1circRNA作為miRNA海綿 miRNA是一類由小的非編碼RNA，通過結(jié)合相應(yīng)的miRNA反應(yīng)元件來調(diào)節(jié)靶標(biāo)mNA的翻譯的群體，miRNA海綿是某些circRNA的主要功能。例如，cirs-7 是目前研究最為成熟的的circRNA，因其擁有70多個(gè)保守的微小反應(yīng)原件，能與AGO蛋白協(xié)同影響miR-7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能[3]，Circ-TCF25作為miR-103和miR-107的海綿與膀胱癌細(xì)胞的一些惡性表型相關(guān)，能促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6 (CDK6)的表達(dá)類似的[21]，circRNA_100290可能作為一種競爭性的內(nèi)源性RNA，通過吸收miR-29b家族成員來調(diào)控CDK6的表達(dá)[22]。通過微陣列分析及生物學(xué)信息和熒光素酶基因報(bào)告分析證明circRNA_0084043可能作為miR-153-3p的海綿，直接與之結(jié)合，發(fā)揮著致癌基因的作用，促進(jìn)黑色素瘤的生長、遷移[23]。LI等[24]已經(jīng)證實(shí)circVAPA在結(jié)直腸癌(CRC)患者組織和血漿中上調(diào)，并通過海綿miR-101在CRC中發(fā)揮致癌特性。

2.2參與基因表達(dá)的調(diào)控一般來說，circRNA由于其在細(xì)胞內(nèi)的位置和特殊結(jié)構(gòu)，可以通過與RNA聚合酶協(xié)同，與作為海綿的線性RNA競爭，來調(diào)控其親代或下游基因的表達(dá)，最終在轉(zhuǎn)錄、翻譯階段改變基因表達(dá)。有研究表明[25-26]，circRNA可能在基因調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.2.1與RNA聚合酶結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體外顯子環(huán)狀RNA(EIciRNA)可以與細(xì)胞核中的RNA聚合酶結(jié)合來調(diào)控其自身所對應(yīng)基因的表達(dá)，例如與真核翻譯起始因子3亞基J，poly (A)結(jié)合蛋白相互作用蛋白2結(jié)合，主要富集在細(xì)胞核，與U1小核核糖核酸顆粒和RNA聚合酶Ⅱ相互作用，以順式作用的方式增強(qiáng)親本基因的轉(zhuǎn)錄，這表明可能在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用[27-28]。例如一個(gè)內(nèi)含子circRNA(ciRNA)錨蛋白副本區(qū)域52(ciankrd52)，能夠與聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)機(jī)制相互作用，通過富集親本基因的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，積極調(diào)控Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄活性，因此，敲除ci ankrd52可能降低親本基因表達(dá)[29]。

2.2.2與其他非編碼RNA競爭 circRNA與線性RNA競爭，反向剪接是circRNA形成的主要機(jī)制，規(guī)范的剪接mRNA前體(pre-mRNA)形成線性RNA，而經(jīng)反向剪切形成circRNA，所以circRNA的合成通常以其線性等價(jià)物為代價(jià)的[30]，故兩者剪接形式之間存在競爭。circRNA作為一種競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)，還可以與miRNA競爭，影響靶RNA的穩(wěn)定性或翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)過程[31]。

2.3circRNA具有編碼蛋白的能力傳統(tǒng)觀點(diǎn)，5′帽和3′尾是很重要的原件，能起始和推動(dòng)翻譯，因此沒有5′帽和3′尾結(jié)構(gòu)的circRNA被認(rèn)為沒有編碼蛋白的功能。但是來自盲肌位點(diǎn)的circRNA的翻譯為circRNA具有編碼蛋白的能力提供了強(qiáng)有力的證據(jù)[32]。在XIN等[33]和CHEN等[27]的研究中，由外顯子，外顯子-內(nèi)含子產(chǎn)生的circRNA具有開放閱讀框，而有翻譯成多肽或蛋白質(zhì)的潛力。YUN等[34]首次發(fā)現(xiàn)了RNA最豐富的堿基修飾，即在circRNA的A甲基的第6位加N元素(m6A)，到達(dá)高效啟動(dòng)蛋白翻譯作用，這種單個(gè)的m6A位點(diǎn)就足以驅(qū)動(dòng)翻譯起始。

3 circRNA參與腫瘤進(jìn)程

隨著研究的深入，已經(jīng)有越來越多證據(jù)表明，circRNA與腫瘤病毒作用關(guān)系密切，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，參與腫瘤細(xì)胞周期，增殖過程，促進(jìn)腫瘤侵襲和遷移能力，在對腫瘤早期診斷和預(yù)后等階段顯示出巨大潛力。

3.1circRNA在腫瘤發(fā)生中的研究進(jìn)展 circRNA在人體中表達(dá)差異，尤其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)類型和豐度差異更大，因此其可能與腫瘤發(fā)生，發(fā)展有關(guān)。例如，在CHEN等[35]的研究中，表明circRNA與直腸癌，乳腺癌等腫瘤疾病的發(fā)生有關(guān)。

3.1.1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和腫瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜而精確的過程，由多種信號(hào)驅(qū)動(dòng)，這些信號(hào)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期使細(xì)胞分裂和生長。許多研究表明，circRNA在控制腫瘤增殖方面發(fā)揮重要作用。YANG等[36]采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)小腦退化相關(guān)蛋白1反義RNA (CDR1as)是一種罕見的致癌circRNA，對肝癌患者細(xì)胞中CDR1as調(diào)控蛋白進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)了高達(dá)330個(gè)在肝癌細(xì)胞G2期增強(qiáng)CDR1as表達(dá)的不同蛋白，這表明它們可能是受CDR1as調(diào)控的蛋白，因此CDR1as發(fā)揮調(diào)控蛋白作用，影響肝癌細(xì)胞的增殖周期，參與腫瘤的發(fā)生。LIANG等[37]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ-ABCB10在乳腺癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，在接下來的菌落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析和凋亡實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，敲除circ-ABCB10基因后，G0/G1期細(xì)胞明顯增多，乳腺癌細(xì)胞不能正常分化，乳腺癌細(xì)胞增殖受到抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為臨床早期預(yù)防提供了新策略。通過雙熒光素酶檢測，有研究證明[38]circRNA_100269過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖，與miR-630呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，circRNA_100269和miR-630的直接相互作用構(gòu)成了調(diào)控GC細(xì)胞增殖的新途徑。

3.1.2促進(jìn)腫瘤侵襲和遷移有研究[39]發(fā)現(xiàn)circHIPK3沉默能抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲。在YUAN等[40]的研究中，證實(shí)circ_0026344水平與結(jié)直腸癌(CRC)的進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。沉默ZKSCAN1mRNA和circZKSCAN1均可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，相反的，這兩種形式的RNA的過表達(dá)在體內(nèi)和體外能抑制肝癌的生長、遷移和侵襲[41]。研究表明雄激素受體(AR)在促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(ccRCC)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而circHIAT1具有抑制AR增強(qiáng)ccRCC細(xì)胞遷移和侵襲作用[42]。LI等[43]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中hsa_circ_0000096表達(dá)明顯低于癌旁非腫瘤組織，進(jìn)一步分析表明，hsa_circ_0000096通過抑制細(xì)胞周期蛋白 D1、周期蛋白依賴激酶6(CDK6)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表達(dá)，抑制GC細(xì)胞轉(zhuǎn)移。PRMT5 circRNA通過結(jié)合海綿miR-30c誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)膀胱尿路上皮癌的遷移[44]。而ZHU等[45]的研究，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0013958在肺癌患者組織、細(xì)胞和血漿中都證實(shí)了表達(dá)上調(diào)，并且表達(dá)水平與TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。Hsa_circ_0072995調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[46]。

3.1.3circRNA在病毒相關(guān)腫瘤中的作用腫瘤病毒包括人乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒等，可引起多種腫瘤。病毒與宿主因子之間的作用機(jī)制還不是很了解，有研究表明circRNA與病毒相互作用，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生或作為病毒性circRNA和抗病毒性circRNA參與未來腫瘤的治療。在對卡波氏肉瘤(KSHV)的研究[47]中，在KSHV感染細(xì)胞和KSHV陽性患者檢測到了hsa_circ_0001400，它可以通過抑制關(guān)鍵的病毒基因而發(fā)揮抗病毒分子的作用，這是新的宿主病毒與circRNA相互作用機(jī)制，加深了筆者對這種腫瘤病毒的理解，推測在其他病毒感染導(dǎo)致的腫瘤中可能也有這種情況，因此這種抗病毒circRNA或病毒circRNA可能作為未來治療病毒所致腫瘤的靶點(diǎn)。經(jīng)過UNGERLEIDER等[48]的一系列實(shí)驗(yàn)，確定了廣泛的病毒circRNA可能在EB病毒感染的伯基特瘤和胃癌以及那些在病毒裂解復(fù)制的潛伏階段起著獨(dú)特的作用，該研究進(jìn)一步擴(kuò)展了病毒轉(zhuǎn)錄組的功能，并為發(fā)現(xiàn)EBV如何促進(jìn)感染、誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的新機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。在TOPTAN等[49]的研究中，發(fā)現(xiàn)EB病毒(EBV)和卡波氏肉瘤皰疹病毒(KSHV)能導(dǎo)致2%的人類癌癥，包括EBV陽性的Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌等，EBV和KSHV都能編碼circRNA，是一類新的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在病毒相關(guān)腫瘤中表達(dá)，可能有助于病毒的致癌，為在腫瘤病毒發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用的新形式的病毒基因表達(dá)研究提供了一個(gè)方向。ZHANG等[50]發(fā)現(xiàn)circRNA (circ-Vav3)在宿主或宿主細(xì)胞感染禽白血病病毒J亞群(ALV-J)后表達(dá)上調(diào)，circ-Vav3通過增強(qiáng)gga-miR-375靶基因YAP1表達(dá)，進(jìn)一步研究證實(shí)了circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1軸可以影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，而促進(jìn)禽類肝臟腫瘤形成。高危人乳頭瘤病毒E7癌基因的表達(dá)是維持惡性表型和轉(zhuǎn)化的必要條件，ZHENG等[51]首次全面描述了HPV-16 E7調(diào)控的circRNA在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)譜，直接證明了病毒致癌基因有可能影響多個(gè)circRNA的豐度，促進(jìn)HPV陽性癌細(xì)胞的生長。這些研究增加了筆者對circRNA與病毒相關(guān)的腫瘤機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

3.2circRNA在腫瘤診斷中的研究進(jìn)展臨床上對惡性腫瘤的早期診斷對于患者的治療，預(yù)后十分重要。腫瘤診斷領(lǐng)域一直是全球科學(xué)家研究的熱點(diǎn)，新的腫瘤診斷方法不斷涌現(xiàn)，而非侵入性生物標(biāo)志物或液體活組織檢查有可能很大程度上促進(jìn)腫瘤癥患者的生存率，因?yàn)榭梢灾貜?fù)采樣以便實(shí)時(shí)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測疾病進(jìn)展，這兩者都是個(gè)性化醫(yī)療的基石?，F(xiàn)有的診斷腫瘤的技術(shù)包括核磁共振成像、CT、病理組織切片等費(fèi)用昂貴，并且需要注射造影劑，對人體有一定創(chuàng)傷性。而circRNA的穩(wěn)定性，特異度，含量豐富，在腫瘤組織與正常組織中表達(dá)異常等特征，是未來作為惡性腫瘤早期診斷的理想的標(biāo)志物[52]。現(xiàn)有的研究表明，hsa_circ_0000190可能是一種新的無創(chuàng)胃癌診斷生物標(biāo)志物，其靈敏度和特異度均優(yōu)于常用的CEA、CA19-9等生物標(biāo)志物[53]。hsa_circRNA_100395等關(guān)鍵的circRNA有望作為乳頭狀甲狀腺癌的診斷生物標(biāo)志物[54]。ZHU等[45]的研究結(jié)果表明，hsa_circ_0013958可以作為一種潛在的無創(chuàng)生物標(biāo)志物，用于肺腺癌的早期診斷和篩選。

3.3circRNA在腫瘤預(yù)后中的研究進(jìn)展有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在判斷腫瘤預(yù)后情況和預(yù)測復(fù)發(fā)中起著重要作用。在YUAN等[40]的研究中，通過異種移植實(shí)驗(yàn)，表明circ_0026344過表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示circ_0026344是一種抑制基因，低表達(dá)預(yù)測CRC患者預(yù)后不良，可作為未來臨床判斷CRC預(yù)后情況指標(biāo)。在另外一個(gè)研究中，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PC)對102個(gè)肝癌患者(HCC)的樣本進(jìn)行了微陣列分析發(fā)現(xiàn)，circZKSCAN1表達(dá)明顯低于相鄰非腫瘤組織中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且將會(huì)以此建立該腫瘤的相關(guān)預(yù)后標(biāo)志物[41]。在一個(gè)類似的肝癌研究中[55]，circMTO1被證明作為miR-9致癌的海綿能促進(jìn)p21的表達(dá)，抑制HCC的進(jìn)展，提示circMTO1是HCC治療有利的結(jié)合位點(diǎn)，而HCC組織中circMTO1的表達(dá)降低可能是患者生存期較差的預(yù)后指標(biāo)。SHUAI等[56]的研究成果表明，circRNA_0000285可能是鼻咽癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素，提示circRNA_0000285可能是鼻咽癌的一種新的生物標(biāo)志物并與鼻咽癌的放射敏感性有很大關(guān)系。類似的。有研究[39]表明circHIPK3表達(dá)水平也可以作為鼻咽癌患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。circPRMT5作為一種新型的致癌circRNA，也是膀胱尿路上皮癌的預(yù)后標(biāo)志物[44]。circ-FBXW7I編碼功能蛋白FBXW7-185aa，可能對膠質(zhì)瘤的預(yù)后有潛在的影響[57]。

4 該領(lǐng)域存在的問題

該領(lǐng)域的研究仍存在一些不足。首先，對circRNA的識(shí)別、量化、驗(yàn)證以及過表達(dá)和沉默方法都依賴于特定的反剪接，由于單個(gè)circRNA的序列與其同源的線性RNA亞型完全重疊，因此分析circRNA的功能意義一直是一個(gè)挑戰(zhàn)[58]。第二，關(guān)于其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制仍有待探索。例如，還不了解它們最終如何被降解，以及它們的結(jié)構(gòu)如何與相對應(yīng)線性RNA產(chǎn)生功能差異的。第三，專門用于確定circRNA的生物信息學(xué)預(yù)測仍處于初級(jí)階段，circRNA的命名大多數(shù)是根據(jù)其功能命名的，而沒有明確，正式的規(guī)則[35]，命名標(biāo)準(zhǔn)化將有助于生物信息學(xué)和circRNA起源和功能的實(shí)驗(yàn)研究。雖然現(xiàn)在已經(jīng)建立了幾個(gè)數(shù)據(jù)庫，但基于生物信息學(xué)的方法也會(huì)出現(xiàn)誤差，因此應(yīng)謹(jǐn)慎處理對circRNA的注釋，并結(jié)合多種算法，及時(shí)更新數(shù)據(jù)庫，便于更全面準(zhǔn)確地利用這些數(shù)據(jù)庫。第四，除了經(jīng)典的反剪接和外顯子跳躍形成circRNA外，還有其他剪接或轉(zhuǎn)錄后修飾的模式可能存在，例如通過逆轉(zhuǎn)錄酶的模板切換、串聯(lián)復(fù)制等[58]。此外，現(xiàn)有的檢測方法還難以對circRNA和其他類型的微小RNA進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分。雖然Northern blot方法因其直觀準(zhǔn)確、不容易出現(xiàn)模板切換等特點(diǎn)，被提議為circRNA研究的金標(biāo)準(zhǔn)[27]，但更為準(zhǔn)確的研究技術(shù)還有待于進(jìn)一步開發(fā)。

5 總結(jié)