慢性HBV感染功能性治愈途徑中Tfh輔助體液免疫應(yīng)答的作用及新型HBV基因表達(dá)抑制劑的研發(fā)

亓傳旺

HBV持續(xù)感染引起的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)嚴(yán)重危害人類健康，盡管疫苗和抗病毒藥物的使用延緩了疾病進(jìn)展及降低了肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，但乙型肝炎仍是全球重要的公共健康問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球仍有2.4億(其中我國(guó)逾0.9億)人受到慢性HBV感染，每年近百萬人死于HBV慢性感染相關(guān)肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌等肝臟疾病[1]。目前，臨床上用于CHB治療的藥物主要有兩大類，包括干擾素(interferon，IFN)和核苷(酸)類似物[Nucleoside (acid) analogues，NAs]，但均不能有效清除病毒和治愈乙型肝炎[2]。隨著研究的進(jìn)展，免疫治療成為一個(gè)熱點(diǎn)。

一、Tfh輔助的B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答在慢性HBV感染功能性治愈中的作用

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)耗竭被認(rèn)為是目前主要的治療結(jié)點(diǎn)，并反映了HBV感染功能性治愈。然而，相當(dāng)有限的病人獲得HBsAg耗竭，并產(chǎn)生乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)，況且HBsAg耗竭也不意味著病毒完全清除。以往研究主要集中在細(xì)胞免疫對(duì)HBV的清除的作用，認(rèn)為多特異性和有活性的HBV特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)與病毒清除有關(guān)，對(duì)于以HBV包膜蛋白即HBsAg為靶目標(biāo)的中和抗體的作用極少關(guān)注,近來發(fā)現(xiàn)Tfh輔助的HBsAg特異性B細(xì)胞產(chǎn)生的抗-HBs在慢性HBV感染功能性治愈中起重要作用。

(一)抗-HBs自然史及經(jīng)典作用 無論是在急性感染痊愈后，還是在慢性HBV感染經(jīng)藥物誘導(dǎo)或自發(fā)性的HBV清除，抗-HBs多數(shù)只在感染HBV的人群HBsAg 消失后的血液中才可檢測(cè)到(少數(shù)出現(xiàn)病毒變異的感染者可同時(shí)出現(xiàn)HBsAg和抗-HBs)。所以抗-HBs在HBV清除中似乎沒有起主要作用。而有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抗-HBs 的出現(xiàn)不但是抗原清除的結(jié)果，還具有通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC )殺傷靶細(xì)胞促進(jìn)抗原清除的能力以及和HBsAg構(gòu)成免疫復(fù)合物激活HBV特異性T細(xì)胞的作用。其次，乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)中含有的抗-HBs可防止肝臟移植前后HBV感染以及HBV感染母親向新生兒的垂直傳播。再次，如風(fēng)濕科和腫瘤科常用的B細(xì)胞耗竭藥物“美羅華”可誘導(dǎo)HBV攜帶者、甚至“功能性治愈”患者HBV再激活。

(二)產(chǎn)生抗-HBs的HBsAg特異性B細(xì)胞特征 Salimzadeh等人發(fā)現(xiàn)：數(shù)量上，在急性、慢性和功能性治愈HBV感染者中HBsAg特異性B細(xì)胞以相似的頻率出現(xiàn)。功能上，不但長(zhǎng)期服用NAs治療的慢性HBV感染者的B細(xì)胞缺陷持續(xù)存在，表現(xiàn)為增殖能力降低、受HBsAg刺激后不能產(chǎn)生抗-HBs，從急性HBV感染患者中分離的HBsAg特異性B細(xì)胞也不能在體外成熟為分泌抗-HBs的細(xì)胞，功能性治愈者這種功能缺陷得以恢復(fù)。進(jìn)一步RNA測(cè)序顯示：HBV感染者B細(xì)胞高表達(dá)包含F(xiàn)cRL家族在內(nèi)的多種抑制性受體，而關(guān)于抗原提呈的基因下調(diào)[3]。從表型分析來看，急性和慢性HBV感染者的這些HBsAg特異性B細(xì)胞類似于“非典型記憶性B細(xì)胞”，以低表達(dá)CD21和CD27、高表達(dá)抑制性標(biāo)記物如程序性死亡受體1(progremmed cell death 1，PD-1)和轉(zhuǎn)錄因子T-bet為特征，并在HBV感染患者的肝臟、感染部位和炎癥中積聚, 高表達(dá)FcRL5的CD10-CD19+CD21-CD27-“非典型記憶性B細(xì)胞”亞群持續(xù)擴(kuò)增，最終分化為漿細(xì)胞后產(chǎn)生抗-HBs[3，4]。這種功能和表型障礙不僅限于HBsAg特異性B細(xì)胞，還波及HBV感染者的全身B細(xì)胞群[5]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種HBsAg特異性B細(xì)胞的功能障礙可以通過特定的培養(yǎng)條件如PD-1阻斷或添加白介素-2(Interleukin-2，IL-2)，IL-21和CD40配體(CD40L)在體外部分恢復(fù)[6]。

以上結(jié)論證明B細(xì)胞功能障礙是急性和慢性HBV感染缺乏抗-HBs的主要原因，這些研究發(fā)現(xiàn)也為將濾泡輔助性T細(xì)胞(Follicular helper T cells ，Tfh)輔助的B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答作為新型抗病毒策略從而實(shí)現(xiàn)CHB功能性治愈的目標(biāo)打開了一扇大門。

(三) Tfh表面分子標(biāo)志及其與CHB患者關(guān)系 Tfh是一種CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，能夠穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)趨化因子受體5(Chemokine receptor 5，CXCR5)和高水平的可誘導(dǎo)共刺激分子(Inducible Costimulators，ICOS),通過CXCR5，Tfh能與B淋巴細(xì)胞定位到相同的淋巴濾泡，并與其相互作用活化B淋巴細(xì)胞，形成生發(fā)中心(germinal center,GC)，B淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分化，產(chǎn)生抗體[7-8]。外周血CD4+CXCR5+細(xì)胞被認(rèn)為是外周記憶性Tfh，具有與Tfh相似的功能特征[9]。阻斷ICOS能顯著減少IL-21的表達(dá)，并導(dǎo)致GC形成障礙以及Tfh缺失[10]。研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者血液中CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+CXCR5+顯著高于健康對(duì)照組[11]。處于免疫清除期的CHB患者CD4+CXCR5+Tfh水平最高, 并與疾病的活動(dòng)性相關(guān),CD4+CXCR5+Tfh頻率與HBV DNA載量呈負(fù)性相關(guān), 提示CD4+CXCR5+Tfh的增高可能有利于機(jī)體對(duì)HBV的清除[12]。來自印度的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+Tfh在CHB患者的HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換方面起著非常重要的作用,在治療中獲得HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換組的IL-21、IL-17水平均顯著增高，CD4+CXCR5+Tfh顯著富集，Tfh誘導(dǎo)CD4+ICOS+Tfh的表達(dá)顯著增強(qiáng)[13-14]。因此, 外周血CD4+CXCR5+Tfh的測(cè)定, 可能為慢性HBV感染患者治療時(shí)機(jī)的選擇提供依據(jù)。

(四) Tfh亞群及對(duì)HBV感染者B細(xì)胞影響 近來發(fā)現(xiàn)位于GC的Tfh具有部分Th1、Th2及Th17細(xì)胞的特征, 能產(chǎn)生Th1, Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子。Morita等[15]發(fā)現(xiàn)人類外周血CD4+CXCR5+Tfh具有不均一性, 包含CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)樣亞群及Th1、Th2、Th17樣Tfh，其中Th2及Th17樣Tfh能夠?qū)細(xì)胞提供輔助, 而Th1樣Tfh則不能輔助B細(xì)胞。CD25+Foxp3+Treg樣亞群在慢性HBV感染者體內(nèi)富集并能促進(jìn)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞功能。和CD25-Tfh亞群相比，CD25+Tfh亞群分泌較低水平的IFN-γ，IL-17和較高水平的TGF-β，其介導(dǎo)CD20-/loCD38+漿母細(xì)胞分化的能力不及CD25- Tfh亞群[16]。

FoxP3+Treg是一群專職主動(dòng)抑制組織特異性抗原或外來抗原的細(xì)胞, 它不僅能夠抑制Th1、Th2、Th17等效應(yīng)T細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，還能遷移到淋巴濾泡對(duì)Tfh的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。 李惠鳳等研究， 與慢性無癥狀HBV攜帶者(chronic asymptomatic HBV carriers, AsC)比較，HBeAg(+)CHB患者外周血FoxP3+Treg數(shù)目有降低的趨勢(shì)，而CD4+CXCR5+Tfh數(shù)目有增高的趨勢(shì)，提示由AsC進(jìn)展到HBeAg(+)CHB的過程中, FoxP3+Treg降低， 使得AsC打破免疫耐受進(jìn)入免疫清除期，同時(shí)伴有CD4+CXCR5+Tfh的增多，以便對(duì)B細(xì)胞提供更有利的輔助，為CHB功能性治愈提供機(jī)會(huì)。

除上述研究之外，董慶洋等[17]發(fā)現(xiàn), 慢性 HBV感染發(fā)生的原因在于 Treg上面細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4， CTLA-4)的抑制性作用。具體而言在慢性HBV感染者中，由于脾臟中病毒特異性Treg細(xì)胞的大量分化，其表面的CTLA-4阻止了與抗-HBs相關(guān)的Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞的分化，進(jìn)而導(dǎo)致了慢性化的發(fā)生,使用CTLA-4的封閉性抗體處理后，可誘導(dǎo)正常Tfh細(xì)胞和GC B細(xì)胞分化,并分泌抗-HBs,加速HBsAg清除，實(shí)現(xiàn)功能性治愈。

近年進(jìn)入臨床、多用于腫瘤(如急性淋巴細(xì)胞性白血病)的嵌合抗原受體 (CAR-T)治療是通過外在手段激活患者的免疫系統(tǒng)達(dá)到治療疾病的目的。具體的，將自體T淋巴細(xì)胞分離出來，在體外進(jìn)行重構(gòu)或誘導(dǎo)刺激，然后回輸體內(nèi)去殺傷腫瘤細(xì)胞。研究結(jié)果顯示[17]，使用 CTLA-4 的封閉性抗體處理慢性 HBV 患者外周血后，在 HBsAg 抗原的刺激下，可以誘導(dǎo)分泌 IL-21 的Tfh的分化，促進(jìn) GC B 細(xì)胞的形成，進(jìn)而加速抗原的清除以及抗體的產(chǎn)生，從而徹底的清除掉HBV病毒。這種針對(duì) CTLA-4 的抑制性作用的封閉抗體來挽救異常的體液免疫，也給慢性 HBV 感染的治療提供的新的方向，不過還需對(duì)其中機(jī)制進(jìn)行深入探索。

二、功能性治愈有望通過基因和(或)免疫治療實(shí)現(xiàn)

臨床治療上看，目前針對(duì) CHB患者的治療可以達(dá)到抑制 HBV 病毒復(fù)制的效果，但是不能從根源上清除掉共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circularDNA， ccc DNA)。HBsAg一定程度上反應(yīng)cccDNA含量， cccDNA病毒微型染色體持續(xù)存在及轉(zhuǎn)錄活性是HBV復(fù)制及HBsAg合成的基礎(chǔ)。可通過以下途徑降低HBsAg水平，潛在的修復(fù)固有免疫及適應(yīng)性免疫，如消除或沉默cccDNA 轉(zhuǎn)錄活性；通過反義寡核苷酸或小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)干擾病毒轉(zhuǎn)錄；干擾包膜蛋白合成及血液中半衰期[18]。HBV藥物研發(fā)和治愈最大挑戰(zhàn)就是把cccDNA 庫作為靶目標(biāo)以及攻克關(guān)于耗竭的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子。

(一) RG7834 來自Roche的研究者報(bào)道發(fā)現(xiàn)一種新型口服生物可利用的HBV基因表達(dá)的小分子抑制劑(RG7834)[19]。有學(xué)者已在HBV感染樣本(HepaRG細(xì)胞)、正常人肝細(xì)胞、HBV感染尿激酶型纖溶酶原激活物/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的人乳化鼠模型中評(píng)估了RG7834單藥或聯(lián)合恩替卡韋抗HBV特性和選擇性，結(jié)果顯示：RG7384顯著降低病毒蛋白(包含HBsAg)水平，也降低了病毒血癥。Time course RNA-seq分析顯示對(duì)RG7834治療應(yīng)答的人群，選擇性減少HBV mRNA s。進(jìn)一步研究，聯(lián)合RG7834、恩替卡韋、Peg-IFN-α治療也引起人乳化小鼠HBV DNA和HBsAg水平明顯降低。RNAseq和northern blot分析表明RG7834可直接或間接修改病毒RNAs并促進(jìn)它們降解[20]。一項(xiàng)近期研究顯示dihydroquinolizinone混合物依靠HBV 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件加速病毒RNA降解，并和RG7834有相似活性[21]?？紤]到它口服給藥及高度選擇性，潛在的臨床用途似乎很有希望。

(二) EDP-514 它是一種治療HBV感染的新型二代核心抑制劑(也稱為衣殼組裝調(diào)節(jié)劑或核心蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑)，是 Enanta Pharmaceuticals 的核心抑制劑候選物，已被證明可在HBV生命周期的多個(gè)步驟中起作用，當(dāng)在HBV感染期間早期給予時(shí)，可以防止原代人肝細(xì)胞中新的cccDNA重新形成。體外數(shù)據(jù)顯示 EDP-514 也是一種泛基因型藥物(即對(duì)目前常見的乙肝病毒基因型均有效)，且EDP-514與核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI，HBV的當(dāng)前抗病毒療法)或I類核心抑制劑的聯(lián)合用藥還可以獲得疊加和協(xié)同抗病毒效應(yīng)。

(三) NAPs 專注于CHB和慢性丁型肝炎功能性治愈的私營(yíng)生物制藥公司Replicor近日在新加坡舉辦的The Science of HBV Cure 2019 會(huì)議上公布了核酸聚合物(NAPs; REP 2139-Ca and REP 2139-Mg，是阻斷亞病毒顆粒組裝的新型抗病毒藥物，從而阻止HBsAg釋放以及在聯(lián)合多種免疫治療時(shí)清除HBV，實(shí)現(xiàn)感染的功能性控制)研究的最終隨訪數(shù)據(jù)。這項(xiàng)研究主要評(píng)估 HBeAg 陰性CHB患者在 TDF 和Peg-IFN基礎(chǔ)上加用 REP 2139-Mg 或 REP 2165-Mg 的影響，83%的參與者實(shí)現(xiàn)了對(duì)感染的功能性控制，并且根據(jù)現(xiàn)有的指南標(biāo)準(zhǔn)不需要繼續(xù)用藥治療[22]。

(四) GS-4774+PD-1 之前的研究已經(jīng)證實(shí)治療性乙肝疫苗 GS-4774 單藥用藥對(duì)降低 HBsAg 用處不大，但最新的研究發(fā)現(xiàn)PD-1抑制劑 Nivolumab跟治療性乙肝疫苗GS-4774 的聯(lián)用能使大多數(shù)患者HBsAg 下降，并使1例患者 HBsAg 持續(xù)消失?；蛟S綜合兩者的作用機(jī)制、采用兩者聯(lián)合用藥的研究也是未來的重要方向之一[23]。