丙泊酚對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響

王春生，沈 燕

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是目前全世界一個重要醫(yī)學(xué)難題，其病死率及致殘率在意外事故中最高，是成人死亡或永久殘疾的重要原因之一[1-2]。TBI包含原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個部分，原發(fā)性損傷是決定患者預(yù)后的主要因素，但臨床上難以干預(yù)，而對于繼發(fā)性損傷的治療尚無特效藥物。大量研究表明[3-4]，自噬在大腦細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持中起著至關(guān)重要的作用，在各種急性腦損傷(包括TBI、腦卒中、癲癇發(fā)作等)中均能檢測到自噬的發(fā)生[5]。國外文獻(xiàn)報道[6]，在創(chuàng)傷性脊髓/腦損傷動物模型實驗中，通過刺激自噬能夠起到神經(jīng)保護(hù)的作用。丙泊酚是目前臨床應(yīng)用廣泛的麻醉誘導(dǎo)和維持以及重癥監(jiān)護(hù)病房鎮(zhèn)靜藥物。動物實驗研究表明丙泊酚對TBI后腦神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用。本研究通過研究丙泊酚對創(chuàng)傷性腦損傷模型大鼠神經(jīng)元自噬作用的影響，試圖闡述丙泊酚對腦神經(jīng)元保護(hù)的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：丙泊酚(北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字J20130024)；蘇木精-伊紅(HE)染色液(上海譜振生物科技有限公司，批號：20160219)；免疫大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)抗體；兔抗大鼠Beclin-1抗體；兔抗大鼠P62抗體；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(瑞士羅氏公司)。

1.2 實驗動物：雄性健康SPF級SD大鼠72只，周齡為10～12周，體重300～400 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號:44007200021086，生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2016-0002。該動物實驗獲寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為NCT01930339。大鼠飼養(yǎng)及實驗條件如下：恒溫(溫度20～26°C、相對濕度40%～70%)，且持續(xù)12 h 晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。依據(jù)隨機數(shù)字表法將上述72只大鼠分為3組：假手術(shù)組、TBI模型對照組、TBI+丙泊酚組，每組各24只，再分為3個亞組，每亞組8只。TBI+丙泊酚組在模型建立完成后，依據(jù)200 mg/kg在大鼠腹腔內(nèi)注入丙泊酚。假手術(shù)組及TBI模型對照組按照TBI+丙泊酚組腹腔內(nèi)注入等量生理鹽水。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備：所有大鼠禁食8 h 后，應(yīng)用2%苯巴比妥按照40 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。剃除頭部毛發(fā)，皮膚消毒后將頭部固定于腦立體定位儀上，切開頭皮正中并剝離右側(cè)顱骨骨膜，應(yīng)用顱骨鉆于正中線旁開一直徑5 mm骨窗，操作中注意保持硬腦膜完整。TBI模型對照組和TBI+丙泊酚組取一直徑為4 mm墊片置于腦表面，用40g砝碼由20 cm高處自由落體落下并撞擊墊片；假手術(shù)組無此步驟。然后所有大鼠用骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。

1.3.2 腦組織形態(tài)學(xué)檢查：術(shù)后所有大鼠均繼續(xù)飼養(yǎng)48 h。禁食8 h，依照動物模型制備相同麻醉方式麻醉大鼠，經(jīng)心臟注入150 ml生理鹽水及250 ml的4%多聚甲醛，待大鼠肢體僵硬后，取出全腦并浸泡在4℃的10%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)常規(guī)乙醇脫水、透明后，用石蠟包埋并行厚度約5 μm切片，常規(guī)脫蠟、脫水。應(yīng)用蘇木精-伊紅(HE)染色液染色。于光鏡下觀察腦組織病理改變。

1.3.3 腦組織TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡情況：大腦皮層組織石蠟切片，脫蠟并應(yīng)用梯度乙醇水化。加入蛋白酶K工作液處理15 min 使細(xì)胞通透，用PBS沖洗2次，加入預(yù)先準(zhǔn)備好的TUNEL混合液，37 ℃條件下反應(yīng)15分鐘，用PBS沖洗2次。在200倍顯微鏡下觀察皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量，每只大鼠選取三個不同層面，并計算視野中凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比(即皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率)。

1.3.4 腦組織中Beclin-1蛋白、P62蛋白及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II/I(LC3-II/I)蛋白比值檢測：模型建立后48 h，操作前禁食8 h，麻醉大鼠，斷頭處死，收集大鼠右側(cè)腦挫傷區(qū)的皮層腦組織并制成勻漿。置于離心機中(1 000 r/min)離心10 min，取上清液進(jìn)一步離心。蛋白質(zhì)含量用蛋白質(zhì)分析工具包(Thermo Scientific)進(jìn)行測定。每個樣本取相同量的蛋白質(zhì)(40 μg)加入到緩沖區(qū)中，95 ℃，5 min。然后加到聚丙烯酰胺凝膠的上樣孔上。電泳后轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉緩沖液抗原封閉2 h。一抗LC3(1∶1 000)、Beclin-1(1∶1 000)、P62(1∶1 000)、4℃過夜。二抗(1∶5 000)室溫下孵育過夜。蛋白質(zhì)條帶曝光后，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件(美國Media Cybernetics公司)檢測蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué):對比各組大鼠傷后48小時腦組織病理切片形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腦組織呈現(xiàn)正常腦組織，無明顯異常；TBI模型對照組切片可見其損傷腦組織區(qū)結(jié)構(gòu)混亂無序、神經(jīng)膠質(zhì)疤痕明顯，疤痕組織顯著萎縮且可見軟化灶；TBI+丙泊酚組損傷腦組織區(qū)有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞填充，其間疤痕組織范圍及軟化灶區(qū)域面積與TBI模型對照組對比均較小。

2.2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況：傷后48 h，顯微鏡下觀察并計算皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率，其中假手術(shù)組為(9.78±0.69)%、TBI模型對照組為(67.39±2.57)%、TBI+丙泊酚組為(30.73 ±2.06)%。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組顯著低于TBI模型對照組及TBI+丙泊酚組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.374、9.622，P<0.05)。TBI+丙泊酚組顯著低于TBI模型對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.365，P<0.05)。

2.3 各組大鼠腦組織中Beclin-1蛋白、P62蛋白及LC3-II/I蛋白比值表達(dá):傷后48 h，TBI模型對照組Beclin-1蛋白、LC3-II/I蛋白比值均較假手術(shù)組顯著升高，P62蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TBI+丙泊酚組Beclin-1蛋白及LC3-II/I蛋白比值均顯著低于TBI模型對照組，P62蛋白表達(dá)高于TBI模型對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TBI+丙泊酚組Beclin-1蛋白及LC3-II/I蛋白比值高于假手術(shù)組，P62蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腦組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

3 討論

TBI被認(rèn)為是臨床上最嚴(yán)重的腦損傷形式之一，其所引起的身體殘疾及認(rèn)知功能障礙對患者的預(yù)后及生存質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅[7]。目前普遍認(rèn)為[8-9]，TBI包含原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個部分，原發(fā)性損傷為創(chuàng)傷本身，繼發(fā)性損傷涉及多種病理生理過程，包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡、自噬等。

丙泊酚是短效靜脈麻醉藥，屬烷基酸類，具有吸收快、靜脈輸注后不易蓄積、起效快、蘇醒完全、不良反應(yīng)少等特點，目前臨床廣泛應(yīng)用于麻醉誘導(dǎo)和維持以及重癥監(jiān)護(hù)病房鎮(zhèn)靜藥物。有關(guān)該藥對神經(jīng)細(xì)胞作用研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，其具有可調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)氧分壓、顱內(nèi)壓、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等多種作用特點，對神經(jīng)細(xì)胞起到一定程度的保護(hù)作用。國內(nèi)學(xué)者研究表明[12]，丙泊酚可抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺血再灌注損傷的大鼠神經(jīng)細(xì)胞。還有研究表明[13]，其可以抑制顱腦外傷患者血清炎癥因子、改善腦組織氧分壓及顱內(nèi)壓，從而保護(hù)腦組織。但目前對其保護(hù)作用機制尚不完全清楚。本研究采用自由落體砝碼撞擊SD大鼠，建立TBI模型，通過病理切片形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，TBI+丙泊酚組與TBI模型對照組相比大鼠腦組織損傷明顯較輕、皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示丙泊酚對TBI大鼠腦組織具有保護(hù)作用。與前述國內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果一致。

文獻(xiàn)資料顯示[14]，細(xì)胞凋亡和自噬是TBI致殘或致死的重要病理生理過程。本研究針對細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，與TBI模型對照組比較，TBI+丙泊酚組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示丙泊酚的應(yīng)用能夠有效抑制細(xì)胞凋亡過程。

自噬是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的機制，其主要特征為細(xì)胞內(nèi)形成自噬體或自噬空泡的大量出現(xiàn)，主要功能包括：能有效清除異常細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，在維持細(xì)胞穩(wěn)定性中起到重要作用。既往研究認(rèn)為[15]，不同分子、途徑對自噬的調(diào)控可能在TBI中表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激，抗凋亡和抗炎作用。因此，自噬成為TBI治療的新靶標(biāo)。既往有學(xué)者對不同TBI建模方式(包括液體沖擊損傷、可控皮層撞擊等)的觀察發(fā)現(xiàn)，自噬體的廣泛存在，其損傷腦組織中Beclin-1蛋白及LC3-II/I蛋白比值均有升高表現(xiàn)，且其濃度與自噬體的量呈正性相關(guān)，而P62蛋白表達(dá)水平與自噬程度成反比，提示上述三種蛋白為自噬相關(guān)蛋白[16]。本研究通過對上述三種蛋白的半定量檢測發(fā)現(xiàn)，TBI模型對照組Beclin-1蛋白及LC3-II/I蛋白比值水平最高、P62蛋白表達(dá)水平最低，且與TBI+丙泊酚組比較差異顯著，提示TBI模型建立后神經(jīng)細(xì)胞的自噬活性顯著增加，在應(yīng)用丙泊酚的大鼠中其自噬活性得到一定程度的抑制，這可能是丙泊酚腦保護(hù)作用的機制，具體作用位點仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，丙泊酚對TBI大鼠神經(jīng)細(xì)胞具有一定程度的保護(hù)作用，其作用機制包括對受損神經(jīng)細(xì)胞凋亡及自噬的抑制，有效減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。