TNF-α、MMP-9在OA滑膜組織中表達及其意義

陳德勝，張 晨，宋國瑞，劉子歌，郭鳳英，李 燕

隨著我國人口老齡化，骨性關(guān)節(jié)炎(OA)的發(fā)生率與日俱增，其病理特征主要為軟骨組織最先發(fā)生退行性病變，繼而軟骨下骨硬化，并伴有滑膜炎性肥大及關(guān)節(jié)周緣骨質(zhì)增生、骨贅形成[1]。OA是一個慢性退變性的病理改變，也是一個慢性進行性無菌性炎性反應(yīng)的過程[2-3]。近期研究結(jié)果證實[4]，滑膜炎發(fā)生在整個OA的炎性反應(yīng)的初始階段，也可能是OA病程發(fā)生發(fā)展中重要的一個環(huán)節(jié)?；ぱ仔员憩F(xiàn)不僅僅與OA的臨床疼痛癥狀及關(guān)節(jié)功能有關(guān)，而且與OA疾病嚴重程度呈正相關(guān)，可以預(yù)測關(guān)節(jié)軟骨退變的病理程度。關(guān)節(jié)的滑膜組織由巨噬樣滑膜細胞(Macrophage-like synovioytes)和纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synviocytes)兩種細胞組成，巨噬樣滑膜細胞是關(guān)節(jié)內(nèi)的主要炎性細胞，其來源于血液循環(huán)中的單核巨噬細胞[5]。在正常的生理情況下，巨噬嗜樣滑膜細胞促使炎性作用的較低，但是在發(fā)生病理改變時，巨噬樣滑膜細胞立即參與炎性反應(yīng)，合成分泌TNF-α、MMP-9等炎性介質(zhì)，增加炎性介質(zhì)活性，導(dǎo)致OA的加重[6]。本文通過選取OA行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)去除滑膜組織病例作為研究對象，通過免疫組化檢測OA滑膜組織中TNF-α、MMP-9的表達，探討TNF-α、MMP-9與OA發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料： 選取2018年10月-2020年1月膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)25例作為OA組，其中男性7例，女性18例；年齡54～78歲，平均年齡63.5歲。膝關(guān)節(jié)外傷患者行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療12例，作為創(chuàng)傷組，其中男性9例，女性3例；年齡19～55歲，平均年齡33.4歲。OA組納入標準：①近一個月內(nèi)有反復(fù)的膝關(guān)節(jié)疼痛，X線片站立位或負重位示關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和(或)囊性變、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成，年齡≥50歲，晨僵時間≤30 min，活動時有骨摩擦音(感)。②達到Kellgren&Lawrence分級標準Ⅳ級。③視覺模擬評分(VAS)≥4分。OA組排除標準：①存在可能引起膝關(guān)節(jié)疼痛的其他疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、腫瘤等；②合并嚴重的心、腦、肺、肝臟、腎臟、造血系統(tǒng)等疾病的患者；③合并系統(tǒng)性感染性疾病、自身免疫紊亂性疾病、慢性疾病的患者；④半年內(nèi)有關(guān)節(jié)腔藥物注射史的患者；⑤對金屬有過敏反應(yīng)的患者。創(chuàng)傷組納入標準：①有明確膝關(guān)節(jié)急性外傷史；②有膝關(guān)節(jié)韌帶、半月板等損傷，臨床表現(xiàn)和MRI檢查明確，需要手術(shù)治療者；③中青年患者；④治療過程可以配合者。創(chuàng)傷組排除標準： ①合并骨性關(guān)節(jié)炎者；②感染性關(guān)節(jié)病變、關(guān)節(jié)占位性病變等；③存在代謝性骨疾病等不適合行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療的患者；④合并內(nèi)科嚴重臟器功能不全無法耐受手術(shù)者。本研究已取得患者與患者家屬的知情同意且獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院科研倫理委員會批準，醫(yī)學(xué)倫理審批號：2015-019。

1.2 標本收集及處理：OA組取人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)術(shù)中需要去除病變的滑膜組織。創(chuàng)傷組關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的需要去除的損傷游離的滑膜組織，放置10%中性多聚甲醛浸泡，制作成蠟塊，以厚度為4 μm進行切片，烘干后備用。

1.3 蘇木素-伊紅(HE)染色：玻片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、不同濃度酒精中浸泡，用蒸餾水洗掉殘留酒精；蘇木素染色，自來水洗掉染液，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，用0.6%氨水返藍，流水沖洗；置入伊紅染液中染色；置入95%酒精I、酒精II、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水至透明；中性樹膠對已脫水的切片進行封片。 采用Olympus DP70顯微鏡系統(tǒng)(Olympus，日本)進行組織形態(tài)學(xué)觀察、拍攝。

1.4 免疫組織化學(xué)染色：切片入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ和不同無水乙醇中浸泡，自來水、蒸餾水沖洗； 3% H2O2孵育，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液煮沸進行抗原修復(fù)，滴加羊血清于玻片封閉，PBS液沖洗，滴加一抗(TNF-α，MMP-9)孵育，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉抗生物素蛋白稀釋液，37 ℃孵育，DAB液靜置數(shù)分鐘，流水沖洗，蘇木素液復(fù)染，流水輕洗，1%鹽酸酒精分化，流水輕洗，碳酸鋰返藍，流水輕洗，95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，中性樹脂封片。采用Olympus DP70顯微鏡系統(tǒng)(Olympus，日本)進行觀察、拍攝和陽性細胞計數(shù)，將切片放置在40×10倍鏡下，隨機性選取5個視野觀察，分別計數(shù)TNF-α，MMP-9在OA組及創(chuàng)傷組中關(guān)節(jié)滑膜組織的滑膜細胞的陽性細胞個數(shù)，以陽性細胞率(染色陽性的滑膜細胞個數(shù)/總的滑膜細胞個數(shù)×100%)表示蛋白的表達量。

2 結(jié)果

2.1 蘇木素-伊紅(HE)染色：OA組滑膜組織呈慢性炎性表現(xiàn)，并有絨毛樣增生，可見較厚的滑膜襯里細胞層數(shù)增加較多，有大量單核細胞、巨噬細胞及淋巴細胞浸潤，巨噬細胞和纖維細胞因增生而變大，滑膜絨毛有纖維化，可見滑膜細胞變現(xiàn)壞死；創(chuàng)傷組滑膜細胞及纖維細胞排列整齊，分布較均勻，可見較薄的滑膜襯里細胞層數(shù)較少，有少量淋巴細胞及單核細胞浸潤，血管增生不明顯(圖1-圖2，目錄后)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色(HIC)：陽性細胞主要在滑膜細胞胞漿和基質(zhì)周圍，OA組在滑膜組織中的TNF-α、MMP-9的表達明顯高于創(chuàng)傷組(圖3-圖6，目錄后)。如圖所示，圖中箭頭所指分別為巨嗜樣滑膜細胞胞漿和周圍的基質(zhì)中出現(xiàn)棕色或者棕褐色染為TNF-α及MMP-9陽性染色部位，OA組與創(chuàng)傷組有顯著性不同。2組中TNF-α、MMP-9定量結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組TNF-α、MMP-9免疫組化染色結(jié)果

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種關(guān)節(jié)軟骨破壞，軟骨下骨硬化和滑膜無菌性炎性反應(yīng)等漸進性、退變性關(guān)節(jié)疾病。臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛、畸形及活動障礙[7]。關(guān)節(jié)滑膜的炎性反應(yīng)是OA早期最常見的表現(xiàn)，也是一種繼發(fā)性反應(yīng)性炎癥[8]。有研究對OA病人早期階段的膝關(guān)節(jié)功能結(jié)構(gòu)動態(tài)觀察結(jié)果提示[9]，滑膜炎癥反應(yīng)的程度可以作為膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)功能改變和病變預(yù)后的一項指標，OA的早期病變進展變化和滑膜炎癥反應(yīng)程度呈一定的正相關(guān)系。此外，滑膜炎癥反應(yīng)在OA的降解級聯(lián)反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用[10]。

關(guān)節(jié)滑膜是關(guān)節(jié)重要的組成部分，主要由兩種滑膜細胞組成。一是巨噬樣滑膜細胞(Macrophage-like synovioytes)，來源于周圍血液循環(huán)中的單核巨噬細胞，是關(guān)節(jié)內(nèi)最主要的炎性細胞之一，在特異性免疫應(yīng)答過程中，可以分泌諸如TNF-α、IL-1、MMP-9等多種炎性介質(zhì)，這些介質(zhì)可以在關(guān)節(jié)內(nèi)促進炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致OA加重。巨噬樣滑膜細胞的數(shù)量與OA病變程度及疾病預(yù)后關(guān)系極為密切。二是成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synviocytes)，在關(guān)節(jié)內(nèi)起到滑液美透明質(zhì)酸鹽及粘多糖的合作與分泌[5]。滑膜組織中有多種細胞因子和炎性介質(zhì)參與了OA病程的變化，其中TNF-α和MMP-9起著重要的作用[11]。

TNF-α是由激活的巨噬細胞和(或)滑膜細胞產(chǎn)生，具有抑制成骨細胞和增強破骨細胞的活性作用，是人機體內(nèi)作用最重要的致炎因子之一[12]。TNF-α作為炎癥反應(yīng)的始動因子，加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨生存環(huán)境平衡紊亂變，軟骨失去獲得足夠的營養(yǎng)而出現(xiàn)漸進性退行性改變。王文明等[13]，通過體外實驗研究結(jié)果證實：10年內(nèi)病程OA患者滑膜及外周血中TNF-α表達明顯高于10年以上病程OA患者及骨折患者。宋鵬等[14]選取54例OA患者手術(shù)切除膝關(guān)節(jié)滑膜組織和正常膝關(guān)節(jié)滑膜組織，通過Western印記檢測，結(jié)果OA患者的滑膜組織TNF-α蛋白表達明顯高于正常組。

MMP-9是從人類的巨噬細胞中分離純化獲得的基質(zhì)金屬蛋白酶具有降解變性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠、原、明膠的特異能力；此外，可以切割天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型膠原蛋白[15]。MMP-9參與內(nèi)皮細胞、上皮細胞和基質(zhì)角質(zhì)細胞核遷移等，特別是在破骨細胞中大量表達不僅表明MMP-9能降解細胞外基質(zhì)還能導(dǎo)致骨質(zhì)的破壞[16]。近期有研究證實[17]，在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中檢測了MMP-9的最低表達量并發(fā)現(xiàn)MMP-9在OA的晚期軟骨中表達下降甚至未檢測到MMP-9陽性細胞，可能與軟骨減少有關(guān)。郭靜等[18]采用原位分子雜交技術(shù)檢測骨關(guān)節(jié)炎及正常對照關(guān)節(jié)軟骨及滑膜MMP-9、IL-6 mRNA的表達水平，結(jié)果提示：MMP-9、IL-mRNA陽性表達的IOD值均高于正常對照組，表明MMP-9、IL-6mRNA在OA關(guān)節(jié)軟骨與滑膜中呈高表達，二者對OA的發(fā)生發(fā)展可能起促進作用。

本文選用行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患者滑膜組織。病理學(xué)結(jié)果顯示，OA的關(guān)節(jié)滑膜組織顯示慢性炎性表現(xiàn)，并有絨毛樣增生，可見較厚的滑膜襯里細胞層數(shù)增加較多，有大量單核細胞巨噬細胞及淋巴細胞浸潤，巨噬細胞和纖維細胞因增生而變大。在OA關(guān)節(jié)中滑膜組織出現(xiàn)的炎癥、增生和纖維化等是OA病理改變過程中的起始環(huán)節(jié)。滑膜組織的炎性反應(yīng)也導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境平衡紊亂，使得合成類因子產(chǎn)生減少，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)合成與分解平衡失調(diào)，從而出現(xiàn)軟骨基質(zhì)降解加劇，關(guān)節(jié)軟骨侵蝕，最終關(guān)節(jié)軟骨與骨組織發(fā)生退行性改變。此外，由于關(guān)節(jié)滑膜增厚，并在炎性刺激下滑膜形態(tài)發(fā)生改變，卷曲、皺折延伸到關(guān)節(jié)間隙，造成嵌頓，與上下關(guān)節(jié)軟骨面之間相互摩擦擠壓，加重關(guān)節(jié)軟骨機械性損傷。這些病理改變均與前期骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎性反應(yīng)的病理結(jié)果相符合。免疫組化結(jié)果提示，OA關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α、MMP-9的陽性細胞表達明顯高于創(chuàng)傷組，表明TNF-α、MMP-9與OA的關(guān)節(jié)滑膜炎性病變程度有一定正相關(guān)性。關(guān)節(jié)滑膜組織的巨噬樣滑膜細胞受到特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，進而分泌TNF-α、MMP-9等多種炎性介質(zhì)，TNF-α、MMP-9是參與到骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展病理過程中，加速關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)分離、降解及關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)破壞最為重要的炎性介質(zhì)和細胞因子，還加劇了滑膜和軟骨的退行性改變，加快了軟骨破壞和滑膜纖維化。與此同時滑膜組織中的巨噬樣滑膜細胞刺激分泌TNF-α，TNF-α可激活MMP-9，使其活性增加，進一步促進關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解；TNF-α作為炎癥反應(yīng)的始動因子，又協(xié)同關(guān)節(jié)內(nèi)巨噬細胞釋放多種細胞因子和炎性介質(zhì)，共同作用下，促進了炎性反應(yīng)，從而加重OA病理改變。

因此，關(guān)節(jié)滑膜組織中的TNF-α、MMP-9與OA無菌性炎性病變呈正相關(guān)，滑膜炎癥反應(yīng)與OA的早期病變進展有密切關(guān)系，而作為存在于滑膜組織中炎性介質(zhì)的TNF-α、MMP-9可能作為骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中其中較為重要的作用，也為深入探討OA發(fā)病機制提供了一定的研究基礎(chǔ)。