虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)的大鼠胰島細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

李衛(wèi)玲,茹 琴,林 款,鄭小茂,李超英

(江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院,湖北武漢 430056)

糖尿病是一種在全球范圍內(nèi)廣泛流行的體內(nèi)胰島素的相對或絕對分泌不足引起的糖類、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)代謝紊亂的內(nèi)分泌疾病,可引起多種慢性并發(fā)癥[1]。糖尿病的致病原因是多方面的,糖尿病的發(fā)病和進(jìn)展與胰島β細(xì)胞密切相關(guān),主要包括胰島β細(xì)胞數(shù)量減少和(或)β細(xì)胞功能障礙。有研究表明,細(xì)胞凋亡造成胰島β細(xì)胞數(shù)量減少、胰島結(jié)構(gòu)破壞和功能受損是糖尿病發(fā)病的重要原因,線粒體內(nèi)的氧化應(yīng)激毒性是β細(xì)胞凋亡的直接原因[2]。

近年有臨床報道,蓼科蓼屬虎杖(PolygonumCuspidatumSieb. et Zucc)可以作為治療糖尿病主藥,并且療效較好[3]。虎杖苷(Polydatin)是從虎杖干燥根莖中提取的主要生物活性成分之一,是白藜蘆醇配糖體,又叫白藜蘆醇苷,屬于芪類化合物,即羥基二苯乙烯類化合物,化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基芪-3-單-D-葡萄糖苷?；⒄溶帐翘烊坏目寡趸瘎?可在體內(nèi)代謝產(chǎn)生白藜蘆醇,因此與白藜蘆醇有相似的藥理學(xué)作用,可通過促進(jìn)自噬、抑制凋亡、抗氧化等機(jī)制,發(fā)揮內(nèi)臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性等多種藥理學(xué)作用[4-5]。研究表明,虎杖苷對于鏈脲菌素致糖尿病大鼠模型具有明顯的降糖作用。Hao等[6]研究發(fā)現(xiàn),虎杖苷能增加胰島素受體底物磷酸化水平,激活A(yù)kt信號通路,顯著降低糖尿病大鼠模型的糖脂代謝。有研究報道,在糖尿病模型中虎杖苷能夠調(diào)控Nrf2-ARE抗氧化通路,促進(jìn)Nrf2表達(dá),轉(zhuǎn)錄活性,及與ARE結(jié)合,促進(jìn)下游HO-1和SOD1表達(dá)[7]。研究表明,白藜蘆醇具有保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用[8-10],而虎杖苷對胰島細(xì)胞的作用暫未見報道。

本研究采用體外培養(yǎng)INS-1細(xì)胞為研究對象,采用特異性胰島β細(xì)胞毒劑四氧嘧啶建立損傷模型,研究虎杖苷對胰島細(xì)胞活性和功能的影響及對四氧嘧啶致胰島細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,初步探討其對胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激與凋亡的保護(hù)作用的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鼠胰島素瘤細(xì)胞INS-1細(xì)胞 上海博谷生物科技有限公司,細(xì)胞均用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng);RPMI-1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、克-林重碳酸鹽緩沖液(KRB)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和0.25%胰蛋白酶 均購自Gibco公司;四氧嘧啶(Alloxan)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、DCFH-DA探針 均購自Sigma公司;虎杖苷(純度≥98%) 購自北京儀化通標(biāo)科技有限公司;一氧化氮(NO)檢測試劑盒、Caspase-3和Caspase-9活性檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;乳酸脫氫酶(LDH)、還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒 南京建成生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 博士德生物工程有限公司;大鼠胰島素檢測試劑盒 上海酶聯(lián)生物有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

3308型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan Go全波長讀數(shù)儀、Fluoroskan Ascent FL熒光和化學(xué)發(fā)光檢測儀 Thermo公司;BX51倒置顯微鏡及成像系統(tǒng) 奧林巴斯公司;UP-250手持式超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 INS-1細(xì)胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,細(xì)胞融合度達(dá)到約90%時,PBS漂洗,0.25%胰酶消化,細(xì)胞計數(shù)后分板培養(yǎng)。四氧嘧啶造模濃度選擇實(shí)驗(yàn)中,INS-1細(xì)胞分7組,分別加入不同濃度的四氧嘧啶(0、5、10、15、20、25、30 mmol/L),確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中四氧嘧啶給藥濃度?；⒄溶諠舛冗x擇實(shí)驗(yàn)中,INS-1細(xì)胞分8組,分別加入不同濃度的虎杖苷(0、5、10、25、50、100、200、400 μg/mL),細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中虎杖苷給藥濃度。虎杖苷保護(hù)實(shí)驗(yàn)中,INS-1細(xì)胞分4組,分別為空白組(完全培養(yǎng)基)、模型組(18 mmol/L四氧嘧啶)和不同濃度虎杖苷保護(hù)組(分別給予25、50 μg/mL虎杖苷,同時給予18 mmol/L四氧嘧啶),分別檢測細(xì)胞存活率、LDH釋放、葡萄糖刺激胰島素分泌量、Caspase-3和Caspase-9活性、活性氧(ROS)、NO、SOD、GSH和MDA的含量。

1.2.2 細(xì)胞活性的測定 采用MTT法測定細(xì)胞存活率[11]。INS-1細(xì)胞接種于96孔板中,細(xì)胞密度為5×104個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)6個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照,每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清,每孔加入150 μL DMSO,酶標(biāo)儀檢測570 nm吸光度值(A),按下面公式計算細(xì)胞存活率(%):

細(xì)胞存活率(%)=A處理組/A空白組×100

1.2.3 LDH釋放的測定 INS-1細(xì)胞接種于96孔板中,細(xì)胞密度為5×104個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)6個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞上清50 μL/孔,根據(jù)LDH檢測試劑盒說明書測定,分析各組間的細(xì)胞毒性作用。

1.2.4 胰島素分泌量的測定 INS-1細(xì)胞接種于96孔板中,細(xì)胞密度為5×104個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)6個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄上清,PBS漂洗2次,加入含3.3 mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液,37 ℃預(yù)孵育30 min,棄上清,加入低糖(3.3 mmol/L)或高糖(16.7 mmol/L)葡萄糖的KBB緩沖液孵育1 h,吸取上清100 μL保存于-20 ℃待測。胰島素測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA),按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 Caspase-3和Caspase-9活性的測定 INS-1細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞密度為1×106個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)3個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞,按照試劑盒操作,檢測Caspase-3和Caspase-9活性。

1.2.6 細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定 INS-1細(xì)胞接種于24孔板中,細(xì)胞密度為1×105個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)3個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.6.1 NO含量的測定 收集細(xì)胞上清部分,1000 r/min 離心6 min,取上清各50 μL,按照試劑盒說明書操作檢測NO水平。

1.2.6.2 MDA、SOD及GSH含量的測定 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后,離心收集細(xì)胞沉淀,200 μL PBS重懸后超聲破碎,功率300 W,每5 s超聲一次,間隔10 s,BCA法測定細(xì)胞蛋白含量,據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作分別檢測每毫克蛋白中MDA、GSH的濃度及SOD活性。

1.2.6.3 細(xì)胞中ROS含量的測定 采用DCFH-DA熒光探針法檢測ROS[12],藥物處理24 h的細(xì)胞,棄上清,加入PBS漂洗1次;加終濃度為10 μmol/L DCFH-DA探針,繼續(xù)培養(yǎng)30 min。PBS漂洗3次,用細(xì)胞刮收集細(xì)胞,熒光酶標(biāo)儀檢測,激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長538 nm,熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±s)表示,各組之間進(jìn)行單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 四氧嘧啶對INS-1細(xì)胞增殖的影響

四氧嘧啶對INS-1細(xì)胞增殖的影響見表1,與空白組比較,10～15 mmol/L四氧嘧啶處理細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),20～30 mmol/L四氧嘧啶處理組細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01),表明四氧嘧啶能顯著抑制INS-1細(xì)胞增殖。由直線回歸分析計算四氧嘧啶IC50值為16.5 mmol/L。為了確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)造模成功,選擇濃度為18 mmol/L的四氧嘧啶損傷胰島細(xì)胞,建立體外糖尿病細(xì)胞模型。

表1 四氧嘧啶對INS-1細(xì)胞增殖的影響(x±s)Table 1 Effect of alloxan treatment in different concentrations on the cell viability of INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01。

2.2 虎杖苷對INS-1細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,虎杖苷濃度在5～100 μg/mL范圍內(nèi),對INS-1細(xì)胞增殖無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其中25、50 μg/mL虎杖苷效果相對較好。200～400 μg/mL虎杖苷能極顯著抑制INS-1增殖(P<0.01)。選取25、50 μg/mL虎杖苷用于后續(xù)四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷模型。

表2 虎杖苷對INS-1細(xì)胞增殖的影響(x±s)Table 2 Effect of polydatin treatment in different concentrations on the cell viability of INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,##P<0.01。

2.3 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞存活率的影響

與空白組比較,模型組細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01),說明四氧嘧啶體外損傷建模成功;與模型組比較,25 μg/mL虎杖苷組INS-1 細(xì)胞存活率極顯著升高(P<0.01);50 μg/mL虎杖苷組INS-1細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05),其中虎杖苷劑量組間無顯著差異,結(jié)果見表3。后續(xù)我們進(jìn)一步研究25、50 μg/mL虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷保護(hù)的作用。

表3 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷 INS-1細(xì)胞增殖的影響(x±s)Table 3 Effects of polydatin treatment on the cell viability of alloxan-induced INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.4 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡觀察結(jié)果見圖1。由圖1可知,空白組INS-1細(xì)胞呈不規(guī)則、多角貼壁生長,排列緊密,邊界清楚。模型組細(xì)胞數(shù)目明顯減少,排列稀疏,多見細(xì)胞變圓。25、50 μg/mL虎杖苷保護(hù)組細(xì)胞數(shù)目較模型組增多,貼壁情況也有明顯好轉(zhuǎn),與上文中虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞存活率的結(jié)果一致。

圖1 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷 INS-1細(xì)胞形態(tài)的影響(100×)Fig.1 Effects of polydatin on morphological characteristics of alloxan-induced INS-1 cells(100×) 注:a.空白組;b.模型組;c.四氧嘧啶+25 μg/mL 虎杖苷;d. 四氧嘧啶+50 μg/mL虎杖苷。

2.5 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞LDH釋放的影響

LDH作為存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的酶,細(xì)胞損傷后膜通透性改變,LDH滲出細(xì)胞外,LDH增加可反映細(xì)胞膜的損傷,其外漏的程度也可間接反映細(xì)胞受損程度。

試劑盒檢測得知,空白組、模型組LDH釋放量分別為(106.4±11.6)和(199.5±9.7) U/L。與空白組比較,模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH釋放量極顯著升高(P<0.01)。25和50 μg/mL虎杖苷保護(hù)組LDH活性降低,統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果均具有顯著性差異(P<0.05)(表4),說明虎杖苷可以抑制四氧嘧啶對INS-1細(xì)胞的損傷。

表5 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響(x±s)Table 5 Effects of polydatin on alloxan-induced insulin secretion in INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.05。

表4 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷 INS-1細(xì)胞LDH活性的影響(x±s)Table 4 Effects of polydatin on alloxan-induced LDH release in INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05。

2.6 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞胰島素分泌量的影響

與空白組比較,模型組細(xì)胞低糖誘導(dǎo)胰島素分泌量極顯著降低(P<0.01),高糖誘導(dǎo)胰島素分泌量明顯減少(P<0.05),表明胰島細(xì)胞功能受損。與模型組比較,結(jié)果顯示低糖誘導(dǎo)和高糖誘導(dǎo),虎杖苷共處理后低糖誘導(dǎo)胰島素分泌量極顯著升高,高糖誘導(dǎo)胰島素分泌量增加也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中50 μg/mL虎杖苷保護(hù)組胰島素分泌量最高,結(jié)果詳見表5。

2.7 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響

細(xì)胞發(fā)生凋亡時,活化的Caspase-9進(jìn)一步激活效應(yīng)性Caspase蛋白(Caspase-3,Caspase-6,Caspase-7),其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者,最終細(xì)胞核破裂,核膜斷裂。通過檢測Caspase-3、Caspase-9活性能夠間接地的反映胰島細(xì)胞凋亡的狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組Caspase-3(0.57±0.08)、Caspase-9(4.49±0.05)比較,模型組凋亡相關(guān)的Caspase-3(6.96±0.35),Caspase-9(12.02±0.02),活性極顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,25和50 μg/mL虎杖苷可以極顯著降低Caspase-3和Caspase-9的活性(P<0.01),其中50 μg/mL虎杖苷抑制Caspase-3活性較好,結(jié)果詳見圖2。

2.8 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激及抗氧化指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)活性氧和活性氮自由基產(chǎn)生増加,引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化。ROS和NO可以反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。檢測上述指標(biāo)能夠反映細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度。

如圖3所示,與空白組比較,18 mmol/L的四氧嘧啶處理INS-1細(xì)胞24 h后,細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷,表現(xiàn)為培養(yǎng)液中的NO 和細(xì)胞內(nèi)的ROS、MDA含量極顯著升高(P<0.01),而25和50 μg/mL虎杖苷對四氧嘧啶造成的氧化應(yīng)激有明顯抑制作用,氧化應(yīng)激指標(biāo)NO、ROS和MDA含量均顯著降低(P<0.05)。

圖2 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響Fig.2 Effects of polydatin on alloxan-induced caspase-3 and caspase-9 activation in INS-1 cells 注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01。

圖3 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1 細(xì)胞上清NO、胞內(nèi)ROS及MDA水平的影響Fig.3 Effects of polydatin on alloxan-induced NO, intracellular ROS and MDA levels in INS-1 cells 注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

SOD能夠促進(jìn)氧自由基的還原,并通過GSH-Px的催化,將氧自由基分解成水和氧氣,維持細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡,SOD活力的高低反映的是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力。GSH是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物,具有清除自由基的重要生理功能,GSH的含量可以作為衡量細(xì)胞抗氧化水平的一個重要指標(biāo)。檢測上述指標(biāo)能夠反映細(xì)胞對于自由基的清除能力。

如圖4所示,與空白組比較,18 mmol/L的四氧嘧啶處理INS-1細(xì)胞24 h后,細(xì)胞抗氧化相關(guān)SOD活性和GSH含量極顯著降低(P<0.01)。而25和50 μg/mL虎杖苷能提高INS-1細(xì)胞抗氧化能力,SOD酶活力升高極顯著(P<0.01),GSH水平升高也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),結(jié)果詳見圖4。

圖4 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1 細(xì)胞SOD活力和GSH含量的影響Fig.4 Effects of polydatin on alloxan-induced SOD activities and GSH content in INS-1 cells 注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3 討論與結(jié)論

有研究表明,氧化應(yīng)激是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要原因,與機(jī)體其他組織細(xì)胞相比,胰島β細(xì)胞清除自由基的酶的含量及活性相對較低,最易受到自由基損傷[13]。氧化應(yīng)激會導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能損傷及外周胰島素抵抗,誘發(fā)糖尿病及多種并發(fā)癥的形成。糖尿病的抗氧化治療作為一種輔助療法,已經(jīng)應(yīng)用于臨床[14]。目前植物提取物的抗氧化活性的研究大多集中在中草藥、水果、蔬菜、谷物等,天然植物提取物具有作用溫和持久、無毒副作用等優(yōu)勢。虎杖苷是從傳統(tǒng)中藥虎杖中提取的有效成分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,虎杖苷具有抗氧化作用[15];同時也具有良好的降血糖效果和改善糖尿病心肌肥厚、糖尿病腎病并發(fā)癥作用[16-17]。

本研究結(jié)果顯示,虎杖苷可顯著增加由四氧嘧啶損傷細(xì)胞存活率(P<0.05);降低細(xì)胞毒性LDH水平(P<0.05);改善細(xì)胞形態(tài);提高低糖和高糖誘導(dǎo)的胰島素分泌量(P<0.05)。通過檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9活性可知,虎杖苷極顯著抑制四氧嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.01)。25、50 μg/mL虎杖苷組NO和ROS水平極顯著下降(P<0.01),MDA含量顯著降低(P<0.05),說明了虎杖苷能夠顯著降低自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。此外,25、50 μg/mL虎杖苷與四氧嘧啶共處理后,INS-1細(xì)胞的SOD活性和GSH含量顯著升高(P<0.05),說明虎杖苷能夠顯著提高INS-1細(xì)胞的抗氧化能力。因此,推論虎杖苷可以有效緩解由四氧嘧啶引起的凋亡和氧化應(yīng)激從而對胰島β細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。綜上,虎杖苷可能通過增強(qiáng)胰島細(xì)胞清除自由基能力、降低氧化應(yīng)激損傷及抑制胰島β細(xì)胞凋亡保護(hù)四氧嘧啶損傷,具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。