靶向PD-1 的多肽阻斷劑的設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)

全麗娜， 刁妍妍， 李 巧， 李文杰， 朱麗麗， 李洪林

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

癌癥是威脅人類身體健康的重要疾病之一，目前由于癌癥的治愈率極低，因此癌癥被人們稱之為“絕癥”。根據(jù)癌癥的類型、生長(zhǎng)位置以及發(fā)病程度，癌癥的治療方法分為很多種，包括手術(shù)切除、放射療法、化學(xué)療法和靶向治療[1]，但這些治療方法均具有一定的局限性。免疫療法于1997 年第一次用于治療癌癥，現(xiàn)已成為科學(xué)家們重要的研究方向[2]。在各種免疫治療的方法中，免疫檢查點(diǎn)療法近幾年來取得了顯著療效。

程序性死亡受體1（Programmed Death 1，PD-1）是目前研究相對(duì)成熟的免疫檢查點(diǎn)之一[3]。PD-1，又名CD279，是CD28 家族中的一個(gè)負(fù)性協(xié)同刺激分子受體，是由288 個(gè)氨基酸組成的免疫球蛋白超家族I 型跨膜糖蛋白[4]。它有兩個(gè)內(nèi)源性配體，分別為PD-L1 和PD-L2。PD-1 與PD-L1 或PD-L2 結(jié)合，可以激活其在T 細(xì)胞內(nèi)的抑制信號(hào)通路，傳遞負(fù)性共抑制信號(hào)給T 細(xì)胞，影響T 細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，干擾細(xì)胞增殖、活化，甚至誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡，最終造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[5]。PD-1/PD-L1 通路形成的抑制信號(hào)具有可逆性，利用藥物阻斷PD-1/PD-L1 通路可以重新激活衰竭的T 細(xì)胞，通過腫瘤浸潤(rùn)T 淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)腫瘤誘導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)，因此針對(duì)該通路的免疫治療具有理論可行性[6]。目前，已有多種阻斷PD-1/PD-L1 相互作用的單克隆抗體應(yīng)用于腫瘤治療和臨床試驗(yàn)，并且呈現(xiàn)出顯著的療效，如靶向于PD-1 的抗體Pembrolizumab 和Nivolumab，靶向于PD-L1 的抗體Atezolizumab、Durvalumab 和Avelumab 均逐漸被獲批應(yīng)用于各種實(shí)體瘤的臨床治療[7]。但是單克隆抗體藥物具有生產(chǎn)成本較高、穩(wěn)定性低、存在一定的免疫原性等缺點(diǎn)，這使得抗體藥物的應(yīng)用受到了極大的限制。

斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Ring 課題組于2015 年發(fā)表的一篇文章表明低分子量的非抗體類藥物可用于PD-1/PD-L1 介導(dǎo)的免疫治療和診斷[8]。鄭州大學(xué)高艷鋒課題組利用噬菌體展示的方法篩選得到了一種靶向PD-L1 的不易水解的D 型多肽阻斷劑，并驗(yàn)證了該多肽阻斷劑可以阻斷PD-1/PD-L1 相互作用[9]。中科院納米技術(shù)與納米仿生研究所朱毅敏研究團(tuán)隊(duì)首次利用細(xì)菌表面展示方法篩選得到了靶向于PDL1 的多肽阻斷劑TPP-1，驗(yàn)證其具有阻斷PD-1/PDL1 信號(hào)通路和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[10]。多肽阻斷劑具有開發(fā)生產(chǎn)成本低、穩(wěn)定性好、較高的組織和腫瘤滲透性等優(yōu)點(diǎn)，但目前鮮見靶向于PD-1 的多肽阻斷劑進(jìn)入臨床。因此，研究靶向于PD-1 的多肽類阻斷劑具有很好的前景。

基于上述理論支持及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，我們課題組也致力于開發(fā)靶向PD-1/PD-L1 免疫檢查點(diǎn)的多肽阻斷劑。前期我們利用從頭設(shè)計(jì)多肽的方法設(shè)計(jì)了一系列靶向于PD-1 的多肽阻斷劑[11]，其中多肽Ar5Y_4與PD-1 的結(jié)合親和力（KD）值為1.38 μmol/L。本文在多肽Ar5Y_4 的基礎(chǔ)上截去其C 末端5 個(gè)氨基酸，得到結(jié)合親和力更高的多肽阻斷劑P5-1，并分析其阻斷PD-1/PD-L1 結(jié)合能力，評(píng)價(jià)其對(duì)T 細(xì)胞分泌IL-2水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞 PD-1 基因購于北京義翹神州科技有限公司（貨號(hào)：HG10377-M），載體pET28a、感受態(tài)菌株E.coli DH5α 與菌株E.coli BL21(DE3)均由實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pET28a-PD-1(34-150)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[11]。Jurkat 細(xì)胞和BxPC-3 細(xì)胞來源于美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 試劑 DNA marker 購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司；氨基偶聯(lián)試劑盒、醋酸鈉（pH 4.5）緩沖液和CM5 芯片購買于GE Healthcare 公司；植物血凝素（PHA）、丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）購買于Sigma公司；阻斷型抗PD-1 單克隆抗體（貨號(hào)：16-9989）與人IL-2 ELISA 檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：BMS221/2)購買于eBioscience 公司；PD-L1 蛋白（貨號(hào)：10084-H08H）購買于北京義翹神州科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靶向于PD-1 多肽阻斷劑的設(shè)計(jì)及優(yōu)化 前期我們利用計(jì)算機(jī)從頭設(shè)計(jì)多肽的方法設(shè)計(jì)了一系列靶向于PD-1 的多肽阻斷劑[11]，利用Rosetta 的Interface Analyzer 模塊進(jìn)行打分得到多肽Ar5Y_4，其氨基酸序列為GNWDYNSQRAQLYNQ。Ar5Y_4 與PD-1的結(jié)合模式如圖1 所示，從圖中可知，Ar5Y_4 上的氨基酸殘基與PD-1 蛋白形成一定的相互作用，分別為：鹽橋（D4-K78、R9-E136），氫鍵作用（W3-K78、W3-E84、Y5-E136、R9-Y68、R9-E136）和疏水相互作用（ Y5-Y68、 Y5-I126、 Y5-I134、 Y5-E136、 Y13-A132、Y13-I134）。從該結(jié)合模式的分析結(jié)果可得，Ar5Y_4 與PD-1 之間的結(jié)合親和力大部分由W3、D4、Y5 和R9 4 個(gè)關(guān)鍵錨點(diǎn)（anchor）殘基提供。另外，Ar5Y_4上C 末端的5 個(gè)氨基酸形成α 螺旋并且處于結(jié)合位點(diǎn)外面，可能該部分序列不利于Ar5Y_4和PD-1 的結(jié)合。本文將Ar5Y_4 C 末端的5 個(gè)氨基酸截去以獲得多肽P5-1，其序列為GNWDYNSQRA，希望多肽P5-1 既能保留與PD-1 的結(jié)合能力，又可避免與PD-1 結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的位阻效應(yīng)。

圖 1 多肽Ar5Y_4 與PD-1 的預(yù)測(cè)結(jié)合模式[11]Fig. 1 Predicted binding mode of peptide Ar5Y_4 with PD-1

1.2.2 PD-1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與純化 文獻(xiàn)[12]報(bào)道，將PD-1 的34～150 位氨基酸克隆于pET-28a載體中，并將第73 位半胱氨酸突變成絲氨酸，目的是增加PD-1 蛋白的表達(dá)量。選取克隆構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行PD-1 蛋白表達(dá)。在菌體吸光度值（OD 值）達(dá)到0.6 時(shí)，向TB（Terrific Broth）培養(yǎng)基中加入0.5 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)劑，并在37 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)5～7 h。誘導(dǎo)后的大腸桿菌菌體收集后經(jīng)高壓破碎，離心后取沉淀，此時(shí)PD-1 重組蛋白以包涵體形式存在于沉淀中。先用含有低濃度尿素的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L尿素，φ 為2.5%Triton X-100，pH 8.0）洗去沉淀中大部分的雜蛋白，再用含有高濃度尿素的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 8.0）在室溫下溶解沉淀中的PD-1 蛋白。將PD-1 蛋白濃縮后加入復(fù)性緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L L-Arg（L-Arginine），24 mmol/L NaCl，1 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）中，用稀釋法于4 ℃下復(fù)性24 h。將復(fù)性后的PD-1 蛋白濃縮，并且在透析緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），pH7.7）中透析過夜。然后將復(fù)性后的PD-1 蛋白進(jìn)行柱層析純化，分別使用陽離子交換層析（HiTrapTMSP FF）及凝膠過濾層析（Superdex 75 10/300）對(duì)PD-1 蛋白進(jìn)行純化。最后通過十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE 電泳）檢測(cè)純化后PD-1 蛋白的純度。

1.2.3 多肽P5-1 與PD-1 蛋白結(jié)合親和力的測(cè)定 本文運(yùn)用表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技術(shù)測(cè)定多肽P5-1 與PD-1 蛋白之間的結(jié)合親和力，實(shí)驗(yàn)在BIAcore T200 儀器（GE Healthcare）上進(jìn)行。首先將純化后的PD-1 蛋白用pH 4.5 的醋酸鈉溶液稀釋至50 μg/mL，再用偶聯(lián)試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）將PD-1 蛋白偶聯(lián)在CM5 芯片上，流速為10 μL/min，結(jié)合時(shí)間為600 s，最后用乙醇胺封閉，最終PD-1 的偶聯(lián)量約為4 000 RU。偶聯(lián)完成后，利用運(yùn)行緩沖液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液, 2.7 mmol/L KCl, 137 mmol/L NaCl 和φ 為0.005%表面活性劑P20, pH 7.4）沖洗芯片表面直至基線平穩(wěn)，之后將多肽P5-1 用運(yùn)行緩沖液溶解，并將其稀釋成一系列濃度梯度（0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L），將配制好的多肽以30 μL/min 的流速結(jié)合芯片上的蛋白90 s，解離120 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用BIAcore T200 Evaluation 1.0 軟件進(jìn)行穩(wěn)態(tài)擬合。

1.2.4 多肽P5-1 的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn) 利用表面離子體共振（SPR）設(shè)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，用于證明多肽P5-1 在結(jié)合PD-1 的同時(shí)可以阻斷PD-1 與PD-L1 的相互作用。首先將購買的PD-L1 蛋白凍干粉用超純水溶解并稀釋至1 mg/mL，然后用pH 4.5 的醋酸鈉溶液將PD-L1 蛋白稀釋至50 μg/mL，利用氨基偶聯(lián)的方法偶聯(lián)至CM5 芯片上，最終PD-L1 的偶聯(lián)量約為4 000 RU。用運(yùn)行緩沖液沖洗芯片至基線平衡。將不同濃度的多肽P5-1（3.125, 0.780, 0.195, 0.045,0 μmol/L）與1 μmol/L PD-1 蛋 白 在 冰 上 混 合 孵 育30 min。多肽P5-1 與蛋白混合物隨運(yùn)行緩沖液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液, 2.7 mmol/L KCl, 137 mmol/L NaCl 和φ 為0.05%表面活性劑P20, pH 7.4）流經(jīng)芯片表面，流速為30 μL/min，結(jié)合時(shí)間90 s，解離時(shí)間120 s。運(yùn)用BIAcore T200 Evaluation 1.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)T 細(xì)胞中IL-2 的分泌水平 首先用500 U/mL 干擾素γ（IFN-γ）刺激BxPC-3 細(xì)胞48 h，目的是為了提高PD-L1 的表達(dá)[13]。然后在傳代的Jurkat T 細(xì)胞中加入2 μg/mL PHA 和20 ng/mL PMA共同刺激細(xì)胞4 h，用以激活Jurkat T 細(xì)胞[14]。換液除去Jurkat 培養(yǎng)液中的PHA 和PMA，以免影響細(xì)胞生長(zhǎng)。將刺激過后的BxPC-3 細(xì)胞與激活的Jurkat 細(xì)胞以3∶1 的個(gè)數(shù)比在96 孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)，Jurkat細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照。以阻斷型抗PD-1 單克隆抗體作為陽性對(duì)照，以D-hank’s 溶液作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組加入50 μmol/L 多肽阻斷劑，在二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。收集上清培養(yǎng)基，離心后取上清，用ELISA 試劑盒檢測(cè)Jurkat 分泌于培養(yǎng)基中IL-2 的量。用不同濃度的IL-2 標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中IL-2 的總量。該實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 高純度的PD-1 重組蛋白的獲得

利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)PD-1 蛋白，通過包涵體變復(fù)性后獲得可溶性的蛋白，然后利用陽離子交換層析及凝膠過濾層析進(jìn)行純化。純化后收集的PD-1 蛋白用SDS-PAGE 分析純度，如圖2 所示。由圖可見，PD-1 蛋白條帶位于10～15 ku，與PD-1 蛋白的理論分子量（約13 ku）相符，并且從電泳圖上可以看出，組分1 雜蛋白較多，組分2 和組分3 蛋白純度較高。收集組分2 和組分3 的樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 多肽P5-1 靶向結(jié)合PD-1 蛋白

本課題組在多肽Ar5Y_4 的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化得到多肽P5-1，其氨基酸序列為GNWDYNSQRA。運(yùn)用SPR 測(cè)定多肽P5-1 與PD-1 的KD值均為0.21 μmol/L（圖3），比PD-1/PD-L1 的KD值（1.15 μmol/L）高[15]，因此P5-1 有望阻斷PD-1 與PD-L1 的相互作用。

2.3 多肽P5-1 競(jìng)爭(zhēng)性阻斷PD-1 與PD-L1 的結(jié)合

圖 2 經(jīng)凝膠過濾層析純化后的PD-1 的SDS-PAGE 凝膠電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified PD-1 after size exclusion chromatography

圖 3 多肽P5-1 與PD-1 結(jié)合的SPR 圖Fig. 3 Binding analysis of peptide P5-1 with PD-1 by SPR

由上述SPR 實(shí)驗(yàn)測(cè)得的多肽P5-1 與PD-1 之間的結(jié)合親和力可知，多肽P5-1 不僅可以結(jié)合PD-1，并且具有亞摩爾級(jí)別的結(jié)合親和力。為了探究多肽P5-1 與PD-1 結(jié)合的同時(shí)是否可以阻斷PD-1 與PD-L1的相互作用，我們又設(shè)計(jì)了基于SPR 的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4 所示，隨著多肽P5-1 濃度的增加，PD-1 與P5-1 的結(jié)合增加，游離的PD-1 濃度降低，從而使結(jié)合在PD-L1 上的PD-1 蛋白減少，最終導(dǎo)致響應(yīng)值降低。因此，從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以表明，多肽P5-1 在分子水平上不僅可以結(jié)合PD-1，同時(shí)還可以阻斷PD-1與PD-L1 的結(jié)合。

圖 4 多肽P5-1 與PD-L1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PD-1 的SPR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 SPR for peptide P5-1 and PD-1 with competitive binding assay

2.4 多肽P5-1 可恢復(fù)衰竭的Jurkat T 細(xì)胞分泌IL-2 的水平

當(dāng)T 細(xì)胞上表達(dá)的PD-1 與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1 通路形成后，會(huì)產(chǎn)生一種共抑制信號(hào)負(fù)性調(diào)控T 細(xì)胞的功能。細(xì)胞因子的產(chǎn)生是評(píng)價(jià)T 細(xì)胞功能的一個(gè)顯著的標(biāo)志，而IL-2 與T 細(xì)胞的增殖和活化相關(guān)，因此我們?cè)谀[瘤細(xì)胞與T 細(xì)胞共培養(yǎng)體系中檢測(cè)T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2 的水平來評(píng)價(jià)T 細(xì)胞的功能，結(jié)果如圖5 所示。當(dāng)激活后的Jurkat T 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞BxPC-3 共培養(yǎng)后，Jurkat 產(chǎn)生IL-2 的量明顯下降，約比原始值（第1 列）下降40%。因此，該結(jié)果表明，在共培養(yǎng)體系中，Jurkat 表面的PD-1 可以與BxPC-3 表面的PD-L1 相互作用，并且抑制T 細(xì)胞的活化，表現(xiàn)為Jurkat 分泌IL-2 的能力下降。而當(dāng)加入多肽P5-1 后，Jurkat 分泌的IL-2 明顯增加，增加的量約為Jurkat T 細(xì)胞與BxPC-3 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)分泌量（第2 列）的30%。本實(shí)驗(yàn)將阻斷型抗PD-1 單克隆抗體（mAb）作為陽性對(duì)照（第4 列），加入陽性抗體后可以部分恢復(fù)Jurkat 分泌IL-2 的能力。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明多肽P5-1 可恢復(fù)衰竭的Jurkat T 細(xì)胞分泌IL-2 的水平。

圖 5 ELISA 法測(cè)定Jurkat 分泌IL-2 的水平Fig. 5 Measurements of IL-2 secretion in Jurkat cells by ELISA

3 結(jié) 論

本文利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，重組表達(dá)了PD-1胞外區(qū)蛋白，并且純化得到純度較高的PD-1 蛋白。我們通過從頭設(shè)計(jì)多肽的方法設(shè)計(jì)靶向于PD-1的多肽阻斷劑，在前期多肽Ar5Y_4 的基礎(chǔ)上，截去C 末端5 個(gè)氨基酸得到多肽P5-1，并測(cè)得其與PD-1 的結(jié)合親和力為0.21 μmol/L，之后通過SPR 競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)證明多肽P5-1 可以阻斷PD-1 與PD-L1 的結(jié)合。在腫瘤細(xì)胞BxPC-3 與T 細(xì)胞Jurkat 共培養(yǎng)體系中，我們發(fā)現(xiàn)多肽P5-1 可以恢復(fù)Jurkat 分泌IL-2 的能力。多肽P5-1 是在多肽Ar5Y_4 的基礎(chǔ)上截去C 末端5 個(gè)氨基酸得到的，其結(jié)合親和力比多肽Ar5Y_4 高（多肽Ar5Y_4 與PD-1 的結(jié)合親和力為1.38 μmol/L）。分析原因如下：截去Ar5Y_4 的C 末端的5 個(gè)氨基酸而保留大部分的功能氨基酸，既可保證多肽與PD-1 形成相互作用，又可減少多肽與PD-1結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的位阻效應(yīng)，從而提高了多肽與PD-1 的結(jié)合親和力。本文為后續(xù)開發(fā)靶向于PD-1 的多肽阻斷劑奠定了基礎(chǔ)，并為靶向于PD-1 的抗腫瘤研究提供多肽候選藥物。