青蝦病原菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性測(cè)定與分析

姜姿妍 姜 群 李席席 高曉建 張雙明 陳啟運(yùn) 童帥旗 張曉君

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

為有效防治青蝦病害，我們于2017－2019年對(duì)江蘇省青蝦主要養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明，引起青蝦死亡的主要病原菌為嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和非O1霍亂弧菌。為有效防治嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和非O1霍亂弧菌對(duì)青蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的危害，本試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K－B法)測(cè)試了4種病原菌對(duì)36種抗菌類藥物的敏感性，并采用試管稀釋法測(cè)定了養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的5種抗菌藥物對(duì)這4種病原菌的MIC(最小抑菌濃度)和MBC(最小殺菌濃度)，該研究結(jié)果將為青蝦的健康養(yǎng)殖提供理論參考。

一、材料與方法

1.菌株來(lái)源

2017－2019年，對(duì)江蘇省青蝦主要養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)發(fā)病青蝦進(jìn)行病原檢測(cè)，并以青蝦為宿主對(duì)病原菌進(jìn)行毒力測(cè)定，結(jié)果表明，引起青蝦發(fā)病死亡的主要病原細(xì)菌為嗜水氣單胞菌(5-s3)、維氏氣單胞菌(Y3-1)、弗氏檸檬酸桿菌(gx1)和非O1霍亂弧菌(XL1)，4株病原菌實(shí)驗(yàn)室保存供用。

2.試驗(yàn)藥品

藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，生產(chǎn)上常用的5種抗菌藥(恩諾沙星、鏈霉素、鹽酸強(qiáng)力霉素、磺胺甲惡唑和氟苯尼考)分別購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司和上海源葉生物科技有限公司，品名批號(hào)見(jiàn)表1。

表1 供試用藥物

3.藥敏試驗(yàn)

采用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散法(K－B法)對(duì)36種抗菌類藥物的敏感性進(jìn)行測(cè)定，將供試的4株菌純培養(yǎng)物分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，在28℃、160轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上加入100微升菌液并涂布均勻，待自然晾干后，再用滅菌眼科鑷取藥敏紙片分別平貼于涂布細(xì)菌的培養(yǎng)基表面，每個(gè)平板貼6張紙片，重復(fù)3次，置28℃培養(yǎng)24小時(shí)測(cè)量抑菌圈直徑，對(duì)照產(chǎn)品說(shuō)明書判定藥物敏感性。

4.MIC和MBC測(cè)定

將菌株5-s3、Y3-1、gx1和XL1分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置28℃培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液濃度稀釋為106cfu/毫升。首先用滅菌生理鹽水將供試藥物原液稀釋到2×10－1毫克/毫升，共設(shè)16個(gè)濃度，采用逐級(jí)稀釋法，使各管藥液終濃度為30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25毫克/升。然后分別加入0.1毫升濃度為106cfu/毫升的活菌液5-s3、Y3-1、gx1和XL1，每個(gè)濃度設(shè)3管重復(fù)，第17管為不加藥液的陽(yáng)性對(duì)照。輕搖使被測(cè)菌與藥液混勻，置28℃培養(yǎng)24小時(shí)后判定結(jié)果，肉眼觀察呈現(xiàn)澄清透明且搖動(dòng)后仍澄清者，則表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)(被抑制)，若呈混濁狀態(tài)則表示有細(xì)菌生長(zhǎng)(無(wú)抑制)，抑制檢測(cè)菌肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥對(duì)檢測(cè)菌的MIC。從澄清的試管中吸取0.1毫升，涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于28℃培養(yǎng)48小時(shí)后，仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為供試藥物對(duì)細(xì)菌的MBC。

二、結(jié)果

1.4種菌對(duì)36種抗菌類藥物的敏感性

紙片擴(kuò)散法測(cè)定嗜水氣單胞菌(5-s3)、維氏氣單胞菌(Y3-1)、弗氏檸檬酸桿菌(gx1)和非O1霍亂弧菌(XL1)對(duì)供試36種抗菌類藥物敏感性結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明：嗜水氣單胞菌對(duì)頭孢哌酮、左氟沙星、大觀霉素等12種藥物敏感，對(duì)哌拉西林、頭孢曲松、克拉霉素等15種藥物中介，對(duì)青霉素G、頭孢唑啉、克林霉素等9種藥物耐藥；維氏氣單胞菌對(duì)頭孢哌酮、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素等13種藥物敏感，對(duì)頭孢他啶、復(fù)方新諾明、阿米卡星等13種藥物中介，對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、萬(wàn)古霉素等10種藥物耐藥；弗氏檸檬酸桿菌對(duì)頭孢吡肟諾氟沙星、四環(huán)素等13種藥物敏感，對(duì)慶大霉素、鏈霉素、氨曲南等13種藥物中介，對(duì)氨芐西林、頭孢西叮、紅霉素等10種藥物耐藥；非O1霍亂弧菌對(duì)哌拉西林、頭孢呋辛、大觀霉素等12種藥物敏感，對(duì)頭孢唑啉、紅霉素、慶大霉素等13種藥物中介，對(duì)克林霉素、萬(wàn)古霉素、氨曲南等11種藥物耐藥。

2.5種藥物對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC和MBC

5種藥物對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC見(jiàn)表3，恩諾沙星、鏈霉素、鹽酸強(qiáng)力霉素和氟苯尼考的MIC分別為0.5、10、3、1毫克/升，其中恩諾沙星對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好，其次是氟苯尼考，鏈霉素的抑菌效果次于鹽酸強(qiáng)力霉素，磺胺甲惡唑在試驗(yàn)的藥物濃度范圍內(nèi)無(wú)抑菌作用。

抑菌效果較好的4種藥物對(duì)嗜水氣單胞菌的MBC測(cè)定結(jié)果表明：恩諾沙星、鹽酸強(qiáng)力霉素和氟苯尼考對(duì)嗜水氣單胞菌的MBC分別為1、15、3毫克/升，其中恩諾沙星對(duì)嗜水氣單胞菌的殺菌效果最好，使用1毫克/升的藥物濃度即可殺死病原嗜水氣單胞菌，其次是氟苯尼考，而鹽酸強(qiáng)力霉素的殺菌效果次于氟苯尼考；鏈霉素在試驗(yàn)濃度內(nèi)均有細(xì)菌生長(zhǎng)，表明鏈霉素對(duì)供試的嗜水氣單胞菌具有抑菌作用，試驗(yàn)濃度無(wú)殺菌作用。

3.5種藥物對(duì)維氏氣單胞菌的MIC和MBC

5種藥物對(duì)維氏氣單胞菌的MIC見(jiàn)表4，恩諾沙星、鏈霉素、鹽酸強(qiáng)力霉素和氟苯尼考的MIC分別為3、30、2、10毫克/升。其中，鹽酸強(qiáng)力霉素對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌效果最好，其次是恩諾沙星，鏈霉素的抑菌效果次于氟苯尼考，磺胺甲惡唑在試驗(yàn)的藥物濃度范圍內(nèi)無(wú)抑菌作用。

抑菌效果較好的4種藥物對(duì)維氏氣單胞菌的MBC測(cè)定結(jié)果表明：恩諾沙星和鹽酸強(qiáng)力霉素的MBC分別為15、10毫克/升。其中，鹽酸強(qiáng)力霉素對(duì)維氏氣單胞菌的殺菌效果最好，其次是恩諾沙星；鏈霉素和氟苯尼考在測(cè)試濃度內(nèi)均有細(xì)菌生長(zhǎng)，這兩種藥物對(duì)供試的維氏氣單胞菌具有抑菌作用，試驗(yàn)濃度無(wú)殺菌作用。

表2 青蝦4種病原菌對(duì)36種抗菌藥物的敏感性

表3 5種抗菌藥對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC

表4 5種抗菌藥對(duì)維氏氣單胞菌的MIC

4.5種藥物對(duì)弗氏檸檬酸桿菌的MIC和MBC

5種藥物對(duì)弗氏檸檬酸桿菌的MIC見(jiàn)表5，恩諾沙星、鏈霉素、鹽酸強(qiáng)力霉素和氟苯尼考的MIC分別為0.5、6、8、7毫克/升。其中，恩諾沙星對(duì)弗氏檸檬酸桿菌的抑菌效果最好，其次是鏈霉素，鹽酸強(qiáng)力霉素的抑菌效果次于氟苯尼考，磺胺甲惡唑在試驗(yàn)的藥物濃度范圍內(nèi)無(wú)抑菌作用。

抑菌效果較好的4種藥物對(duì)弗氏檸檬酸桿菌的MBC測(cè)定結(jié)果表明：恩諾沙星、鏈霉素和氟苯尼考的MBC分別為1、8、20毫克/升，其中，恩諾沙星對(duì)弗氏檸檬酸桿菌的殺菌效果最好，使用1毫克/升的藥物濃度即可殺死病原弗氏檸檬酸桿菌，氟苯尼考的殺菌效果次于鏈霉素；鹽酸強(qiáng)力霉素在測(cè)試濃度內(nèi)均有細(xì)菌生長(zhǎng)，表明鹽酸強(qiáng)力霉素對(duì)供試的弗氏檸檬酸桿菌具有抑菌作用，試驗(yàn)濃度無(wú)殺菌作用。

表5 5種抗菌藥對(duì)弗氏檸檬酸桿菌的MIC

5.5種藥物對(duì)非O1霍亂弧菌的MIC和MBC

5種藥物對(duì)非O1霍亂弧菌的MIC見(jiàn)表6，恩諾沙星、鏈霉素和鹽酸強(qiáng)力霉素的最小抑菌濃度分別為3、9、10毫克/升。其中，恩諾沙星對(duì)非O1霍亂弧菌的抑菌效果最好，其次是鏈霉素，鹽酸強(qiáng)力霉素的抑菌效果次于鏈霉素，磺胺甲惡唑和氟苯尼考在試驗(yàn)的藥物濃度范圍內(nèi)均無(wú)抑菌作用。

表6 5種抗菌藥物對(duì)非O1霍亂弧菌的MIC

抑菌效果較好的3種藥物對(duì)非O1霍亂弧菌的MBC測(cè)定結(jié)果表明：恩諾沙星、鏈霉素和鹽酸強(qiáng)力霉素的MBC分別為5、15、30毫克/升，其中，恩諾沙星對(duì)非O1霍亂弧菌的殺菌效果最好，其次是鏈霉素，鹽酸強(qiáng)力霉素的殺菌效果次于鏈霉素。

三、討論

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，集約化水平不斷擴(kuò)大，病害問(wèn)題也日趨嚴(yán)重，養(yǎng)殖戶習(xí)慣于用抗菌藥物進(jìn)行病害防治，然而，藥物濫用導(dǎo)致的藥殘問(wèn)題也日益顯現(xiàn)，嚴(yán)重影響了我國(guó)水產(chǎn)品安全。為提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全，藥效學(xué)研究尤為重要，針對(duì)特定病原選擇有效的藥物，精準(zhǔn)用藥，防止藥物濫用，可有效減少殘留，保障水產(chǎn)品安全。

為指導(dǎo)青蝦疾病防治的精準(zhǔn)用藥，本研究開展了青蝦病原菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的敏感性測(cè)定，并采用試管稀釋法測(cè)定了養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的5種抗菌藥物對(duì)青蝦4種病原菌的MIC和MBC。在5種常見(jiàn)抗菌類藥物中，恩諾沙星對(duì)青蝦病原菌的殺菌效果最好，可在較低濃度下有效殺滅嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和非O1霍亂弧菌。鹽酸強(qiáng)力霉素對(duì)維氏氣單胞菌的殺菌效果最好，該抗生素通過(guò)抑制細(xì)菌肽鏈的增長(zhǎng)從而影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，亦具有廣譜抗菌作用，然而目前對(duì)于鹽酸強(qiáng)力霉素藥效學(xué)的研究比較缺乏。在5種抗菌藥物中，磺胺甲惡唑?qū)?種青蝦致病菌的殺菌效果都較差，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)均有菌體生長(zhǎng)，這可能與磺胺類抗生素的濫用及用藥量不合理導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。目前已有大量研究結(jié)果表明，水產(chǎn)動(dòng)物源細(xì)菌對(duì)磺胺類藥物已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛的耐藥性，如溫和氣單胞菌、羅非魚無(wú)乳鏈球菌，且多種細(xì)菌對(duì)其耐藥能力不斷增強(qiáng)，給畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

抗生素是治療細(xì)菌性疾病最有效的方法，然而養(yǎng)殖過(guò)程中濫用、誤用及不規(guī)范使用導(dǎo)致的藥物殘留及其對(duì)消費(fèi)者和生態(tài)環(huán)境的影響不容忽視，因此在使用藥物的過(guò)程中，要嚴(yán)格控制藥物用量，將用量控制在最小殺菌濃度以上的同時(shí)，以盡可能少的藥物達(dá)到殺菌效果，做到準(zhǔn)確用藥和減量用藥，推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展。