LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅱ)

陳峰，李海龍，賴偉勇，譚銀豐

(1.海南省藥用植物研究與開發(fā)重點(diǎn)實驗室，海南?？?571101；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?571101)

LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅱ)

陳峰1，2，李海龍1，2，賴偉勇1，2，譚銀豐1，2

(1.海南省藥用植物研究與開發(fā)重點(diǎn)實驗室，海南海口 571101；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?571101)

目的研究大鼠灌胃縮泉膠囊后，益智黃酮(楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素、山奈素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚)二相結(jié)合產(chǎn)物的酶水解。方法雄性Sprague-Dawley大鼠膽管插管手術(shù)完畢后經(jīng)灌胃給予縮泉膠囊(1.64 g/kg)后收集0～4 h膽汁。膽汁樣品經(jīng)β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH為5的乙酸鈉緩沖液)處理后，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)進(jìn)行分析。結(jié)果益智黃酮的葡萄糖醛酸結(jié)合物在酶水解處理后，代謝物的色譜峰消失，釋放出黃酮的原形物質(zhì)形式。雖然脫甲基反應(yīng)后形成葡萄糖醛酸結(jié)合物也被水解，但并未能檢測到脫甲基產(chǎn)物。結(jié)論β-葡萄糖醛酸水解酶處理可進(jìn)一步確定益智黃酮在大鼠膽汁中的物質(zhì)形式，也為定量分析奠定基礎(chǔ)。

縮泉膠囊；益智；黃酮；酶水解；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

尿失禁主訴為尿液不自主的流出，是一種常見的、令人苦惱的疾病，給患者的生活質(zhì)量帶來不利影響[1]。尿失禁有多種致病因素，如膀胱功能障礙(過度活動或活動低下)、物理性的梗阻、感染或者藥物的副作用(如咖啡因)。某些較為嚴(yán)重的疾病如癌癥、糖尿病、中風(fēng)、帕金森氏疾病、多發(fā)性硬皮病等也可引起尿失禁。根據(jù)全國六大區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果推斷，中國女性尿失禁患者平均發(fā)病率為30.9%，且年齡越大發(fā)病率越高。目前，人們對尿失禁的報道、診斷和治療顯著不足，對尿失禁的重視程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。我國已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會，老年人口所占比例日趨增加，尿失禁問題將對個人、家庭及社會帶來巨大困擾。

尿失禁的藥物治療越來越受到重視，化學(xué)藥物(如托特羅定、達(dá)非那新和奧昔布寧等)在整個藥物治療市場份額中占據(jù)主導(dǎo)地位，而縮泉丸及改進(jìn)制劑縮泉膠囊是為數(shù)不多的治療尿失禁的中藥品種?？s泉丸源于宋代的《魏氏家藏方》[2]，由益智仁、烏藥和山藥三味中藥組成，用于治療多尿、尿頻、遺尿，被2010版《中國藥典》一部收載[3]?？s泉丸在國內(nèi)9家企業(yè)生產(chǎn)(其中8個為水丸，1個為膠囊)，其中縮泉膠囊在2012年的銷售額達(dá)到5 000萬元。縮泉丸多成分體內(nèi)過程研究較為薄弱，機(jī)體如何處置縮泉丸中的化學(xué)物質(zhì)尚待闡明。我們分析了縮泉丸中主要成分的含量[4]，并對大鼠灌胃縮泉丸后主要成分益智酮甲在大鼠系統(tǒng)中的暴露進(jìn)行了初步研究[5]?？s泉丸中黃酮類物質(zhì)的膽汁排泄研究有助于我們了解這些物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，作為這項研究的第一部分，本課題組已經(jīng)測定了大鼠膽汁中的二相結(jié)合產(chǎn)物，本文主要探討這些二相代謝產(chǎn)物的酶水解。

1 材料與方法

1.1 試藥β-葡萄糖醛酸水解酶(HP-2型，來自海曼蝸牛，每毫升含有100 000 U的β-葡萄糖醛酸水解酶和7 500 U的硫酸酯酶水解酶)購自Sigma公司。其他同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)[6]。

1.2 實驗動物、給藥及樣品采集同“LC-MS/ MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)。

1.3 膽汁樣品的酶水解[7]取100 μl膽汁樣品，加入200 μl β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH為5的乙酸鈉緩沖液)，再加入50 μl抗壞血酸(5 mg/ml)，輕輕振搖后，在水浴上37°C孵育60 min。孵育結(jié)束后，加入1000 μl乙酸乙酯放在漩渦振蕩器上震蕩5 min，結(jié)束后將樣品至于離心機(jī)中，離心10 min，吸取上清液900 μl，在N2下吹干，加入50 μl甲醇，在漩渦振蕩器上震蕩5 min，再離心10 min，吸取40 μl樣品溶液置于樣品瓶的內(nèi)襯管中，進(jìn)樣量為10 μl。

1.4 LC-MS/MS分析方法色譜條件和質(zhì)譜條件同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)。

2 結(jié)果

2.1 白楊素二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后白楊素及其可能的代謝產(chǎn)物見圖1。經(jīng)水解后，大鼠膽汁中處于結(jié)合狀態(tài)的白楊素被釋放出來(保留時間為5.94 min)，原來膽汁中的白楊素單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時間為4.14 min)和雙葡萄醛酸代謝物(保留時間為3.11 min)的色譜峰消失。

圖1 大鼠膽汁中白楊素二相代謝產(chǎn)物的水解

2.2 楊芽黃素二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后楊芽黃素及其可能的代謝產(chǎn)物見圖2。膽汁中楊芽黃素的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時間為4.84 min)的色譜峰消失，釋放出楊芽黃素的原形產(chǎn)物(保留時間為7.06 min)。保留時間為5.23 min的色譜峰結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步的研究。

圖2 大鼠膽汁中楊芽黃素二相代謝產(chǎn)物的水解

2.3 伊砂黃素二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后伊砂黃素及其可能的代謝產(chǎn)物見圖3和圖4。膽汁樣品經(jīng)甲醇沉淀后未出現(xiàn)伊砂黃素原形物質(zhì)形式，但酶水解后伊砂黃素從結(jié)合物中被釋放出來(保留時間為7.30 min)。保留時間為4.28 min的伊砂黃素單葡萄糖醛酸化代謝物以及保留時間為3.79 min雙葡萄醛酸代謝物的色譜峰消失，但5.29 min的色譜峰在酶水解時未完全消失。由圖4可知，保留時間為4.62 min和4.84 min的單葡萄糖醛酸結(jié)合物以及保留時間為3.16 min雙葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物的色譜峰在酶水解處理后均消失，但并未檢測到伊砂黃素的脫甲基化產(chǎn)物。

圖3 大鼠膽汁中伊砂黃素二相代謝產(chǎn)物的水解

圖4 大鼠膽汁中伊砂黃素脫甲基后的二相代謝產(chǎn)物的水解

2.4 芹菜素-4'，7-二甲氧醚二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后芹菜素-4'，7-二甲氧醚及其可能的代謝產(chǎn)物見圖5。經(jīng)酶水解后，膽汁中的硫酸酯化的代謝物(保留時間為3.29 min)和芹菜素-4'，7-二甲氧醚的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時間為5.11 min)均消失，此時的膽汁樣品可以檢測到芹菜素-4'，7-二甲氧醚的原形物質(zhì)形式(保留時間為7.22 min)。由圖6可知，在膽汁樣品中未發(fā)現(xiàn)芹菜素-4'，7-二甲氧醚的脫甲基化產(chǎn)物，芹菜素-4'，7-二甲氧醚脫甲基后所形成的二相結(jié)合產(chǎn)物，包括單葡萄糖醛酸結(jié)合物(保留時間為4.28 min)和雙葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物(保留時間為3.25 min和3.79 min)在酶水解處理后均消失。保留時間為5.29 min單葡萄糖醛酸結(jié)合物在該樣品中依然可以檢測到。但是，水解后的樣品中未檢測到芹菜素-4'，7-二甲氧醚的脫甲基化產(chǎn)物。

圖6 大鼠膽汁中芹菜素-4’,7-二甲氧醚脫甲基后二相代謝產(chǎn)物的水解

2.5 山奈素二相代謝產(chǎn)物的水解大鼠灌胃縮泉膠囊后，大鼠膽汁樣品經(jīng)β-葡萄醛酸水解酶水解后山奈素及其可能的代謝產(chǎn)物見圖7。膽汁樣品經(jīng)酶水解處理后，山奈素的單葡萄糖醛酸化代謝物(保留時間為4.80 min)和雙葡萄醛酸代謝物(保留時間為3.16 min)的色譜峰均消失，在膽汁中發(fā)現(xiàn)山奈素的原形物質(zhì)形式(保留時間為6.15 min)，但濃度較低。保留時間為6.05 min的色譜峰結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步的研究。

圖7 大鼠膽汁中山奈素二相代謝產(chǎn)物的水解

3 討論

二相代謝產(chǎn)物(如葡萄糖醛酸結(jié)合物、硫酸酯結(jié)合物等)的水解可采用酸水解或酶水解的方法進(jìn)行。酸水解時，將樣品和酸溶液在一定的溫度下反應(yīng)一定時間，導(dǎo)致酯鍵斷裂。酸水解受酸的種類、濃度、水解溫度和水解時間的影響。酶水解相對比較溫和，但比較高效，實驗費(fèi)用也比較高。酶的來源、酶濃度、水解溫度和時間的也影響水解效果[8]?？偟膩碚f，藥物二相代謝產(chǎn)物的水解首選酶水解的方法。因此本文采用酶水解的方法，研究益智黃酮二相代謝產(chǎn)物的水解。

白楊素、楊芽黃素、伊砂黃素、芹菜素-4'，7-二甲氧醚和山奈素的葡萄糖醛酸結(jié)合物在酶水解后釋放出相應(yīng)的苷元。因為伊砂黃素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚去單甲基后的單葡萄糖醛酸結(jié)合物有不同的結(jié)合位置，各有兩個色譜峰，水解后其中一個(保留時間為4.28 min)消失，另一色譜峰(保留時間為5.29 min)依然可測。另外，伊砂黃素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚脫甲基后形成的二相代謝產(chǎn)物在酶處理后也消失，但相應(yīng)的脫甲基后的黃酮苷元卻檢測不到。這些現(xiàn)象值得深入研究。

綜上所述，我們通過研究發(fā)現(xiàn)膽汁中益智黃酮葡萄糖醛酸結(jié)合物被β-葡萄糖醛酸水解酶水解，釋放出相應(yīng)的苷元，進(jìn)一步確定了益智黃酮在大鼠膽汁中的物質(zhì)形式，也為這些黃酮苷元的定量分析奠定基礎(chǔ)。

[1]Robinson D,Cardozo L.New drug treatments for urinary incontinence[J].Maturitas,2010,65(4):340-347.

[2]孫世發(fā).縮泉丸方來源淺析[J].中醫(yī)雜志,1994,35(7):439.

[3]國家藥典委員會.《中國藥典》2010版.一部.中國醫(yī)藥科技出版社,2010:1218.

[4]Chen F,Li HL,Li YH,et al.Quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation SuoQuan formulae by ultra fast high performance liquid chromatography/quadrupole tandem mass spectrometry[J].Chem Cent J,2013,7(1):131.

[5]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Validated method to measure yakuchinone A in plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in rats[J].Chem Cent J,2014,8(1):2.

[6]Qing ZJ,Yong W,Hui LY,et al.Two new natural products from the fruits of Alpinia oxyphylla with inhibitory effects on nitric oxide production in lipopolysaccharideactivated RAW264.7 macrophage cells[J].Arch Pharm Res,2012,35(12):2143-2146.

[7]Shia CS,Hou YC,Tsai SY,et al.Differences in pharmacokinetics and ex vivo antioxidant activity following intravenous and oral administrations of emodin to rats[J].J Pharm Sci,2010,99(4): 2185-2195.

[8]Wang LX,Yuan WW,Scott R,et al."Hydrolysis of PhaseⅡConjugates for LC-MS Bioanalysis of Total Parent Drugs."[J]Handbook of LC-MS Bioanalysis:Best Practices,Experimental Protocols,and Regulations,2013,1:471-477.

Identification of known chemicals and their metabolites in rat plasma after oral administration of SuoQuan capsules using LC-MS/MS(Ⅱ).

CHEN Feng1,2,LI Hai-long1,2,LAI Wei-yong1,2,TAN Yin-feng1,2.1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study enzymatic hydrolysis of the flavonoids'(tectochrysin,izalpinin,chrysin, kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)metabolites in rat bile after oral administration of SuoQuan capsules.MethodsCannulas were surgically inserted into the bile duct of male Sprague-Dawley rats(n=3)under anesthesia(pentobarbital,50 mg/kg,i.p.),and the bile was collected for 4 h after oral administration of Suoquan capsules(1.64 g/kg,suspended in 0.5%w/v sodium carboxymethycellulose).After β-glucuronidase(1000 units/ml in pH 5 acetate buffer)treatment,these phaseⅡmetabolites in rat bile samples were hydrolyzed and their aglycones were analyzed using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)with selected reaction monitoring mode.ResultsAfter β-glucuronidase treatment,the mono-or di-glucuronide metabolites of Yizhi flavonoids(tectochrysin,izalpinin,chrysin,kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)could not be detected.On the contrast, the corresponding aglycones were librated from their conjugated forms.However,the O-demethylation metabolites of izalpinin and apigenin-4',7-dimethylether could not be measured,although their glucuronidated conjugates had been found in the rat bile samples.ConclusionThe enzymatic hydrolysis via β-glucuronidase is helpful for the identification of Yizhi flavonoids'phaseⅡmetabolites.Meanwhile,this paper also lays a partial foundation for quantitative analysis of these aglycones.

Suoquan capsules;Alpinia oxyphylla(Yizhi);Flavonoids;Enzymatic hydrolysis;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）16—2347—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0918

2014-03-27)

海南省自然科學(xué)基金項目(編號：812189，813188)

譚銀豐。E-mail：112552819@qq.com