UPLC-MS法測定花椒及花椒制品中羅丹明B的含量

梁偉龍 王斌 林欽賢 全玉錦 鄧健輝 蕭錫均 郝建新

摘要?[目的]建立一種花椒及花椒制品中羅丹明B的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS）的測定方法。[方法]1%甲酸溶液-甲醇（體積比為1∶1）溶液提取樣品后，經固相萃?。⊿PE）柱凈化，采用Strata-X SPE柱分離，以乙腈和乙酸銨水溶液（含體積分數為0.1%的甲酸）為流動相進行梯度洗脫，電噴霧正離子多反應監(jiān)測（MRM）模式下進行定量定性分析。[結果]羅丹明B在0.5～50.0 ng/mL與峰面積呈良好的線性關系，加標回收率為96.60%～106.03%，相對標準偏差為0.83%～3.37%。[結論]該方法具有處理簡單、靈敏度高等特點，可用于花椒及花椒制品中羅丹明B的定性定量分析。

關鍵詞?羅丹明B;UPLC-MS;花椒;含量測定

中圖分類號?TS207.3文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）02-0210-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.061

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of Rhodamine B in Zanthoxylum bungeanumand Zanthoxylum bungeanumProducts by UPLC-MS

LIANG Wei-long1，2，WANG Bin1，LIN Qin-xian1 et al?（1.Xiangxue Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510663;2.Longde Liupanshan Chinese Medicine Resources Development Co.，Ltd.，Guyuan，Ningxia 756300）

Abstract?[Objective]To establish a method for the determination of rhodamine B in Zanthoxylum bungeanumand Zanthoxylum bungeanumproducts by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS）.[Method]The method with 1% formic acid water solution∶methanol （volume ratio 1∶1） solution extraction samples，by solid phase extraction （SPE） column purification，using Strata-X solid phase extraction column，acetonitrile and ammonium acetate （containing 0.1% formic acid） as mobile phase with gradient elution，electrospray ionization in positive ion multiple reaction monitoring （MRM the quantitative and qualitative analysis of mode）.[Result]Rhodamine B showed a good linear relationship with peak area at 0.5-50.0 ng/mL.The recovery rates were 96.60%-106.03%，and the relative standard deviations were 0.83%-3.37%.[Conclusion]The method has many characteristics，such as simple treatment，high sensitivity，etc.The rhodamine B in Zanthoxylum bungeanumand Zanthoxylum bungeanumproducts will suitable for the qualitative and quantitative analysis.

Key words?Rhodamine B;UPLC-MS;Zanthoxylum bungeanum;Content determination

花椒為蕓香科植物青椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.）或花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）的干燥成熟果皮，其味辛，溫，具有溫中止痛、殺蟲止癢的功效[1]?；ń吩谖覈兄凭玫乃幱煤褪秤脷v史，可作為多種食品的烹調加工調味品，為我國藥食兩用的原料之一[2]。但近年來關于花椒染色的報道層出不窮[3-8]，嚴重影響中藥療效及患者生命健康，讓本就已經讓人懷疑療效的中藥材以及中醫(yī)行業(yè)更加“劣跡斑斑”。研究表明，羅丹明B是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料[9]，與辣椒、花椒等調味品的天然顏色相似，且其染色能力較強、不易褪色、價格低廉，而使不法商販們經常將其用于辣椒制品、花椒等產品的染色，以次充好。

目前，羅丹明B的檢測方法有UV-Vis、HPLC、LC-MS等[10-13]，但存在定性能力不足、方法專屬性差、抗干擾能力差、耗時較長、假陽性較高等問題，現有方法不能滿足大批量樣品的分析測試需要，因此筆者基于固體萃取前處理技術，采用UPLC-MS建立一種花椒及花椒制品中羅丹明B的檢測方法。

1?材料與方法

1.1?儀器?TQ型超高效液相色譜-串聯質譜儀（Waters）、20-Port型固相萃取裝置（Waters）、3-18K型高速冷凍離心

機（SIGMA）、UGC-24W型氮吹儀（北京優(yōu)晟聯合科技有限公司）、JP-C600型超聲波清洗機（廣州市吉普超聲波電子設備有限公司）、DT-500E型電子天平（常熟市金羊砝碼儀器有限公司）、PL203型分析天平（梅特勒-托利多）、MS3 basic型渦旋混合器（德國艾卡）、HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2?試材?羅丹明B（純度95.0%，Dr Ehrenstorfer）;正己烷（HPLC，TEDIA）;甲醇（HPLC，TEDIA）;乙腈（HPLC，TEDIA）;其他試劑均為分析純;超純水;Oasis MCX固相萃取柱、Strata-X SPE固相萃取柱、C18 SPE固相萃取柱，使用前全部依次用3 mL甲醇、3 mL超純水進行預處理;市售花椒及花椒制品共20份，經廣州市香雪制藥股份有限公司康志英高級工程師鑒定為蕓香科植物青椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.）或花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）的干燥成熟果皮/果皮加工品。

1.3?方法

1.3.1?色譜條件。Waters BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相乙腈（A）和5 mol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）（B）;按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫，流速0.3 mL/min;柱溫為35 ℃;進樣量為5 μL;離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;采集方式：多反應監(jiān)測（MRM）;脫溶劑氣流速：800 L/h;脫溶劑氣溫度：500 ℃;電離源電壓：2.82 kV;氣簾氣流速：50 L/h。羅丹明B母離子m/z：443.1;子離子對m/z：443.1/355.0;定量離子m/z：355.0;錐孔電壓：70.0 eV;碰撞能量：60.0 eV。

1.3.2?標準儲備液的制備。取羅丹明B標準品適量，精密測定，加甲醇制成100 μg/mL的標準儲備液，備用。

1.3.3?標準工作液的制備。精密量取“1.3.2”標準儲備液，用甲醇制成分別含0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/L的溶液，即得。

1.3.4?供試品溶液的制備。取本品粉末（過3號篩）約2 g，精密測定，置50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 1%甲酸溶液-甲醇（體積比為1∶1）提取溶液，在渦旋混合器上渦旋混勻，超聲提取30 min，4 ℃下離心5 min（8 000 r/min），取上清液轉移至另一50 mL聚丙烯離心管中，重復操作，合并上清液，混勻備用。將收集到的上清液過經過預處理后的Strata-X SPE柱，柱中液體保持2 mm左右時進樣，流速為1滴/s，待樣液完全流出后，用3 mL淋洗液、3 mL水進行淋洗，再用5 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液，氮氣吹至近干，用甲醇定容至1 mL，渦旋混勻，即得。

1.3.5?線性關系考察。分別精密吸取“1.3.3”不同濃度的標準工作液5 μL，按“1.3.1”的色譜條件進樣分析，記錄羅丹明B的峰面積，以進樣量（X）為橫坐標峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。

1.3.6?精密度考察。取濃度為10.0 ng/mL的標準工作液，精密吸取5 μL，按“1.3.1”的色譜條件進樣分析，重復進樣6次，分別記錄羅丹明B的峰面積。

1.3.7?加標回收率試驗。準確稱取相同的空白陰性花椒試樣5份，分別加入1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 5個不同水平濃度的羅丹明B標準溶液，平行測定5次，計算回收率。

1.3.8?樣品測定。分別稱取花椒及花椒制品的樣品，按“1.3.4”方法制備供試品溶液，每個樣品平行3次，進樣測定，以均值為結果，計算樣品中羅丹明B的含量。

2?結果與分析

2.1?對照品與樣品的UPLC-MS色譜圖?從圖1可以看出，相同的分析條件下，樣品溶液在對照品溶液相同出峰時間（t=3.0 min）中有一個峰出現，分離度良好，且空白無干擾，說明此條件適合羅丹明B的含量測定。

2.2?線性關系考察?以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得出羅丹明B的回歸方程為Y=3 458X-42.939（R2=0.999 7），表明在0.5～50.0 ng/mL濃度范圍內具有較好的線性關系。

2.3?精密度考察?按“1.3.6”的方法重復進樣6次，記錄羅丹明B的峰面積，結果發(fā)現羅丹明B峰面積的RSD為1.93%，表明儀器的精密度良好。

2.4?加標回收率試驗?按“1.3.7”方法進行操作，分別加入不同水平濃度的羅丹明B標準溶液，平行測定5次，結果發(fā)現（表2），羅丹明B的回收率為96.60%～106.03%，RSD為0.83%～3.37%。表明該方法回收率良好。

2.5?羅丹明B含量測定

將不同批次的供試品溶液在“1.3.1”的色譜條件下進行分析，通過對比樣品與標準品的保留時間和特征碎片離子，對樣品進行定性。利用標準品的色譜峰面積和濃度關系，建立校正曲線，對樣品進行定量分析。由分析結果可得，從市場購買的20批不同產地、不同規(guī)格的花椒及花椒制品中，僅檢出1個陽性樣品，含量為10 μg/kg，整體產品質量狀況良好。由于檢測含量較低，人為添加的可能性較低，可能是由于花椒在生產過程中被污染而帶入。

3?結論與討論

該試驗考察了超聲提取、回流提取、液-液萃取的方法，超聲提取操作簡便，所需時間較短，提取后直接用離心的方式對提取液進行初步凈化處理，與普通的過濾方法相比，不僅加快了過濾速度，而且減少了待測組分的損失，提高了回收率，因此該試驗選擇超聲提取。提取溶劑考察了正己烷、乙腈和1%甲酸溶液-甲醇（體積比為1∶1）3種提取試劑，正己烷的毒性相對較小，但其提取程度較低;乙腈和1%甲酸溶液-甲醇（體積比為1∶1）2種溶液的提取程度相差不大，但乙腈的毒性強于甲醇，且有較強的特殊性氣味，因此，選用1%甲酸溶液-甲醇（體積比為1∶1）溶液作為提取試劑較為合理、安全。另外，凈化柱的選擇上，不同的凈化柱價格相差不大，但Strata-X SPE柱對1%甲酸溶液-甲醇（體積比為1∶1）提取液中的目標化合物的保留程度較Oasis MCX SPE柱和C18 SPE柱好，因此選擇Strata-X SPE柱作為凈化柱。

此次研究通過采用UPLC-MS法測定花椒及花椒制品中羅丹明B的含量，結果表明，該方法前處理簡單快速、高靈敏度、準確性好、分析時間短及可操作性強，可用于大批次花椒及花椒制品中羅丹明B的定性定量分析。

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