番石榴葉有機(jī)溶劑提取物清除過(guò)氧自由基能力及抑制酪氨酸酶活力研究

葉偉

摘要?[目的]研究番石榴葉不同有機(jī)溶劑提取物對(duì)自由基清除能力以及對(duì)酪氨酸酶活力的抑制作用，可為番石榴葉在抗氧化抗衰老方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。[方法]采用乙醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮4種不同有機(jī)溶劑并采取超聲、浸提及萃取的方法提取番石榴葉粗提物。采用鄰苯三酚自氧化法和L-DOPA法分別測(cè)定粗提物對(duì)過(guò)氧自由基的清除作用和酪氨酸酶活性的抑制作用。[結(jié)果]乙醇、丙酮和乙酸乙酯番石榴葉提取物清除過(guò)氧自由基的IC50值分別為47.1、35.5和21.2 μg/mL;而丙酮提取物和乙酸乙酯提取物抑制酪氨酸酶活性的IC50值分別為165.3和115.9 μg/mL。[結(jié)論]番石榴葉提取物具有開(kāi)發(fā)作為抗氧化抗衰老藥物以及酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞?番石榴葉;粗提物;過(guò)氧自由基;酪氨酸酶活性

中圖分類號(hào)?R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）02-0186-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.054

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Scavenging Peroxy Radical Activity and Inhibitory Effect on Tyrosinase of Guava Leaves Extract

YE Wei

（Lingnan Normal University， Zhanjiang， Guangdong 524048）

Abstract?[Objective]The effects of different organic solvent extracts on free radical scavenging and tyrosinase activity of guava leaves were studied. [Method]The crude extract of guava leaves was extracted by ultrasonic， immersion and extraction methods using four different organic solvents （ethanol， ethyl acetate， petroleum ether and acetone）.The scavenging effect of peroxy free radicals and inhibition of tyrosinase activity of crude extracts were determined by catechol autooxidation method and l-dopa method respectively. [Result] The IC50 values of ethanol， acetone and ethyl acetate guava leaf extracts for scavenging peroxyl radicals were 47.1， 35.5 and 21.2 μg/mL， respectively;but the IC50 values for the inhibition of tyrosinase activity by acetone extract and ethyl acetate extract were 165.3 and 115.9 μg/mL， respectively.[Conclusion]The extract of guava leaf has the prospect of developing as antioxidant and anti-aging drug and tyrosinase inhibitor.

Key words?Guava leaves;Crude extract;Peroxy radical;Tyrosine activity

番石榴為桃金娘科植物番石榴（Psidium guajava Linn.）的葉或果，主要分布在福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、四川和云南等地。干燥幼果具有收斂止瀉、止血之功效，常用于瀉痢無(wú)度、崩漏。成熟果實(shí)具有健脾消積、澀腸止瀉之功效，常用于食積飽脹、疳積、腹瀉、痢疾、脫肛、血崩[1]。番石榴葉具有多方面的藥理作用，具有燥濕健脾、清熱解毒之功效[2]，常用于瀉痢腹痛、食積腹脹、消渴病、齒齦腫痛、風(fēng)濕痹痛、濕疹臁瘡、疔瘡腫毒、跌打腫痛、外傷出血、蛇蟲(chóng)咬傷。鮮葉具有止血之功效，常用于跌打損傷、外傷出血、臁瘡久不愈合、提高免疫力、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛和抗氧化抗衰老的功效[3-4]。

許多研究表明，番石榴葉具有抗氧化功能。趙玉靜等[5]從番石榴葉醇提物中分離獲得了6種黃酮類化合物，并且證明了其具有抗氧化活性。但番石榴葉中是否還有其他具有顯著抗氧化活性的天然產(chǎn)物，仍需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。對(duì)番石榴葉不同類型提取物的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以為開(kāi)發(fā)抗氧化抗衰老類藥物奠定基礎(chǔ)[6-7]。而對(duì)過(guò)氧自由基清除能力是不同物質(zhì)抗氧化能力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，不同的抗氧化劑包括過(guò)氧化物歧化酶（SOD）等可采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定對(duì)過(guò)氧自由基的清除能力，以評(píng)價(jià)其抗氧化抗衰老的功效。酪氨酸酶的活力過(guò)強(qiáng)，會(huì)加速有機(jī)體的衰老過(guò)程，通過(guò)抑制酪氨酸酶的活力能延緩衰老進(jìn)程。筆者采用不同的有機(jī)溶劑提取番石榴葉的代謝產(chǎn)物，并用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定粗提物對(duì)過(guò)氧自由基的清除能力，檢測(cè)番石榴葉粗提物抑制酪氨酸酶的活力，以期為農(nóng)業(yè)作物的抗氧化活性和抗氧化抗衰老

制劑的研究提供借鑒。

1?材料與方法

1.1?試材?番石榴葉采樣于廣東省湛江市。酶（酪氨酸酶）、鄰苯三酚和3，4-二羥基苯丙氨酸（3，4-Dihydroxy-L-phenylalanine，L-dopa）均購(gòu)自Sigma公司;其他試劑購(gòu)自天津大茂試劑廠。

1.2?主要儀器?旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Heidolph ML G6購(gòu)自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海恒益科技有限公司;超聲波清洗儀購(gòu)自寧波新芝有限公司;Multiskan酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo scientific公司。

1.3?方法

1.3.1?不同溶劑的番石榴葉提取物制備。

1.3.1.1?乙醇提取物的制備。將番石榴葉在液氮條件下充分磨碎，用80%乙醇在超聲波頻率為25 kHz下超聲提取2次，每次30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃濃縮至干即得到番石榴葉乙醇粗提物浸膏。

1.3.1.2?乙酸乙酯提取物的制備。將番石榴葉液氮充分研磨，超聲破碎，用乙酸乙酯80 ℃萃取 2次，每次1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60 ℃將有機(jī)溶劑蒸發(fā)完全，即得到番石榴葉丙酮粗提物浸膏。

1.3.1.3?丙酮提取物的制備。將番石榴葉在液氮中充分研磨，用丙酮于60 ℃萃取2次，每次1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸發(fā)完全，即得到番石榴葉丙酮粗提物浸膏。

1.3.1.4?石油醚提取物的制備。將番石榴葉液氮磨碎，用石油醚冷浸2次，每次24 h，過(guò)濾，8 000 r/min離心10 min，取上清，合并提取液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸發(fā)完全，即得到番石榴葉石油醚提取物浸膏。

1.3.2?番石榴葉提取物清除過(guò)氧自由基能力的測(cè)定。

1.3.2.1?番石榴葉提取物清除過(guò)氧自由基能力的測(cè)定。

采用鄰苯三酚自氧化法方法[8-9]，將無(wú)水乙醇加入番石榴葉有機(jī)提取物和維生素C中，配制成濃度為400 μg/mL溶液。鄰苯三酚用無(wú)水乙醇配制成0.2 mmol/L的溶液。加100 μL有機(jī)溶劑提取物溶液至96孔板，然后加入等濃度過(guò)氧自由基溶液，以無(wú)水乙醇作為陰性對(duì)照組，以維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組，在酶標(biāo)儀中30 ℃條件溫育30 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)溶液320 nm處的吸光度（A），計(jì)算不同有機(jī)溶劑提取物對(duì)過(guò)氧自由基的清除率[9]：

清除率=[1-（A樣品組/陽(yáng)性組-A背景組）/A陰性組]×100%（1）

1.3.2.2?不同濃度的番石榴葉提取物清除過(guò)氧自由基能力的測(cè)定。

將番石榴葉有機(jī)溶劑提取物溶液用無(wú)水乙醇稀釋至400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL，按“1.3.2.1”方法反應(yīng)，用酶標(biāo)儀分析反應(yīng)溶液320 nm處的吸光度，計(jì)算番石榴葉有機(jī)溶劑提取物對(duì)過(guò)氧自由基的清除率，并計(jì)算對(duì)其過(guò)氧自由基清除的IC50值[9]。

1.3.2.3?番石榴葉提取物在不同作用時(shí)間下清除自由基能力的測(cè)定。

將各提取物溶液用乙酸乙酯溶液稀釋至200 μg/mL，按“1.3.2.1”方法測(cè)吸光度，每隔10 min測(cè)1次，共測(cè)7次，分析番石榴葉各種有機(jī)溶劑提取物作用不同時(shí)間對(duì)其清除能力的影響。

1.3.3?番石榴葉提取物抑制酪氨酸酶活性的測(cè)定。

參照二酚酶活力的測(cè)定方法[9]，將番石榴葉各提取物用DMSO溶解，然后用pH 7.4的PBS緩沖液分別稀釋至濃度為2 000、1 000、500、200和100 μg/mL，酪氨酸酶用pH 7.4的PBS緩沖液配成10 U/mL酶液，L-dopa用PBS配制成10 mmol/L溶液。取160 μL L-dopa于96孔板，加20 μL各濃度番石榴葉有機(jī)溶劑提取物及20 μL酪氨酸酶溶液，以PBS緩沖液代替酪氨酸酶溶液作為樣品組，以PBS緩沖液代替提取物溶液作為空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)箱溫育30 min，用Multiska酶標(biāo)儀測(cè)定96孔板各個(gè)樣品于475 nm處的吸光度（A），按以下公式計(jì)算番石榴葉各有機(jī)溶劑提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率，并計(jì)算IC50值[9]。

抑制率=[1-（A樣品組/陽(yáng)性組-A空白組）/A陰性組]×100%（2）

2?結(jié)果與分析

2.1?番石榴葉提取物清除過(guò)氧自由基的能力

通過(guò)鄰苯三酚自氧化法分析，番石榴葉的不同有機(jī)溶劑提取物在200 μg/mL時(shí)有很強(qiáng)的過(guò)氧自由基的清除能力，其清除率均超過(guò)90%，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和丙酮提取物對(duì)過(guò)氧自由基的清除率分別為92.5%±0.6%、96.8%±0.7%、93.9%±0.3%。而番石榴葉石油醚提取物則對(duì)過(guò)氧自由基的清除作用很弱，其清除率僅為7.9%±0.5%。

2.2?不同濃度的番石榴葉提取物清除過(guò)氧自由基能力分析

酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果表明（表1），番石榴葉不同有機(jī)溶劑提取物對(duì)過(guò)氧自由基的清除能力存在較大差異，其清除過(guò)氧自由基的能力從弱到強(qiáng)依次為乙酸乙酯提取物、丙酮提取物、乙醇提取物。另外，不同溶劑的番石榴葉提取物對(duì)自由基的清除率與其濃度呈線性相關(guān)。經(jīng)計(jì)算，乙醇、丙酮和乙酸乙酯番石榴葉提取物清除過(guò)氧自由基的IC50值分別為47.1、35.5和21.2 μg/mL。

2.3?番石榴葉提取物在不同作用時(shí)間下對(duì)過(guò)氧自由基的清除能力

從表2可以看出，200 μg/mL番石榴葉各有機(jī)溶劑提取物對(duì)過(guò)氧自由基清除能力隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，作用30 min時(shí)，其對(duì)過(guò)氧自由基清除率在75%～85%，當(dāng)作用30 min后，各提取物對(duì)過(guò)氧自由基的清除率在85%左右。

2.4?番石榴葉提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

從表3可以看出，番石榴葉的丙酮提取物和乙酸乙酯提取物為200 μg/mL時(shí)，對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率超過(guò)50%，其IC50值分別為165.3和115.9 μg/mL，乙醇提取物和石油醚提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用則不明顯。

3?結(jié)論與討論

為了分析番石榴葉的抗氧化活性，該研究采取不同有機(jī)溶劑對(duì)番石榴葉進(jìn)行了提取，并對(duì)其清除過(guò)氧自由基的能力和抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，不同有機(jī)溶劑提取的番石榴葉提取物對(duì)過(guò)氧自由基的清除能力存在較大差異。乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物清除過(guò)氧自由基能力較強(qiáng)，而石油醚番石榴葉提取物對(duì)過(guò)氧自由基清除能力很弱，石油醚的極性遠(yuǎn)小于乙醇、丙酮和乙酸乙酯的極性，說(shuō)明番石榴葉提取物中清除過(guò)氧自由基的主要活性成分可能極性相對(duì)較大。據(jù)報(bào)道黃酮為番石榴葉的主要活性成分[10]，而黃酮成分的極性相對(duì)較大。此外，番石榴葉不同有機(jī)溶劑提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率也存在較大差異，丙酮、乙酸乙酯番石榴葉提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用較為顯著，而乙醇和石油醚番石榴葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制效果不明顯。丙酮和乙酸乙酯相對(duì)乙醇和石油醚為中等極性。根據(jù)相似相溶原理，推測(cè)番石榴葉有機(jī)溶劑提取物中抑制酪氨酸酶活性的主要成分為中等極性。該研究為后期番石榴葉具有清除過(guò)氧自由基能力和抑制酪氨酸酶活性化合物的分離奠定了基礎(chǔ)，從而促進(jìn)抗氧化制劑及抗氧化抗衰老藥物的開(kāi)發(fā)。

番石榴葉可入藥，有許多研究者采用不同方法提取番石榴葉的有效成分并進(jìn)行分析。但目前關(guān)于番石榴不同有機(jī)溶劑葉粗提物抗氧化活性的研究還比較少，該研究充分利用番石榴葉這一資源，研究其抗氧化活性，為后期抗氧化抗衰老藥物和酪氨酸酶抑制劑的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。體外抗腫瘤活性篩選表明，番石榴葉95%乙醇提取物在60 mg/L下對(duì)腫瘤細(xì)胞SW480細(xì)胞有一定的抑制活性[10]，番石榴葉還具有降血糖、降血脂、抗炎和止瀉等功效，其主要活性成分包括黃酮類、多酚類、三萜類、雜源萜類等[11]。該研究首次系統(tǒng)性地研究番石榴葉不同有機(jī)溶劑提取物的抗氧化作用，為今后進(jìn)一步通過(guò)活性跟蹤分離提取不同活性的有效成分和生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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