加米霉素對牛呼吸道疾病相關(guān)病原菌臨床分離株的體外藥敏試驗

周德剛 盧基忠 李朋朋 吳聰明

摘要[目的] 對臨床上分離病原菌的藥敏試驗結(jié)果進行分析，為臨床用藥提供依據(jù)。[方法] 采用微量肉湯稀釋法，測定了加米霉素對牛場分離出的100株牛呼吸道疾病相關(guān)病原菌的最小抗菌濃度（MIC）。[結(jié)果] 加米霉素對臨床分離的多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、牛支原體和鏈球菌均有良好的體外抗菌活性。[結(jié)論]臨床上可用加米霉素制劑防治牛呼吸道疾病。

關(guān)鍵詞?加米霉素;牛呼吸道疾病;微量肉湯稀釋法

中圖分類號?S856.3文獻標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2020）02-0113-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Drug Sensitivity Test of Gammamycin on Clinical Isolates of Pathogens Related to Bovine Respiratory Diseases in vivo

ZHOU De-gang1，LU Ji-zhong2，LI Peng-peng1 et al

（ 1.Luoyang Huizhong Veterinary Medicine Co.， Ltd.， Luoyang， Henan 471000;2.Xinyang Animal Disease Prevention and Control Center， Xinyang，Henan 464000）

Abstract?[Objective]To analyze the drug susceptibility test results of clinical pathogen，and provide the basis for clinical medication.[Method]The minimal inhibitory concentrations （MICs） of 100 strains of isolated pathogens related to bovine respiratory diseases from cattle farm with gamamine were determined using the standard broth microdilution method.[Result]The results of drug sensitive tests showed that gmimycin had good antimicrobial activity to clinical isolates of Pasteurella multocida， Mannheimia haemolytica， M. bovis and Streptococcus sp..[Conclusion]Gamithromycin preparation can be used to treatment bovine respiratory diseases.

Key words?Gamithromycin;Bovine respiratory disease;Standard broth microdilution method

牛呼吸道疾?。˙RD）是由病毒或細(xì)菌單獨或混合感染引起的肺炎、支氣管炎的通稱，是一種世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要疾病。該病具有發(fā)病率高、死亡率高和經(jīng)濟損失嚴(yán)重等特點[1-2]，針對該病，國內(nèi)外尚缺乏有效的疫苗預(yù)防，仍主要依靠抗菌藥物來防治。加米霉素應(yīng)用于溶血性巴斯德桿菌、敗血型巴斯德桿菌、嗜組織菌以及絲狀支原體導(dǎo)致的牛呼吸系統(tǒng)疾病臨床治療[3-4]，在牛呼吸道感染性疾病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者對加米霉素進行牛呼吸道疾病相關(guān)病原菌臨床分離株的體外藥敏試驗，旨在為將該藥物用于防治牛呼吸道疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗藥物

1.1.1?受試藥物。

加米霉素原料藥，由洛陽惠中獸藥有限公司提供，含量99.7%，批號20171001。

1.1.2?對照藥物。

泰拉霉素，由洛陽惠中獸藥有限公司提供，批號 PS150-1601002，含量100.00%;替米考星，由華北制藥集團動物保健品有限公司提供，批號160502，含量96.20%;氟苯尼考，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號30823，含量99.00%，有效期為2017年8月;頭孢噻呋，由華北制藥集團動物保健品有限公司提供，批號160502，含量96.20%。

1.2?試驗菌株

多殺性巴氏桿菌45株，溶血性曼氏桿菌25株，牛支原體10株，鏈球菌20株。所有菌株均為2015—2016年河北省唐山市奶牛場、四川省廣安市肉牛場、四川省瀘州市肉牛場的分離病原菌，大腸桿菌ATCC25922、金葡菌ATCC29213、牛支原體PG45為該試驗所用的質(zhì)控菌株，購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。

1.3?培養(yǎng)基

MH肉湯培養(yǎng)基，批號為150429，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;MH瓊脂培養(yǎng)基，批號為150626，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;胎牛血清，批號為20141020，購自北京索萊寶科技有限公司;PPLO肉湯培養(yǎng)基，批號為3361447，購自BD公司;馬血清批號為201511005，購自鄭州益康生物工程有限公司;DMEM/LOW GLUCOSE培養(yǎng)基，批號為AAJ207748，購自HyClone公司。

1.4?藥液配制

參照CLSI（2009年）標(biāo)準(zhǔn)[5-6]方法，配制終濃度為2 560 μg/mL的藥物貯備液。過濾除菌，分裝，于-20 ℃低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5?細(xì)菌最小抗菌濃度（MIC）的測定

1.5.1?菌液制備。

將保存的多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、鏈球菌等臨床分離株分別接種于含10%胎牛血清的MH瓊脂平板，在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。分別挑取1～3個單菌落接種于含10%胎牛血清的MH肉湯，在含5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)18～24 h，檢測菌液OD值，當(dāng)菌液濁度達到約5.0×108～7.5×108 CFU/mL時，將原菌液用液體培養(yǎng)基按1∶1 000稀釋后保存?zhèn)溆?。將質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922、金葡菌ATCC29213分離株分別接種于MH瓊脂平板，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，從各平板分別挑取1～3個單菌落接種于MH肉湯，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)12～16 h，檢測菌液OD值，當(dāng)菌液濁度達到5.0×108～7.5×108 CFU/mL時，將原菌液用液體培養(yǎng)基按1∶1 000稀釋后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2?MIC值測定。將藥物貯備液用10%胎牛血清的MH肉湯培養(yǎng)基進行10倍稀釋后獲得濃度256 μg/mL的使用藥液，然后再進行連續(xù)2倍稀釋，將稀釋后的藥液各取100μL，依次加入到微孔板的第1～11孔，第12孔加100 μL不含藥物的培養(yǎng)基作為陰性對照。分別吸取100 μL已制備的濁度5.0×108～7.5×108 CFU/mL的菌液分別加到微孔板的第1～11孔中，第12孔再次加入100 μL不含抗生素的肉湯培養(yǎng)基。多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌株、鏈球菌3種細(xì)菌的培養(yǎng)需在含5% CO2的條件下進行。每批試驗均要求用標(biāo)準(zhǔn)菌株進行質(zhì)控;每株菌針對一種藥物的MIC值測定均需做2次重復(fù)。

1.5.3?MIC值判定。

在襯有黑底板的光線下觀察，無細(xì)菌生長孔的最低藥物濃度即為該藥物的MIC值。

1.6?牛支原體最小抗菌濃度（MIC）的測定

1.6.1?支原體復(fù)蘇。

將保存的支原體培養(yǎng)物取出充分融化后，吸取1 mL加入5 mL的PPLO肉湯培養(yǎng)基中，置于充有5% CO2 的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～3 d，待顏色變?yōu)槌壬螯S色后，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.6.2?支原體顏色變化單位（CCU）的測定。

將復(fù)蘇的支原體原培養(yǎng)物用PPLO肉湯培養(yǎng)基（pH 7.6）進行10倍稀釋，獲得含支原體原培養(yǎng)物濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9。取無菌的96孔反應(yīng)板，將稀釋后的支原體培養(yǎng)物分別吸取200 μL加入第1～9孔中，在第10孔加入200 μL PPLO肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照。置于含5% CO2 的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～3 d，直至顏色不再變化為至。記錄出現(xiàn)顏色變化的最大稀釋倍數(shù)，換算獲得支原體原培養(yǎng)物的顏色變化單位（CCU）。將支原體原培養(yǎng)物稀釋至104～105 CCU/mL，備用。

1.6.3?MIC值測定。

用PPLO肉湯培養(yǎng)基將藥物貯備液稀釋10倍，得到濃度256 μg/mL的使用藥液，然后再用PPLO肉湯培養(yǎng)基對使用藥液進行連續(xù)2倍稀釋，將100 μL稀釋后的藥液按照濃度由高至低的順序依次加入到微孔板的第1～9孔，第10孔加入100 μL PPLO肉湯培養(yǎng)基。在第1～10孔分別加入制備好的104～105 CFU/mL的支原體培養(yǎng)物100 μL。第10孔作為支原體生長對照;第11孔加入PPLO肉湯培養(yǎng)基200 μL作為陰性對照;將第12孔加入pH 6.8的PPLO肉湯培養(yǎng)基200 μL作為顏色對照?；靹蚝笾糜诤?% CO2 的37 ℃培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～3 d，觀察培養(yǎng)物的顏色變化并與顏色對照孔進行對比，將能抑制支原體生長（出現(xiàn)顏色變化）的最低藥物濃度定義為MIC。每批試驗均要使用牛支原體PG45參考菌株進行質(zhì)控;每株菌針對一種藥物的MIC值測定均需做2次重復(fù)，若2次重復(fù)的MIC值不一致則需進行第3次驗證。

1.7?數(shù)據(jù)處理

分別記錄每株臨床分離菌對加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、頭孢噻呋的MIC值，計算各藥物對每種臨床分離菌的MIC50與MIC90。

2?結(jié)果與分析

2.1?多殺性巴氏桿菌的MIC檢測結(jié)果

加米霉素、替米考星、泰拉菌素、氟苯尼考、頭孢噻呋對多殺性巴氏桿菌臨床分離株的MIC檢測結(jié)果見表1。

由表1可知，加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、頭孢噻呋對多殺性巴氏桿菌臨床分離株（n=45）的MIC值分別為0.13～16.00 μg/mL、0.13～32.00 μg/mL、0.25～64.00 μg/mL、0.13～4.00 μg/mL和0.03～4.00 μg/mL。

計算各種藥物對多殺性巴氏桿菌臨床分離株的MIC50和MIC90，得出加米霉素的MIC50為1.00 μg/mL，MIC90為2.00 μg/mL;泰拉霉素的MIC50為2.00 μg/mL，MIC90為8.00 μg/mL;替米考星的MIC50為2.00 μg/mL，MIC90為4.00 μg/mL;氟苯尼考的MIC50為0.50 μg/mL，MIC90為2.00 μg/mL;頭孢噻呋的MIC50為0.13 μg/mL，MIC90為2.00 μg/mL。

2.2?溶血性曼氏桿菌的MIC檢測結(jié)果

加米霉素、替米考星、泰拉菌素、氟苯尼考、頭孢噻呋對溶血性曼氏菌臨床分離株的MIC檢測結(jié)果見表2。

由表2可知，加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、頭孢噻呋對溶血性曼氏桿菌臨床分離株（n=25）的MIC分別為0.25～2.00、0.50～4.00、4.00～16.00、0.50～2.00和0.50～4.00 μg/mL。

計算各種藥物對溶血性曼氏桿菌的MIC50及MIC90，得出加米霉素的MIC50為0.50 μg/mL，MIC90為1.00 μg/mL;泰拉霉素的MIC50為2.00 μg/mL，MIC90為2.00 μg/mL;替米考星的MIC50為8.00 μg/mL，MIC90為8.00 μg/mL;氟苯尼考的MIC50為1.00 μg/mL，MIC90為1.00 μg/mL;頭孢噻呋的MIC50為1.00 μg/mL，MIC90為2.00 μg/mL。

2.3?牛支原體的MIC檢測結(jié)果

加米霉素、替米考星、泰拉菌素、氟苯尼考、頭孢噻呋對牛支原體臨床分離株的MIC檢測結(jié)果見表3。

由表3可知，加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、頭孢噻呋對牛支原體臨床分離株（n=10）的MIC值分別為2.00～8.00、2.00～16.00、8.00～64.00、2.00～8.00和64.00～128.00 μg/mL。

計算各種藥物對牛支原體臨床分離株的MIC50及MIC90，得出加米霉素的MIC50為4.00 μg/mL，MIC90為8.00 μg/mL;泰拉霉素的MIC50為4.00 μg/mL，MIC90為16.00 μg/mL;替米考星的MIC50為16.00 μg/mL，MIC90為64.00 μg/mL;氟苯尼考的MIC50為4.00 μg/mL，MIC90為8.00 μg/mL;頭孢噻呋的MIC50為128.00 μg/mL，MIC90為128.00 μg/mL。

2.4?鏈球菌的MIC檢測結(jié)果

加米霉素、替米考星、泰拉菌素、氟苯尼考、頭孢噻呋對鏈球菌臨床分離株的MIC檢測結(jié)果見表4。

由表4可知，加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、頭孢噻呋對鏈球菌臨床分離株（n=20）的MIC值分別為0.13～0.25、0.13～0.50、0.13～0.50、0.50～2.00和0.06～1.00 μg/mL。

計算各種藥物對鏈球菌臨床分離株的MIC50及MIC90，得出加米霉素的MIC50為0.25 μg/mL，MIC90為0.25 μg/mL;泰拉霉素的MIC50為0.25 μg/mL，MIC90為0.25 μg/mL;替米考星的MIC50為0.25 μg/mL，MIC90為0.50 μg/mL;氟苯尼考的MIC50為2.00 μg/mL，MIC90為2.00 μg/mL;頭孢噻呋的MIC50為0.125 μg/mL，MIC90為0.50 μg/mL。

3?討論

該試驗結(jié)果表明，加米霉素對臨床分離牛的多殺性巴氏菌體外抑殺作用與泰拉霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋相當(dāng)，優(yōu)于替米考星;對臨床分離牛溶血性曼氏桿菌的體外抑殺作用與氟苯尼考相當(dāng)，優(yōu)于泰拉霉素、頭孢噻呋、替米考星。對臨床分離牛支原體的體外抑殺作用與泰拉霉素、氟苯尼考相當(dāng)，優(yōu)于替米考星;對臨床分離的牛鏈球菌的體外抑殺作用與泰拉霉素、頭孢噻呋、替米考星、氟苯尼考相當(dāng)。Linhart等[7]報道，為評估加米霉素注射液和泰拉霉素注射液在控制牛呼吸道疾病感染控制效果，加米霉素注射液注射631頭，泰拉霉素注射液注射621頭，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用加米霉素注射液組由于呼吸道疾病引起的犢牛死亡率低于泰拉美素注射液組。Baggott等[8]選取 802 頭處于 BRD 感染高危期的青年小牛進行對照試驗，50%的牛按6 mg/kg采取皮下注射的方式給藥加米霉素，其余50%的牛以鹽水安慰劑注射作為對照，結(jié)果顯示加米霉素治療組的比率（86%）顯著高于鹽水治療對照組（61%）。鄧菲等[9]報道按推薦劑量（6 mg/kg）給 BRD 病牛單次皮下注射，給藥 1 d后即可顯著改善病牛發(fā)熱、精神沉郁，呼吸困難等癥狀（P≤0.05），給藥 4～5 d 后病牛即可恢復(fù)正常，治療有效率可達 90%，牛呼吸道感染的多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、牛支原體等病原菌都能得到有效清除，與該研究體外藥敏試驗結(jié)果相似。Lechtenberg等[10]評估了加米霉素對純種和雜種肉牛及非泌乳奶牛與牛支原體相關(guān)的牛呼吸系統(tǒng)疾病的療效功能，結(jié)果表明加米霉素治療組注射后 10 d 的治療成功率為 68.5%，顯著高于鹽水對照組的成功率（12.8%），與該研究的體外藥敏試驗結(jié)果相近。

4?結(jié)論

加米霉素對多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、支原體、鏈球菌等BRD相關(guān)病原菌均具有良好的體外抗菌活性，臨床上可用加米霉素制劑防治牛呼吸道疾病。

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