帝王花種子無菌播種和快速繁殖研究

陳權(quán) 陳慧蘭 李文劍

摘要?[目的]建立帝王花無菌播種和快速繁殖技術(shù)體系。[方法]以MS或1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同激素組合，篩選適宜的誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)基。[結(jié)果]1/2MS+6-BA 0.01mg/L為帝王花種子最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d種子萌動，35 d形成幼苗;MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.01mg/L為最適宜的增殖培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)達2.83倍;1/2MS+IAA 1.00 mg/L為最佳生根培養(yǎng)基，生根率達96%，苗高達4.2 cm;將種苗栽植于泥炭∶珍珠巖=3∶1的基質(zhì)上，其移栽成活率為85%。[結(jié)論] 該研究為快速繁殖帝王花優(yōu)質(zhì)種苗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?帝王花;無菌播種;激素配比;組織培養(yǎng)

中圖分類號?S604文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）02-0067-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.018

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Study on Aseptic Sowing and Rapid Propagation Technology for Protea cynaroides L.Seed

CHEN Quan1，CHEN Hui-lan1，LI WEN-jian2?（1.Shanghai Sunqiao Modern Greenhouse Seed and Seedling Co.，Ltd.，Shanghai201210;2.Shanghai Sunqiao Yijia Agriculture Technology Co.，Ltd.，Shanghai201210）

Abstract?[Objective] To establish a system of aseptic sowing and rapid propagation technology for Protea cynaroides L..[Method]Different hormone combinations were added to MS or 1/2MS medium to screen the suitable induction，proliferation and rooting medium.[Result]The proper medium for the seeds induction of Protea cynaroides L.was 1/2MS medium containing 6-BA 0.01mg/L，seed germination was observed on 14 days，seedling formation was observed on 35 days; the most suitableproliferation medium was MS medium containing 6-BA 1.00 mg/L+IBA0.01mg/L with proliferation times 2.83;the best seedling rooting medium was 1/2MS medium containing IAA1.00 mg/L，rooting rate was up to 96%，plant length was up to 4.2 cm;seedlings were planted in substrate that composed with peat and perlite in a ratio of 3∶1，the survival percent of transplantation could reach 85%.[Conclusion]The study laid a foundation for rapid breeding of high quality seedling of Protea cynaroides L..

Key words?Protea cynaroides L.; Aseptic sowing; Hormones ratio; Tissue culture

帝王花（Protea cynaroides L.），又名菩提花，俗稱木百合或龍眼花，是山龍眼科普洛蒂亞屬多年生木本植物，兩性花，頭狀花序錐形，基部有彩色的葉狀苞片，花期常為秋季至翌年春末。帝王花是山龍眼花卉中最著名、最有經(jīng)濟價值的種類，也是世界上流行的新型高檔木本切花[1-3]。帝王花原產(chǎn)南非，是南非共和國的國花，在園林裝飾方面越來越受到大家的歡迎。帝王花既是優(yōu)良的鮮切花，也適合制作干花，作為鮮切花可以擺放很長時間，因此受到世界上越來越多人的歡迎和喜愛，市場潛力巨大。帝王花通常采用播種繁殖，種子大多從國外進口，價格昂貴，加上種子具有休眠特性，用常規(guī)方法播種出苗率極低[4]，萌發(fā)周期也很長[5]，導(dǎo)致用種子繁殖生產(chǎn)成本較高。筆者也曾嘗試采用成年帝王花植株莖桿進行組培，但帝王花屬于灌木類，腋芽發(fā)芽困難，成活率低。而且在外植體誘導(dǎo)過程中很容易褐化，這與前人的研究結(jié)果一致[6-7]，因而不適合在生產(chǎn)上推廣。故如何提高帝王花的繁殖率，加快從播種到成株的速度成為目前亟待解決的問題。

國外已有利用合子胚和子葉組織直接誘導(dǎo)帝王花體細胞胚胎研究的報道[8]。但尚未見利用無菌播種和組培快繁技術(shù)進行帝王花組培種苗工廠化生產(chǎn)方面的系統(tǒng)報道。筆者采用帝王花種子無菌播種獲得的實生苗，取其子葉以上部分作為誘導(dǎo)不定芽的材料，并經(jīng)過不斷增殖，最終獲得大量組培苗木。這種帝王花快速繁殖的方法，克服了常規(guī)繁殖方法所面臨的問題，大大提高了帝王花種苗繁殖率，為進口苗木品種種苗的國產(chǎn)化提供了可靠的技術(shù)保障。筆者研究了帝王花種子無菌播種和快速繁殖，以期為快速繁殖帝王花優(yōu)質(zhì)種苗奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料?帝王花種子從上海開普公司購得。

1.2?方法

1.2.1?種子消毒。將帝王花種子表面的黑色絨毛去除，在超凈工作臺上進行種子消毒。在清水中加入少量洗衣粉，用洗衣粉水將種子表面的污垢清洗干凈，并在流水下沖洗干凈。無菌條件下，用75%乙醇處理30 s，用0.05%HgCl2浸泡消毒10 min，無菌水沖洗5～6次，無菌濾紙吸干。待接種。

1.2.2?培養(yǎng)條件。使用240 mL廣口瓶為培養(yǎng)容器（下同），每瓶灌裝40 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中均添加白砂糖30 g/L、瓊脂粉5 g/L，pH 5.8，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強度2 500 lx。

1.2.3?無菌播種初代誘導(dǎo)培養(yǎng)。以MS或1/2MS為基本培養(yǎng)基，將消毒后的種子剝?nèi)シN皮后接種于添加不同激素的MS萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方：①MS;②MS+6-BA 0.01 mg/L;③MS+IBA 0.01 mg/L;④1/2MS;⑤1/2MS+6-BA 0.01 mg/L;⑥1/2MS+IBA 0.01 mg/L，觀察不同培養(yǎng)基對帝王花種子萌發(fā)的影響。

1.2.4?增殖培養(yǎng)。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，切取無菌實生苗上胚軸及以上部分，接種于添加不同激素的增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方：①MS+TDZ 0.10 mg/L+IBA 0.01 mg/L;②MS+TDZ 0.20 mg/L+IBA 0.01 mg/L;③MS+TDZ 0.50 mg/L+IBA 0.01 mg/L;④MS+6-BA 0.50 mg/L+IBA 0.01 mg/L;⑤MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.01 mg/L;⑥MS+6-BA 2.00 mg/L+IBA 0.01 mg/L。增殖培養(yǎng)繼代周期為35 d。連續(xù)繼代3次后，統(tǒng)計種苗第4次繼代的增殖倍數(shù)。種苗增殖倍數(shù)=培養(yǎng)35 d時植株數(shù)/接種時種苗數(shù)。

1.2.5?壯苗生根培養(yǎng)及煉苗。將增殖培養(yǎng)基中高度2 cm的單株切下，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度IBA、IAA（0、0.20、0.50、1.00、1.50 mg/L），壯苗生根培養(yǎng)42 d，統(tǒng)計苗高、生根率。將完成生根過程的瓶苗預(yù)先放到溫室內(nèi)，散射光下煉苗7 d，然后從培養(yǎng)瓶中取出植株，洗凈培養(yǎng)基，用700倍多菌靈浸泡2 min后，移栽于泥炭土：珍珠巖=3：1的混合基質(zhì)中，搭小拱棚用薄膜覆蓋，空氣濕度保持80%以上，環(huán)境溫度16～26 ℃。

1.3?數(shù)據(jù)分析?采用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?無菌播種初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

帝王花種子表皮外有黑色絨毛包裹，影響種子消毒效果。直接剝?nèi)》N子胚接種于播種培養(yǎng)基上，35 d形成幼苗。培養(yǎng)5 d左右，胚逐漸吸水膨脹，14 d時，種子開始萌動轉(zhuǎn)綠。處理①～⑥種子均能正常萌動，其中處理②和⑤萌動稍快，而處理⑤后期長勢快且好，植株生長健壯。以處理⑤1/2MS+6-BA0.01 mg/L為帝王花種子誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基，種子萌發(fā)率達100%。

2.2?增殖培養(yǎng)?將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的帝王花種苗接種于各增殖培養(yǎng)基上，經(jīng)過3次連續(xù)繼代，統(tǒng)計觀察第4次繼代后的增殖及生長情況。由表1可知，在含TDZ的3個處理中，隨著TDZ濃度的提高，帝王花種苗增殖倍數(shù)逐漸提高，處理③最高達2.96倍，但形成的芽小而弱，且少量葉片肥厚而脆弱，有玻璃化的趨勢。在含6-BA的3個處理中，處理⑤增殖倍數(shù)最高，達2.83倍，芽長勢好且粗壯。隨著激素濃度的進一步提高，出現(xiàn)玻璃苗現(xiàn)象，處理⑥增殖倍數(shù)為2.66倍，增殖比例反而降低。從6-BA與TDZ對帝王花組培苗不定芽的誘導(dǎo)效果看，在含6-BA的增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的不定芽粗壯且生長速度快，芽伸長生長明顯。在含較高濃度TDZ的增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量雖然最多，但誘導(dǎo)的芽弱且芽伸長生長緩慢。綜合比較后認為，在實際生產(chǎn)中MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.01 mg/L為最適宜的增殖培養(yǎng)基。

2.3?壯苗生根培養(yǎng)及馴化移栽

由表2可知，生長素（IAA、IBA）濃度低于0.50 mg/L時，帝王花組培苗生根率較

低。生長素濃度在0～1.00 mg/L時，隨著濃度的提高，生根率逐漸提高，植株高度也呈現(xiàn)相同變化，差異極顯著。相同濃度下，IAA的生根效果優(yōu)于IBA。當(dāng)IAA濃度為1.00 mg/L時，生根率最高達96%，植株高度達4.2 cm。無論是IAA還是IBA，當(dāng)濃度高于1.00 mg/L時，生根率和植株高度反而有所降低。綜上所述，1/2MS+IAA1.00 mg/L為最佳壯苗生根培養(yǎng)基，當(dāng)植株接種于此壯苗生根培養(yǎng)基后，14 d后陸續(xù)長出新根，35 d后生根率達96%，植株高度達4.2 cm。瓶內(nèi)生根的植株經(jīng)過7 d煉苗后，移栽于泥炭土∶珍珠巖=3∶1的混合基質(zhì)中，移栽成活率達85%。

3?討論

帝王花常規(guī)的種子發(fā)芽方法發(fā)芽所需時間長，發(fā)芽率低。因此種子無菌播種和快繁技術(shù)研究對解決帝王花種苗的繁殖具有重要意義。在可控的環(huán)境條件下，種子萌發(fā)率大大提高，因而無菌播種的優(yōu)勢明顯。周輝明等[9]對垂花蕙蘭種子無菌播種和快速繁殖進行研究，結(jié)果認為適宜外源激素的添加能促進種子萌發(fā)，林輝鋒等[10]研究石橄欖種子無菌播種和快速繁殖，發(fā)現(xiàn)外源激素的添加更能促進石橄欖種子萌動。該研究得出相似結(jié)論，在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加微量細胞分裂素能促進帝王花種子萌發(fā)，利于培育健壯植株，適宜的種子無菌播種培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.01 mg/L。

在帝王花的增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在基本培養(yǎng)基中添加不同的細胞分裂素，增殖效果有明顯差異。在添加6-BA的增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量少，芽粗壯且生長速度快，芽伸長生長明顯，而在添加TDZ的增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量多，芽弱且芽的伸長生長受到抑制。任鵬斌等[11]在研究TDZ與6-BA對魔芋不定芽誘導(dǎo)效應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，TDZ對魔芋不定芽的伸長生長表現(xiàn)出較強的抑制作用，而6-BA對不定芽的伸長生長則表現(xiàn)出較好的促進作用，該研究得出了與前人相同的研究結(jié)果。可見，不同的細胞分裂素種類和濃度，對于帝王花不定芽的分化、增殖效果不同。在生產(chǎn)過程中，結(jié)合種苗增殖的實際情況，6-BA和TDZ可交替使用。

在植株壯苗生根階段，較高濃度的生長素有利于帝王花組培苗生根，這可能與帝王花種苗內(nèi)源生長激素較低有關(guān)。相同濃度下，IAA對帝王花種苗的瓶內(nèi)生根效果優(yōu)于IBA。該研究條件下1/2MS+IAA 1.00 mg/L為最佳壯苗生根培養(yǎng)基，當(dāng)植株接種于此壯苗生根培養(yǎng)基后，14 d后陸續(xù)長出新根，35 d后生根率達96%，植株高度達4.2 cm。該研究還發(fā)現(xiàn)，NAA對帝王花的生根無明顯的促進作用。

移栽成活率是影響組培種苗工廠化生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素之一。在獲得較為健壯種苗的基礎(chǔ)上，通過加強移栽后溫濕度的管控，提高種苗移栽成活率。該研究中瓶內(nèi)生根的植株經(jīng)過7 d煉苗后，移栽于泥炭土∶珍珠巖=3∶1的混合基質(zhì)中，移栽成活率達85%，種苗長勢良好。

4?結(jié)論

該研究以帝王花種子為試驗材料，研究了不同激素及其濃度對帝王花種子萌發(fā)、芽增殖、壯苗生根的影響，篩選出了適宜的誘導(dǎo)、增殖及壯苗生根培養(yǎng)基配方，建立了一套帝王花種子無菌播種和快速繁殖技術(shù)體系，具有種子萌發(fā)率高、芽增殖系數(shù)高、生根效果好、移栽成活率高等特點。該研究為帝王花種苗工廠化生產(chǎn)提供了可靠的技術(shù)保障，同時對于進口苗木品種種苗的國產(chǎn)化研究具有重要意義。

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