DNA條形碼技術在中藥材鑒定中的應用

李笑 譚朝陽 徐德宏 孟蕾

摘要?DNA條形碼技術是一種新興的分子鑒定方法，它能彌補傳統(tǒng)化學方法和形態(tài)學方法鑒定中藥材的不足之處。通過查閱文獻，在分析DNA條形碼技術的原理、發(fā)展的基礎上，對目前一些熱門的DNA條形碼候選序列ITS、ITS2、psbA-trnh、rbcL、matK展開討論，重點分析其在植物類和動物類中藥材鑒定中的應用，為中藥材的鑒定提供新的思路。

關鍵詞?DNA條形碼;中藥材;鑒定;應用

中圖分類號?R282.5文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）02-0016-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.005

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Application of DNA Barcode Technology in Identification of Chinese Medicinal Materials

LI Xiao1，TAN Zhao-yang1，2，XU De-hong1 et al?（1.Lab of Bioengineering，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208;2.Lab of Nature and Effectiveness of Chinese Medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208）

Abstract?DNA barcode technology is an emerging molecular identification method that can make up for the shortcomings of traditional chemical methods and morphological methods to identify Chinese herbal medicines.By consulting the literature，on the basis of analyzing the principle and development of DNA barcode technology，some popular DNA barcode candidate sequences ITS，ITS2，psbA-trnh，rbcL，matK are discussed，focusing on its application in the identification of Chinese herbal medicines in plants and animals，and provided new ideas for the identification of Chinese herbal medicines.

Key words?DNA barcode;Chinese herbal medicine;Identification;Application

市面上的中藥材仿冒品和替代品數(shù)量不斷增多，人為不規(guī)范的種植、商家牟利、摻雜造假等種種行為嚴重危害到了患者的生命安全以及醫(yī)藥相關人員的信譽。因中草藥在臨床應用上的復雜性，中草藥基原混淆、質量不合格容易導致患者發(fā)生嚴重的不良反應。以白鮮皮為例，臨床上許多患者由于服用了與植物白鮮相似的偽品中藥材加工成的飲片，導致藥物性肝損傷[1]。由此可見，中藥材的使用不當會損害機體健康甚至引發(fā)中毒反應。而許多藥材與混偽品之間形態(tài)相似，通過傳統(tǒng)的理化鑒定方法有較大的難度。因此，有必要建立更加準確、快速、可靠的中藥鑒定體系和質量評價體系。

1?分子標記技術

分子標記是以核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，表現(xiàn)了DNA水平的遺傳多態(tài)性[2]。DNA 分子遺傳標記技術相比于傳統(tǒng)鑒定技術具有快速、微量、特異性強等特點，在中藥材鑒定方面已被國內外研究者廣泛關注[3-4]。目前一些DNA分子標記的方法也被逐漸應用到中成藥的鑒定中，如單核苷酸多態(tài)性、限制性片段長度多態(tài)性、隨機擴增多態(tài)性DNA標記、突變等位基因特異性擴增、簡單重復序列、SSR分子標記等，各有相應的適用范圍。其中簡單重復序列促進了中藥鑒定技術的發(fā)展[5]。SSR分子標記多態(tài)性高、重復性強、數(shù)量豐富，對基因組有很好的覆蓋性[6]，同時SSR分子標記適用于沒有詳細背景材料的中藥材[7]，方便構建中藥指紋圖譜。而新技術雙分子標記法能滿足現(xiàn)階段在分子水平上同時研究中藥的種類和質量差異[8]，獲取物種完整的遺傳信息，彌補單一鑒別方法的不足[9]。DNA條形碼技術也屬于分子標記技術的范疇，能夠快速地識別物種信息，為中藥鑒定提供了便利。

2?中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則

2.1?DNA條形碼的定義及原理

加拿大動物學家Paul Hebert T最早提出DNA條形碼概念，他通過試驗分析對動物界的線粒體編碼區(qū)基因進行比較，98%的物種的種內變異較低，種間平均變異達11.3%，在昆蟲、魚、鳥類動物中也有很高的鑒別效率[10]。因此，他們將商場用以區(qū)分不同商品的條形碼概念引入中藥鑒定，為每一種不同的中藥材構建相應的條形碼。通過掃描該條形碼，就能快速獲得完整的中藥材信息，據(jù)此提出的使用單一短的基因片段來鑒定物種，把這種小片段基因序列稱作物種DNA條形碼，并提出為全球編碼的計劃[11]。DNA條形碼是指一段片段較短相對保守的序列，既有一定的保守性不易突變，又存在一定的可變性用來區(qū)分近緣物種。DNA條形碼技術應用于鑒定中藥材，不受物種不同時期生長狀態(tài)的影響。

2.2?DNA條形碼技術的發(fā)展

DNA條形碼從基因水平來鑒定不易區(qū)分的物種，結果穩(wěn)定可靠，為道地藥材的鑒定與種質資源的篩選提供了新的方法。因此，大量研究人員開始尋找動植物DNA條形碼的鑒定標準。高通用性、高效篩選能力成為選擇DNA條形碼的重要標準之一。早在2003年，提出DNA條形碼概念的生物學家Hebert Paul D通過試驗研究表明條形碼COI序列片段短，通用性好且鑒定效率高[12]。后許多學者認同了這一說法，通過試驗比較將大小為650 bp的COI認定為動物通用的條形碼序列，并在2008年加拿大的學術會議上引入了超級條形碼的概念[13]。動物具有較高的進化速率，因此，動物線粒體COI序列的條形碼具有廣泛性和通用性。目前在國內，陳士林教授所帶領的團隊長期從事中藥資源的研究工作，應用條形碼技術對大量動植物藥材進行鑒定，相比于之前藥工憑借經驗鑒定中藥材、區(qū)分相似品和易混淆品有良好的效果。植物藥材由于生長環(huán)境復雜，進化速率低，因此在選擇DNA條形碼中很少存在單獨的條形碼片段來滿足各種不同的植物。大量中藥材DNA條形碼分子是以ITS2為主體的鑒定體系[14]，其中植物類中藥材選用ITS2為主體序列，psbA-trnH為補充序列，研究表明ITS2在鑒定大部分植物中均有良好的鑒定效果。psbA-trnH序列適用范圍低于ITS2序列，主要用于闕類植物的鑒定[15]。

2.3?鑒定方法和流程

2.3.1?材料預處理。

中藥材容易發(fā)生降解以及產生醌類有毒物質。因此在提取DNA的過程中需要減小內生菌的污染。常用的方法有加入PVP粉末、在提取DNA前適當用酒精消毒。

2.3.2?DNA的提取。

高質量的DNA是進行DNA條形碼研究的必要前提和關鍵環(huán)節(jié)[16]。植物組織中含有大量多糖、多酚等次生代謝產物。CTBA法可以快速提取植物的總DNA。將新鮮的葉片在液氮中研磨，以機械力破碎細胞壁，再加入CTBA使細胞膜破裂，同時將核酸與植物多糖等雜質分開。再經氯仿提取處理去除蛋白，即可得到相應的DNA[17]。

植物類的中藥材種類繁多，除了CTBA法之外，還可以采取SDS法、高鹽低pH法、改良PVP法等[18] 。例如提取菟絲子的DNA，采用4種不同的方法進行提取后，對DNA的濃度和純度進行檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)改良PVP法提取的DNA得率較高[19]。CTBA法相比于改良PVP法具有快速簡便的優(yōu)點，但DNA的得率低于改良PVP法。因此，應該根據(jù)不同的樣品、不同的試驗需求來選用不同的方法。

2.3.3?PCR擴增。對植物提取的DNA進行體外大量復制，通過適宜的條件得到相應的PCR產物。

2.3.4?PCR產物純化與序列拼接。將PCR 擴增條帶的樣品進行膠回收純化后，送測序公司進行 DNA 序列測定，最終獲得目的片段的雙向序列。

2.3.5?結果判定。

將獲得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫用BLAST方法進行結果判定，結果中相似性最高的序列對應的物種為查詢序列最接近的物種[20]。通過MAGE軟件構建物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，比較物種種內和種間的遺傳距離。

3?DNA條形碼在植物類藥材鑒定中的應用

3.1?ITS序列和ITS2序列對植物類藥材的鑒定

ITS序列可使整個基因組內的不同拷貝趨于一致，常用于系統(tǒng)進化研究和物種鑒定[21]。ITS序列位于rRNA處，其中編碼區(qū)（5.8S，18S，28S）序列高度保守又具有足夠的變異，適用于鑒定近緣關系較高的物種。轉錄間隔區(qū)ITS1和ITS2保守能力低于編碼區(qū)，但也具有一定的鑒別能力，適用于種間差異大的物種。因此ITS序列被認為適用于鑒定植物藥材的熱門條形碼之一。但ITS序列也存在著一些不足之處，核內轉錄間隔區(qū)ITS序列缺少通用引物，導致PCR不易擴增[22]。ITS序列較長，在PCR擴增的過程中發(fā)生堿基缺失突變的概率較大，會對試驗結果的真實性造成一定的影響。為了彌補ITS序列的不足，通過研究發(fā)現(xiàn)ITS2序列PCR擴增效率高且堿基突變率低。ITS2 序列對鑒定材料的要求不高，其序列相比 ITS 序列短，長度僅有300 bp左右，而且在基因組中適合于屬、種水平的鑒定[23]。ITS2序列滿足了DNA條形碼選擇序列的標準（ 進化速率快，有足夠的變異位點） ，國內外很多學者將ITS2 序列作為鑒別物種的主要條形碼，特別是在真菌類物種的鑒別方面[24]。ITS2序列信息量大且相對穩(wěn)定，在物種水平上變異快，序列位點較多，其中包括變異位點、保守位點、信息位點等，為DNA條形碼提供了大量信息[25]。ITS2序列在植物鑒定中越來越受到重視，陳士林等[20]

對753屬4 800種植物6 600份樣品進行研究，得出ITS2序列在種水平的鑒定成功率達92.7%。ITS2序列物種識別率和物種變異率較高，種內變異小而種間變異大，特別適合于在物種水平鑒定中藥材。同時ITS2還可自我聚合形成二級結構[26]，通過莖環(huán)的形狀與數(shù)目來區(qū)分不同的物種。此外，ITS2對于降解嚴重的材料也有一定的鑒定能力，因此ITS2的應用更具有廣泛性。

3.2?psbA-trnH序列對植物類藥材的鑒定

PsbA-trnH序列對于刺五加科的植物有較好的鑒定能力。通過K2P遺傳距離法、相似性搜索算法和構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析，結果均顯示，基于psbA-trnH序列能直觀有效地鑒定竹茹、天竺黃各基原及其近緣物種。竹茹、天竺黃各基原及其近緣物種存在特定的堿基缺失[27-28]，且psbA-trnH序列鑒定蘭科植物效率高達90%，但PsbA-trnH序列在鑒別非同屬植物上效率較低[29]。因此，psbA-trnH序列通常被認為是鑒定植物的輔助條形碼。

3.3?其他條形碼序列

除了ITS序列、ITS2序列和PsbA-trnH序列，matK和rbcL序列也是目前廣泛用于鑒定植物的熱門條形碼序列。matK和rbcL序列均屬于片段較長的條形碼，rbcL序列適用于區(qū)分相似程度小、科以上等級的植物鑒別。如rbcL序列適用于鑒別雞血藤及其混偽品[30]。matK序列適用于鑒別種間變異較小的蘭科類植物[31]，還可單獨鑒定植物藥材。matK序列在蛋白編碼基因中進化速率快[32]。在常用的PCR擴增體系中，matK+ rbcL序列和PsbA-trnH序列可組合使用鑒別[33]。生命條形碼聯(lián)盟植物工作組在2009年審定通過matK和rbcL基因片段為植物的核心條形碼， psbA-trnH和ITS基因片段為補充條形碼[34]。植物在其進化過程中進化速率低于動物，因此推薦使用組合條形碼來鑒別植物藥材，共同提高鑒定效率。

4?DNA條形碼在動物類藥材鑒定中的應用

DNA條形碼技術在鑒定植物藥材方面已有大量研究數(shù)據(jù)，但在動物類藥材有關方面的研究較少，對混偽品及瀕危名貴動物藥材的研究不足[35]。近年來國內外許多學者開始著重于大力推動DNA 條形碼鑒定動物類藥材的研究進展。動物類中藥材主要分布在節(jié)肢動物門、脊索動物門、環(huán)節(jié)動物門、軟體動物門、棘皮動物門等[36]。動物類藥材由于結構復雜，有著大量蛋白質分子，對于特殊的組織樣本還需要紫外殺菌處理。傳統(tǒng)的鑒定方法雖然簡單快速但缺乏準確性，DNA條形碼技術能夠準確鑒別動物類藥材種類及其混偽品[37]。常用分析方法包括種內種間遺傳距離計算、序列對比、構建系統(tǒng)發(fā)育樹等[38]。

5?DNA 條形碼中藥鑒定應用中存在的問題

DNA條形碼技術在鑒定中藥材方面，因其DNA序列獨一無二的特性，有著傳統(tǒng)鑒定方法無可比擬的優(yōu)勢，但也存在著一些局限性。對于一些特定的動植物藥材，DNA無法區(qū)分具體的用藥部位[25]。DNA條形碼技術很大程度取決于提取DNA的質量，目前尚未有很好的辦法完全保證提取DNA的質量滿足鑒定的要求，許多中藥材在保存運輸過程中容易發(fā)生褐變、霉變。采用新鮮植物葉片作為鑒定材料能否攻克 DNA 降解和斷裂問題，還需要進一步實踐和驗證[39]。對于儲存時間過長的中藥材樣品中保留的片段較小，特別是對飲片或加工后的藥材鑒定非常困難[40]。因此，在樣品采集和貯藏過程中要盡可能做到規(guī)范，防止DNA出現(xiàn)嚴重降解，在分子鑒定中要盡量使用植物新鮮葉片去提取DNA，確保在DNA條形碼鑒定過程中用于擴增DNA 模板量充足。另外，加強在基因水平上的研究，獲取更豐富的堿基序列，不斷優(yōu)化條形碼質量，從而可以選擇片段更小的基因作為 DNA 條形碼[41]。通用性越好的條形碼鑒定物種的類別越多，但尚未存在適用于所有動植物的通用條形碼。另外，DNA條形碼對于天然礦物類的藥材無法進行鑒別，因此DNA條形碼技術仍需要與傳統(tǒng)鑒定方法結合，才能在中藥材鑒定中做到全面、準確[42]。另外DNA條形碼技術只能做到藥材真?zhèn)舞b別，而對于解決藥材質量的評定還存在很大困難[43]。

6?展望

如今DNA條形碼已經大量應用在各個領域，不僅僅是在鑒定中藥材方面，對于植物進化、系統(tǒng)分類、保護物種多樣性也有著重要意義[44]。DNA條形碼作為一種新型的分子鑒定技術，因其快速、簡便、鑒別度高等優(yōu)點在中藥鑒定領域處于高速發(fā)展的趨勢。中藥在性狀發(fā)生改變加工成飲片的狀態(tài)下也不影響鑒別，擴大了鑒定樣本的容量。引物序列的通用性，可實現(xiàn)DNA條形碼的流程化和規(guī)范化，僅僅通過相關的實驗人員即可完成批量鑒定。然而新的技術也必然存在著不完善的地方，單一靠DNA條形碼技術無法完全實現(xiàn)對中藥來源的控制[45]。許多通用引物在擴增過程中易發(fā)生堿基缺失突變，并且在 PCR 擴增過程中也存在擴增失敗的情況[46]。在常用鑒定植物的5對條形碼中，ITS2序列對大多數(shù)植物可以進行鑒定，但也仍存在不少植物鑒定效果不理想或不能鑒定的情況[47]。因此，要逐步完善DNA 條形碼鑒定體系需要多種序列進行補充。在鑒定中藥材的過程中，應充分整合動植物類藥材的遺傳信息DNA，及其藥材性狀、組織或細胞的顯微特征等，然后按照相應的分析方法對中成藥原料藥材或未知藥材進行多角度、多層次的鑒別，更加精確化、客觀化地鑒定中藥材[48]。

中藥材的質量不僅關系到整個中醫(yī)中藥行業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，更是向海內外弘揚我國中醫(yī)文化的重要基礎和必要條件。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，科技手段的日新月異，人們能夠從微觀的角度來鑒定中藥材的質量，建立更加優(yōu)越的中藥材質量檢控體系。DNA條形碼技術載入《中國藥典》至今，因其獨特的鑒定優(yōu)勢已成為鑒定中藥材的重要手段之一。在大力推進DNA條形碼技術發(fā)展的同時，也應不斷創(chuàng)新發(fā)展更多的鑒定方法，來保證中藥材使用的安全性和有效性，使我國的中醫(yī)藥事業(yè)持續(xù)穩(wěn)步上升。

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