結(jié)核分枝桿菌相關(guān)毒力因子研究進(jìn)展

陳曉林 舒磊 馮旰珠

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院呼吸內(nèi)科211166;2南京醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科210011

由結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的結(jié)核病是全球十大 “致死性疾病”之一。研究表明,Mtb屬胞內(nèi)寄生菌,其感染、致病及預(yù)后等在很大程度上取決于宿主免疫與病原體之間的相互作用的結(jié)果[1],巨噬細(xì)胞則是該過(guò)程中的關(guān)鍵免疫效應(yīng)細(xì)胞。Mtb感染肺組織時(shí)主要由巨噬細(xì)胞攝取,且其致病的關(guān)鍵過(guò)程均發(fā)生在巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中,被活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧、活性氮中間產(chǎn)物,使之與吞噬體融合,從而發(fā)揮抗菌作用。然而,在長(zhǎng)期的演化進(jìn)程中,Mtb已經(jīng)進(jìn)化出包括產(chǎn)生毒力因子等在內(nèi)的有效的方法來(lái)抵御這些宿主免疫細(xì)胞的殺滅效應(yīng)。

與其他一些細(xì)菌病原體產(chǎn)生特定的毒力因子不同,Mtb是通過(guò)毒力相關(guān)因子和宿主防御反應(yīng)的復(fù)雜免疫過(guò)程導(dǎo)致病理?yè)p傷,因此對(duì)Mtb毒力的深入研究有助于了解涉及結(jié)核病發(fā)病的不同階段的相關(guān)因子。早在2003年人們通過(guò)鑒定194種Mtb基因,首次粗略評(píng)估了Mtb毒力因子的全基因組[2]。通過(guò)轉(zhuǎn)座子定點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)小鼠感染模型研究顯示:有126個(gè)基因是Mtb與宿主巨噬細(xì)胞作用過(guò)程中必需的[3]。新近研究推斷可能有超過(guò)400種其他基因在Mtb與宿主巨噬細(xì)胞作用過(guò)程中是必需的[4]。這些研究結(jié)果為Mtb的毒力基因的定義提供了初步框架,其中許多基因是參與Mtb本身編碼基礎(chǔ)代謝的毒力蛋白,但更多單個(gè)基因在致病過(guò)程中的確切作用尚待研究。目前有關(guān)MtbESX/Ⅶ型分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的分子及細(xì)胞膜的幾種類型的復(fù)合脂質(zhì)組分與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關(guān)系研究相對(duì)較為集中,本文擬就該領(lǐng)域的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 Ⅶ型分泌系統(tǒng)

致病菌可將毒力因子分泌到胞外或定位于細(xì)菌表面存在Ⅰ～Ⅶ型分泌系統(tǒng)。研究表明,Mtb的培養(yǎng)濾液中缺少經(jīng)典的信號(hào)蛋白序列,但存在新的蛋白分泌系統(tǒng),該系統(tǒng)被命名為ESX/T7SS分泌系統(tǒng),即Ⅶ型分泌系統(tǒng)。

1.1 ESX-1分泌系統(tǒng)Mtb基因組編碼5種Ⅶ型分泌系統(tǒng)(ESX-1～ESX-5),專門(mén)用于跨細(xì)胞膜運(yùn)輸選定的蛋白質(zhì)底物[5]。編碼分泌機(jī)制的核心組分 (ESX保守組分,Ecc)的基因在5個(gè)基因座中均為保守,其中ESX-4具有編碼最簡(jiǎn)單和最早的Ⅶ型分泌系統(tǒng)的最小基因組。ESX-1被認(rèn)為是發(fā)病機(jī)制中最重要的分泌系統(tǒng)之一。通過(guò)對(duì)Mtb、卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)、自然減毒株田鼠分枝桿菌的基因組比較研究發(fā)現(xiàn):構(gòu)建BCG和田鼠分枝桿菌的RD1區(qū)的敲入株,均能編碼分泌蛋白早期分泌抗原靶6 000蛋白(early secretary antigentic target 6kDa protein,ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10,其長(zhǎng)期以來(lái)均被認(rèn)為是有效的T細(xì)胞抗原。而通過(guò)構(gòu)建MtbH37Rv的RD1缺失突變株也證實(shí)了其分泌的抗原ESAT-6和培養(yǎng)濾液蛋白10是Mtb毒力所必需的。

Mtb作為一種胞內(nèi)病原體,當(dāng)其被巨噬細(xì)胞吞噬后,可通過(guò)干擾或延遲吞噬體向吞噬溶酶體的分化,或通過(guò)控制吞噬體酸化作用,促使吞噬體膜的破裂[6],從而避免了水解酶在宿主酸性環(huán)境下對(duì)Mtb的活性氧和活性氮的殺滅作用,該過(guò)程被認(rèn)為是Mtb的免疫逃避策略。吞噬體破裂可反復(fù)地與ESX-1相關(guān)聯(lián),而MtbESX-1缺陷菌株及BCG都沒(méi)有這種作用,即不能引起吞噬體破裂,提示ESX-1在抵抗Mtb宿主巨噬細(xì)胞的免疫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。利用對(duì)細(xì)菌表面β-內(nèi)酰胺酶活性敏感的熒光探針和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的研究發(fā)現(xiàn),在感染的后期階段,Mtb可將胞內(nèi)組分轉(zhuǎn)運(yùn)到巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中,表明Mtb感染后能與宿主巨噬細(xì)胞存在聯(lián)系[6]。最重要的是,由于BCG菌株中的RD1區(qū)缺失,導(dǎo)致吞噬體破裂不能完成,從而導(dǎo)致隨后的免疫逃避信號(hào)傳導(dǎo)中斷,限制了疫苗的保護(hù)功效。因此,開(kāi)發(fā)更有效的疫苗株的方法之一是設(shè)計(jì)具有功能性ESX-1系統(tǒng)的重組BCG菌株。盡管包含有RD1區(qū)域的BCG菌株確實(shí)提高了毒力作用,存在安全風(fēng)險(xiǎn),但作為替代方案,制備具有生物安全水平2級(jí)的ESX-1基因座的BCG菌株[7],能提高其在小鼠感染模型中的保護(hù)效力,同時(shí)與功能性ESX-1系統(tǒng)的重組BCG菌株相比,毒力顯著降低。當(dāng)用親本BCG菌株時(shí),功能性吞噬體破裂誘導(dǎo)的幾種宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)未出現(xiàn)。因?yàn)锽CG中缺失分泌ESX1抗原的免疫原性,故應(yīng)當(dāng)與其他有助于保護(hù)性免疫加強(qiáng)的疫苗聯(lián)合使用,例如減毒的Mtb疫苗MTBVAC[8],該疫苗作為活疫苗目前處于臨床研發(fā)階段[9]。

最近的研究發(fā)現(xiàn):Mtb的RD7區(qū)Rv2346c基因編碼的分泌蛋白為ESAT-6家族成員,與其他ESAT-6家族蛋白具有超過(guò)90%的同源性[9]。本課題組也發(fā)現(xiàn):Rv2346c通過(guò)p38/miRNA/NF-κB信號(hào)通路抑制腫瘤壞死因子α和IL-6的產(chǎn)生,從而增強(qiáng)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活[10]。該基因可作為一個(gè)毒力因子促進(jìn)肺組織的炎性損傷,增加小鼠的死亡率,為Mtb疫苗的研究策略提供了一個(gè)新思路。

1.2 ESX-5分泌系統(tǒng) 除了ESX-1分泌系統(tǒng)外,ESX-5也與分枝桿菌的致病力有關(guān)。ESX-5是最近進(jìn)化的Ⅶ型分泌系統(tǒng),只存在于生長(zhǎng)緩慢的分枝桿菌中。ESX-5分泌系統(tǒng)最初是在海洋分枝桿菌中發(fā)現(xiàn),其主要功能可能是分泌底物,這些底物主要屬于PE和PPE蛋白的獨(dú)特家族,分別以其N端Pro-Glu和Pro-Pro-Glu基序命名。這些蛋白家族約占MtbH37Rv基因組的8%,根據(jù)其C末端序列中存在的基序,進(jìn)一步分為不同的亞組。PE的形成基于多拷貝的富含GC重復(fù)序列 (PE_PGRS),PPE的形成基于多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)序列 (PPE-MPTR),它們僅存在于致病物種中[11]。對(duì)Mtb的不同ESX-5突變體的研究顯示:ESX-5系統(tǒng)的失活導(dǎo)致PPE蛋白輸出缺陷、細(xì)胞壁完整性受損和強(qiáng)衰減[12]以及PE_PGRS輸出的缺陷[13]。此外,ESX-5區(qū)域中編碼PPE/PE基因的突變體:如MtbΔppe25-pe19顯示衰減,但由于基因組中大量的PE/PPE同源體的表達(dá),通過(guò)交叉反應(yīng)性,仍能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)[14]。雖然Δppe25-pe19構(gòu)建體衰減的分子機(jī)制目前尚不清楚,但對(duì)某些PE和PPE蛋白輸出的干擾也與所選Mtb菌株的毒力增加有關(guān)。

通過(guò)對(duì)已經(jīng)突變或丟失基因ppe38Mtb菌株的研究發(fā)現(xiàn):PPE38是ESX-5介導(dǎo)的超過(guò)80個(gè)PE_PGRS和PPEMPTR底物分泌所必需的。該研究還發(fā)現(xiàn):ppe38基因座通過(guò)IS6110介導(dǎo)的重組過(guò)程[15],在所謂的 “北京”家族的大多數(shù)Mtb菌株中缺失,因此提出了關(guān)于PE_PGRS和PPE-MPTR蛋白的毒力作用及其分泌機(jī)制中的重要性[16]。

1.3 ESX-3分泌系統(tǒng)ESX-3除了在鐵和鋅的獲取中扮演重要作用外,研究發(fā)現(xiàn)ESX-3與Mtb毒性也有關(guān)[17]。它通過(guò)幾種PE/PPE蛋白[18]及其分泌的底物EsxH和EsxG,抑制巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞激活MtbCD4+T淋巴細(xì)胞特異性抗原,進(jìn)而抑制吞噬體成熟[19]。

2 其他表面暴露因子

幾十年來(lái),分枝桿菌細(xì)胞包膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的豐富性一直是人們研究的主題,Mtb細(xì)胞包膜具有復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu),其常規(guī)質(zhì)膜中包括一層肽聚糖與共價(jià)連接的多糖,又稱為阿拉伯半乳聚糖,其五酰氨基末端被霉菌酸酯化。質(zhì)膜中的這些成分含有60～90個(gè)碳原子的α-烷基-β-羥基脂肪酸,是分枝桿菌膜的特征結(jié)構(gòu),這對(duì)于分枝桿菌細(xì)胞的存活是必需的[20]。這些菌酸殘基是分枝桿菌外膜內(nèi)部小葉的主要成分,為一種獨(dú)特的脂質(zhì)雙分子層;外部小葉由各種類型的非共價(jià)結(jié)合脂質(zhì)組成,如海藻糖單霉菌酸酯、海藻糖二霉菌酸酯 (trehalose dimycolates,TDM)、結(jié)核菌醇二菌酸鹽 (phthiocerol dimycocerosates,PDIM)、二乙酰海藻糖、聚乙酰海藻糖及硫脂質(zhì)等等,其中一些由MmpL家族的分枝桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)酵饽?從而構(gòu)成藥物開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)[21]。

2.1 TDM 基于幾十年積累的研究,分枝桿菌表面脂質(zhì)和糖結(jié)合物是進(jìn)入巨噬細(xì)胞、刺激各種受體的重要毒力因子。早在20世紀(jì)50年代,TDM已被證明是一種重要的效應(yīng)分子,也被稱為 “索狀因子”,它被認(rèn)為是顯微鏡下Mtb呈特征性索狀外觀的唯一因素。通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素,TDM可導(dǎo)致細(xì)胞因子及NO的產(chǎn)生,同時(shí),TDM可能是導(dǎo)致吞噬體延遲成熟的原因之一。TDM存在于所有分枝桿菌屬的細(xì)菌的細(xì)胞壁,僅有菌酸殘基存在微小的修飾變化。通過(guò)構(gòu)建缺乏所有S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的Mtb菌株及缺乏含氧功能基團(tuán)的菌株的實(shí)驗(yàn)研究,菌酸修飾的免疫調(diào)節(jié)作用得到證實(shí)[22]。在小鼠感染模型中使用這些菌株的結(jié)果顯示出嚴(yán)重的減毒和抗原特異性免疫應(yīng)答的變化,這取決于特定修飾的存在。

2.2 Ham基因Ham基因?qū)τ诤跫∏虻鞍?(含甲氧基的氧化霉菌酸酯)的合成是必需的。研究表明:氧化型分枝菌酸的形成依賴Ham基因,Ham基因的缺失不僅影響細(xì)胞壁的完整性,對(duì)特異性抑制IL-12p40介導(dǎo)的反應(yīng)似乎也很重要。鑒于分枝菌酸生物合成的復(fù)雜性,脂肪酸合成酶在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用中起關(guān)鍵作用[23]。Ham基因編碼脂肪酸合成酶系統(tǒng)Ⅱ核心成分的基因突變,如kasB和hadC,均能影響分枝菌酸組成,從而影響各菌株的毒力[24],特別是氧化霉菌酸酯,對(duì)于形成泡沫狀巨噬細(xì)胞至關(guān)重要,其分化感染的巨噬細(xì)胞富含脂滴,能夠使細(xì)菌持久存在[25]。最近的研究闡明:這些分枝菌酸類的生物合成和代謝可以為研究它們對(duì)分枝桿菌的毒力和持久性的影響提供新線索[26]。

2.3 PhoP基因 先前關(guān)于硫脂質(zhì)的毒力作用曾被提出質(zhì)疑,然而最近研究發(fā)現(xiàn):PhoP基因缺失或低表達(dá)菌株影響了硫脂質(zhì)生物合成,提示硫脂質(zhì)的產(chǎn)物與PhoP/R雙組分調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)[27]。PhoP是雙組分PhoP/R中的一個(gè)調(diào)節(jié)基因,PhoP敲除株在小鼠體內(nèi)的毒力作用明顯減弱[28]。MTBVAC是一種敲除phoP和fadD26(Rv2930)的弱毒Mtb候選疫苗,與BCG的安全性和生物分布相同,但保護(hù)性更強(qiáng),是第1個(gè)進(jìn)入臨床評(píng)估的結(jié)核菌減毒活疫苗[29]。

2.4 PDIM PDIM可作為菌膜的組成部分,是結(jié)核桿菌細(xì)胞壁的主要脂類成分之一,僅存在于致病性分枝桿菌中,但也有人認(rèn)為它們與宿主質(zhì)膜的結(jié)合能夠改變其生物物理特性,PDIM通過(guò)靶向宿主質(zhì)膜脂質(zhì)組織來(lái)控制巨噬細(xì)胞的侵襲,改變其生物物理特性,從而對(duì)吞噬細(xì)胞受體及其下游的信號(hào)通路起調(diào)控作用[30]。此外,研究表明PDIM對(duì)于ESX-1介導(dǎo)的有效吞噬體破裂是必不可少的,其機(jī)制尚待闡明[31]。

2.5 聚酮化合物合酶系統(tǒng)(polyketide synthase system,pks)最近研究證實(shí):pks5基因敲除后,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁脂質(zhì)成分LOS合成完全消失,而將pks5基因互補(bǔ)回突變株,其LOS合成完全恢復(fù)。LOS是分枝桿菌重要的脂質(zhì)成分,對(duì)LOS功能的研究還不深入。有研究表明,純化的LOS能夠抑制巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α的分泌,提示LOS可能類似于酚類糖脂,是分枝桿菌的毒力脂質(zhì)[32]。

2.6 脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)Mtb細(xì)胞包膜上的甘露糖化成分,如磷脂酰肌醇甘露糖苷、脂甘露聚糖和LAM,因其在宿主細(xì)胞識(shí)別中的重要性最近被廣泛研究[33]。在體外,LAM結(jié)構(gòu)的變化對(duì)免疫原性的影響引起了很多關(guān)注。LAM是Mtb慢生長(zhǎng)的分枝桿菌細(xì)胞壁表面特有的脂糖,有研究報(bào)道,其末端的甘露糖加帽結(jié)構(gòu)是Mtb的關(guān)鍵抑制性表位,介導(dǎo)免疫逃逸。它的核心骨架主要由3個(gè)結(jié)構(gòu)組成,分別是阿拉伯聚糖和甘露聚糖形成的多糖主鏈、錨定物PIMs和末端帽子結(jié)構(gòu)。致病物種特異性甘露糖帽基序?qū)е碌腗anLAM主要起免疫逃逸作用,因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度的升高是吞噬體成熟和與溶酶體融合所必需的,ManLAM可以抑制鈣離子濃度的升高,從而抑制吞噬體的成熟和溶酶體融合。另外,不常見(jiàn)的甲硫基-D-木糖基序也證實(shí)存在于Mtb中,每分子ManLAM結(jié)合一個(gè)甘露糖帽,最近發(fā)現(xiàn)的負(fù)責(zé)其生物合成的遺傳基因座將能夠闡明其生物學(xué)作用[34]。牛分枝桿菌BCG和Mtb的突變株產(chǎn)生無(wú)帽LAM,而體內(nèi)復(fù)制和細(xì)胞因子則無(wú)變化[35]。這種重要的糖綴合物的生物學(xué)功能尚需進(jìn)行更深入的研究。前人在PIM寡糖、LAM阿拉伯寡糖及LAM類似物的合成,包括立體選擇性地生成β連接的阿拉伯糖苷鍵等方面做了大量的工作,雖然這些工作為更加有效地制備LAM衍生物并將其應(yīng)用于LAM的生物學(xué)研究,包括基于LAM的疫苗研發(fā)等提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),但是到目前為止,仍然鮮有結(jié)核桿菌寡糖綴合物疫苗的研究報(bào)道或取得突破性進(jìn)展。

2.7 CpnT CpnT是為數(shù)不多的特征性整合蛋白之一,是一種具有N末端外毒素結(jié)構(gòu)域的通道形成蛋白,可導(dǎo)致Mtb誘導(dǎo)感染細(xì)胞壞死的能力[36]。CpnT似乎不會(huì)誘導(dǎo)大量的細(xì)胞因子產(chǎn)生,因此被認(rèn)為允許“靜息”的細(xì)胞免疫逃逸和導(dǎo)致結(jié)核桿菌感染的傳播[37]。

2.8 Ag85復(fù)合物 幾種獨(dú)立于Ⅶ型分泌系統(tǒng)的重要的分泌蛋白也被描述為毒力因子。Ag85由Ag85A、Ag85B和Ag85C 3種組分組成,屬于早期分泌蛋白,由Mtb的TAT分泌系統(tǒng)產(chǎn)生,在BCG中該蛋白復(fù)合體基因缺失。Ag85復(fù)合物在Mtb的細(xì)胞壁中起著非常重要的作用,Ag85復(fù)合物具有分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶的活性,可以使海藻糖轉(zhuǎn)移和沉積在細(xì)胞壁上,在Mtb細(xì)胞壁合成晚期起重要作用。先前研究認(rèn)為:這些抗原與疫苗接種有關(guān)[38]。但最近研究發(fā)現(xiàn):產(chǎn)生免疫應(yīng)答的Ag85蛋白表達(dá)水平受PhoP/R雙組分調(diào)控系統(tǒng)的影響,使用Ag85作為免疫原不適用于保護(hù)所有Mtb菌株,因?yàn)榭赡艽嬖诿庖咦R(shí)別的菌株譜系依賴性變異[39]。在MVA85A疫苗與BCG比較的Ⅱb期臨床試驗(yàn)中顯示MVA85A疫苗無(wú)保護(hù)作用,認(rèn)為Ag85A只產(chǎn)生了微弱的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。在MTBVAC疫苗中,Ag85B也可高度表達(dá)[40],細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng),研究表明Ag85B參與脂質(zhì)的積累和儲(chǔ)存,是Mtb潛伏期間所必需的一個(gè)重要抗原。

3 其他毒力因子

研究發(fā)現(xiàn):Mtb毒力相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可能參與PE/PPE基因的調(diào)控,主要包括Sigma因子、擬核相關(guān)的全局性轉(zhuǎn)錄因子Lsr2和EspR、雙組分調(diào)控系統(tǒng)MprAB和PhoPR,這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間可能存在相互作用,它們是直接還是間接參與PE/PPE基因的調(diào)控還有待于進(jìn)一步研究。

另一個(gè)值得注意的例子是蛋白酪氨酸磷酸酶PtpA,它直接與空泡H+-ATPase結(jié)合,因此是吞噬體酸化的主要抑制劑之一[41]。然而,如前所述,分枝桿菌對(duì)吞噬體酸化和成熟的抑制相當(dāng)復(fù)雜,比如通過(guò)SecA2介導(dǎo)的經(jīng)典分泌途徑輸出的特異性蛋白質(zhì)(SapM、PknG),均會(huì)影響含分枝桿菌的吞噬體的酸化和成熟[42]。

最后,強(qiáng)調(diào)一個(gè)名為moaA1-D1的基因簇。最近研究發(fā)現(xiàn):由該基因簇編碼的蛋白質(zhì)可使結(jié)核桿菌能夠利用硝酸鹽作為呼吸鏈,從而在嚴(yán)重缺氧狀態(tài)中得以存活,這一特征在宿主形成缺氧性肉芽腫顯得特別重要[43]。特異性獲得moaA1-D1簇的分子桿菌已被用作研究Mtb進(jìn)化的生物模型[44]。

4 展望

總之,進(jìn)一步研究了解Mtb的相關(guān)毒力因子,有助于明確Mtb在促進(jìn)或限制宿主巨噬細(xì)胞感染的具體病理機(jī)制,進(jìn)而影響疾病轉(zhuǎn)歸。結(jié)核病作為與宿主相關(guān)的疾病的特殊性以及某些Mtb菌株家族在全球人群中的的特異性,使得結(jié)核病的感染過(guò)程異常復(fù)雜。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展有助于發(fā)現(xiàn)更多的與Mtb致病相關(guān)的因子。因此,需要對(duì)Mtb病原體繼續(xù)深入研究,以便更好地了解使Mtb成為強(qiáng)大且具有破壞性的病原體的進(jìn)化適應(yīng)過(guò)程,并尋找新的可能的解決方案,從而為抗結(jié)核藥物及新型抗結(jié)核疫苗的研發(fā)提供關(guān)鍵的靶標(biāo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突