超聲波誘變對(duì)猴頭菇粗多糖的影響

張帥，程昊，邱彩霞，陳賢如

1(肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶，526601) 2(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州，545006) 3(蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧，530004)

猴頭菇(Hericiumerinaceus)是一種珍貴的食藥兩用的大型食用菌，富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素及微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)和功效成分[1-3]，尤其是猴頭菇多糖因具有較強(qiáng)的抗氧化、抑菌、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞等多種生理活性而常用于保健食品的研發(fā)[4-5]。提高食用菌中多糖的含量及活性成為當(dāng)前食用菌領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，菌種誘變技術(shù)或許是解決這一問題的一種有效方法。目前關(guān)于猴頭菇誘變方法的報(bào)道較多，如紫外線、60Co-γ射線、離子束注入及交變磁場(chǎng)誘變等[6-10]，但采用超聲波誘變猴頭菇尚未見報(bào)道。

超聲波誘變的原理是通過超聲波的機(jī)械作用、熱作用、空化作用產(chǎn)生的高溫高壓來破壞微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并引起組織細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，從而使DNA突變率增加。超聲波穿透性好，誘導(dǎo)時(shí)不用開蓋誘導(dǎo)，這樣可減少微生物污染的幾率。同時(shí)，超聲波誘變法操作簡(jiǎn)單，安全性高，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，一般實(shí)驗(yàn)室條件都可達(dá)到[11-14]。本研究通過對(duì)猴頭菇超聲波誘變處理，考察了超聲波誘變對(duì)猴頭菇粗多糖含量及其抑菌效果的影響，不僅為提高猴頭菇粗多糖含量和抑菌活性提供了一種簡(jiǎn)單可行的方法，而且為其他食用菌中粗多糖等活性成分的提高提供了方法借鑒，這對(duì)于食用菌行業(yè)的發(fā)展以及食用菌產(chǎn)品的深加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

猴頭菇菌種，本學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室試管保藏；PDA培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，依說明書配好后分裝試管和平面皿，滅菌后做成PDA斜面和PDA平板若干，冷藏備用。

液體種子培養(yǎng)基組成：可溶性淀粉5%、蔗糖1%、KH2PO40.3%、Mg2SO4·7H2O 0.15%、酵母膏0.1%，pH 6.0。液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖2.2%、麩皮1%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、酵母膏0.05%、蛋白胨0.02%。原種培養(yǎng)基組成：棉籽殼75%、木屑10%、麩皮13%、蔗糖1%、石膏1%。栽培培養(yǎng)基組成：棉籽殼45%、木屑41%、麩皮12%、蔗糖1%、石膏1%。細(xì)菌固體培養(yǎng)基組成：牛肉膏0.3%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、瓊脂2%。細(xì)菌液體培養(yǎng)基組成：除不加瓊脂外，其他同細(xì)菌固體培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基中所有百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分比。

1.2 主要儀器設(shè)備

YQ-120B型超聲波清洗機(jī),上海易凈超聲波儀器有限公司；DGX-9143 B-1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1240紫外分光光度計(jì),島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴箱,江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；XB-10B高速多功能粉碎機(jī),東莞市隆鑫機(jī)電設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菇菌懸液制備

取PDA斜面保藏的猴頭菇菌種，用無菌接種鏟取一塊約0.5 cm2接入到10 mL液體種子培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)3 d，即得猴頭菇菌懸液。

1.3.2 猴頭菇超聲波誘變

將猴頭菇菌懸液稀釋至106CFU/mL，取若干試管分別裝入10 mL稀釋后的菌懸液，置于40 kHz、300 W超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行誘導(dǎo)，分組誘導(dǎo)2、4、6、8、10 min，各平行3次。每支試管各取0.1 mL稀釋液涂于不同PDA平板中，25oC培養(yǎng)7 d。以未超聲誘變處理的猴頭菇菌懸液為對(duì)照組，計(jì)算致死率，見公式(1)：

(1)

1.3.3 猴頭菇變異菌株初篩

從致死率為70%～95%的平板中, 挑取各平板萌發(fā)最早、生長(zhǎng)最旺盛的菌落，轉(zhuǎn)接到PDA斜面中，作為猴頭菇變異菌株。待PDA斜面長(zhǎng)滿菌絲體后，接到PDA平板中，25 ℃培養(yǎng)7 d。根據(jù)對(duì)猴頭菇菌絲體的生長(zhǎng)勢(shì)、菌絲密度、菌絲色澤、邊緣整齊度的評(píng)分，選出總分比原始菌株高的變異菌株。

1.3.4 猴頭菇變異菌株復(fù)篩

原始菌株與經(jīng)1.3.3挑選出的猴頭菇變異菌株，分別接入液體種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，25 ℃培養(yǎng)3 d后，分別取15 mL接入200 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)15 d，得猴頭菇發(fā)酵液。通過測(cè)定猴頭菇發(fā)酵液中菌絲體的生物量和粗多糖含量，篩選出生物量最大、粗多糖含量最高的猴頭菇變異菌株。

1.3.4.1 猴頭菇菌絲體生物量測(cè)定

將猴頭菇發(fā)酵液于離心機(jī)中4 000 r/min離心10 min，取沉淀猴頭菇菌絲體，洗滌3次后于65 ℃烘干至恒重，計(jì)算猴頭菇發(fā)酵液中菌絲體的生物量，見公式(2)：

(2)

1.3.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取干燥恒重的葡萄糖0.1 g，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，然后吸取10 mL再定容于100 mL容量瓶，得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。采用苯酚-硫酸法[15]，按表1完成操作后，搖勻放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，然后冷卻至室溫，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。最終建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.675x-0.011 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，在0.01～0.06 mg/mL葡萄糖含量與吸光度呈良好線性關(guān)系。

表1 苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4.3 猴頭菇菌絲體粗多糖的測(cè)定

將經(jīng)1.3.4.1處理后的猴頭菇菌絲體粉碎，過30目篩，精確稱重。用熱水浸提[16]，固液比1∶10，浸提溫度90 ℃，浸提時(shí)間2.5 h，過濾去渣，浸提液用Sevag法[17-18]除蛋白后，得到猴頭菇菌絲體粗多糖溶液，然后稀釋至合適濃度即得樣品液。準(zhǔn)確吸取樣品液1 mL，按1.3.4.2的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品液的粗多糖含量，見公式(3)：

粗多糖含量/[g·(100g)-1]=

(3)

1.3.5 猴頭菇袋料栽培

將猴頭菇原始菌株和經(jīng)1.3.4復(fù)篩出的變異菌株進(jìn)行袋料栽培[19]，通過比較不同猴頭菇的生長(zhǎng)情況，考察猴頭菇超聲波誘變是否有價(jià)值。

1.3.6 猴頭菇子實(shí)體粗多糖的測(cè)定

將猴頭菇子實(shí)體65℃烘干至恒重，粉碎，過30目篩，精確稱重。用熱水浸提[20]，固液比1∶10，浸提溫度80℃，浸提時(shí)間3 h，過濾去渣，浸提液用Sevag法除蛋白后，得到猴頭菇子實(shí)體粗多糖溶液，然后稀釋至合適的濃度即得樣品液。準(zhǔn)確吸取樣品液1 mL，按照1.3.4.2的方法測(cè)定吸光度，并計(jì)算樣品液的粗多糖含量，見公式(4)：

粗多糖含量/[g·(100g)-1]=

(4)

1.3.7 濾紙片法測(cè)定猴頭菇粗多糖的抑菌效果

1.3.7.1 猴頭菇子實(shí)體粗多糖溶液的制備

按照1.3.6的方法制備猴頭菇原始菌株、變異菌株子實(shí)體粗多糖溶液。

1.3.7.2 猴頭菇粗多糖濾紙片的制備

用打孔機(jī)將普通定性濾紙打成直徑為5.0 mm圓形紙片，放進(jìn)干燥潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)121 ℃、30 min高壓滅菌后，放入干燥箱內(nèi)干燥[21]。取干燥后的普通定性濾紙片，分別放進(jìn)體積相同的猴頭菇原始菌株、變異菌株的子實(shí)體粗多糖溶液，浸潤(rùn)30 min后備用。

1.3.7.3 參照菌種菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作為參照菌種進(jìn)行活化，然后將參照菌種分別接入10 mL細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。然后各進(jìn)行10倍遞增稀釋，稀釋成一系列濃度梯度，各參照菌種菌懸液的每個(gè)濃度各取0.1 mL涂布于細(xì)菌固體培養(yǎng)基平板并培養(yǎng)24 h，選取恰能鋪滿平板的菌懸液備用。

1.3.7.4 猴頭菇粗多糖抑菌效果測(cè)定

對(duì)1.3.7.3選出的參照菌種菌懸液，各取0.1 mL均勻涂布于平板上，再貼上在猴頭菇子實(shí)體粗多糖溶液中浸潤(rùn)的濾紙片，每個(gè)平板貼4片濾紙片，均勻間隔，輕壓紙片，于37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察抑菌圈，并用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變時(shí)間對(duì)猴頭菇的影響

由表2可知，猴頭菇菌懸液經(jīng)超聲波處理不同時(shí)間后，菌落最早萌發(fā)時(shí)間均會(huì)提前1～2 d，說明超聲波誘變可加速菌落萌發(fā)。隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，猴頭菇菌落萌發(fā)數(shù)降低，致死率升高。從致死率為70%～95%的平板中，挑選出萌發(fā)時(shí)間最早和生長(zhǎng)最旺盛的菌落，分別編號(hào)H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-6、H-7、H-8、H-9作為猴頭菇變異菌株，猴頭菇原始菌株編號(hào)為H。

表2 誘變時(shí)間對(duì)猴頭菇的影響

2.2 猴頭菇變異菌株初篩結(jié)果

將上述編號(hào)為H、H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-6、H-7、H-8、H-9的猴頭菇菌株進(jìn)行平板培養(yǎng)，通過對(duì)生長(zhǎng)勢(shì)、菌絲密度、菌絲色澤及邊緣整齊度的評(píng)分，選出比原始菌株H評(píng)分高的變異菌株。結(jié)果見表3和圖1。

表3 猴頭菇菌株生長(zhǎng)情況的比較

注：評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：生長(zhǎng)勢(shì)“+++”為3分，“++”為2分，“+”為1分；菌絲密度“較大”為4分，“大”為3分，“小”為2分，“較小”為1分；菌絲色澤“潔白”為3分，“白”為2分，“灰白”為1分；邊緣整齊度“較整齊”為3分，“整齊”為2分，“不規(guī)則”為1分。

圖1 猴頭菇菌株生長(zhǎng)情況比較

可見，猴頭菇菌懸液經(jīng)超聲波誘導(dǎo)后，其生長(zhǎng)勢(shì)、菌絲密度、菌絲色澤及邊緣整齊度均發(fā)生了明顯變化。由表3和圖1可見，猴頭菇菌絲密度比較大的，其邊緣整齊度大都呈不規(guī)則狀；而菌絲密度小、菌絲色澤淺的，其邊緣則都比較整齊。最終篩選出評(píng)分比原始菌株H高的猴頭菇變異菌株為：H-2、H-5、H-7、H-9。

2.3 猴頭菇變異菌株復(fù)篩結(jié)果

將編號(hào)為H-2、H-5、H-7、H-9的猴頭菇變異菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，挑選出生物量最大、菌絲體多糖含量最高的猴頭菇變異菌株。結(jié)果如表4。

由表4可知，液體培養(yǎng)后，變異菌株菌絲體生物量比原始菌株高的為H-2、H-7、H-9；變異菌株菌絲體粗多糖含量比原始菌株高的為H-2(高出1.2 %)。因此，篩選出的優(yōu)良猴頭菇菌株為變異菌株H-2。另外，變異菌株H-5的生物量比變異菌株H-7要低，但H-5的菌絲體粗多糖含量卻比H-7要高，這說明猴頭菇經(jīng)超聲波誘變后，菌絲體生物量大的，其粗多糖含量不一定高。

表4 猴頭菇菌株液體培養(yǎng)后產(chǎn)物產(chǎn)量的比較

2.4 猴頭菇袋料栽培結(jié)果

取猴頭菇原始菌株H和變異菌株H-2，先二級(jí)種擴(kuò)大培養(yǎng)，再用聚丙烯塑料袋裝料進(jìn)行栽培。結(jié)果如表5和圖2。

表5 猴頭菇袋料栽培結(jié)果

圖2 猴頭菇袋料栽培結(jié)果

由表5可知，猴頭菇變異菌株H-2和原始菌株H的菌絲體長(zhǎng)滿時(shí)間一致，但H-2幼蕾萌發(fā)時(shí)間比H提早兩天。由圖2可看出，H-2子實(shí)體色澤偏白，而H子實(shí)體色澤偏黃。H-2子實(shí)體比H子實(shí)體的干重增加了3.8 %，粗多糖含量提高了2.3 %。另外，對(duì)比表4和表5可知，猴頭菇菌絲體粗多糖含量高于子實(shí)體粗多糖含量。

2.5 猴頭菇子實(shí)體粗多糖的抑菌效果

將從猴頭菇原始菌株H與變異菌株H-2子實(shí)體提取的多糖，分別配成濃度為10.54 mg/mL的粗多糖溶液，用濾紙片法測(cè)定抑菌效果，抑菌圈直徑小于9 mm 為低度敏感；9～11 mm為中度敏感；11 mm以上為高度敏感。結(jié)果見表6和圖3。

表6 猴頭菇子實(shí)體多糖抑菌效果

注：“—”表示沒有抑菌效果。

圖3 H-2對(duì)金黃色葡萄糖球菌的抑菌效果

由表6可知，猴頭菇原始菌株H子實(shí)體多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均無抑菌效果。猴頭菇變異菌株H-2子實(shí)體多糖對(duì)金黃色葡萄球菌高度敏感(見圖3)，而對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌沒有抑菌效果。這可能是因?yàn)楹镱^菇經(jīng)超聲波誘變后，其子實(shí)體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而提高了其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

3 結(jié)論

本研究利用超聲波對(duì)猴頭菇進(jìn)行誘變。通過猴頭菇平板培養(yǎng)初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩，得到菌絲體生物量和粗多糖含量均高于原始菌株H的變異菌株H-2。猴頭菇袋料栽培試驗(yàn)表明，變異菌株H-2菌絲體和子實(shí)體的粗多糖含量比原始菌株H分別提高了1.2%和2.3%。另外，比較了H-2和H兩種猴頭菇子實(shí)體粗多糖的抑菌效果，結(jié)果表明，猴頭菇H-2子實(shí)體粗多糖，對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)抑菌作用，而原始菌株的子實(shí)體粗多糖對(duì)金黃色葡萄球菌不敏感?？梢?，猴頭菇菌株經(jīng)超聲波誘變后不僅可提高子實(shí)體粗多糖含量，而且也會(huì)增強(qiáng)其抑菌活性，因此超聲波誘變可以作為改良食用菌生物性狀的一項(xiàng)有效措施。