流式細胞術檢測細胞周期實驗條件的影響因素分析

沈鏈鏈，鐘義紅，熊建平，劉艷青

(南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京 211166)

流式細胞術(FCM)能夠?qū)渭毎M行定量分析與分選，通過對細胞內(nèi)化學成分的檢測獲取細胞內(nèi)各種生命物質(zhì)的參數(shù)，為細胞生物學、生物醫(yī)學提供全新的技術支持[1]。細胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細胞從親本分裂結(jié)束到子細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。FCM是檢測細胞周期分布情況的最佳方法[2]，可為細胞周期的動力學研究提供有力的分析手段。用FCM檢測細胞周期的實驗步驟雖然不多，但存在實驗結(jié)果不穩(wěn)定(平行性不好)，固定效果不好，變異系數(shù)(CV)過大等一系列問題，尤其是處理過的、狀態(tài)不佳的細胞。因此，本實驗利用細胞周期阻滯劑秋水仙素處理結(jié)腸癌細胞株(HCT116)，研究FCM檢測過程的各個環(huán)節(jié)對結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HCT116人結(jié)腸癌細胞株(中國科學院生物化學與細胞生物學研究所)；1640培養(yǎng)基、胰酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；秋水仙素(愛必信上海生物科技有限公司)；BD FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；碘化丙啶PI染色液(含RNase)細胞周期試劑(美國BD公司)。

1.2 分組設置

1.2.1 固定方式對結(jié)果的影響 HCT116細胞于培養(yǎng)皿中過夜培養(yǎng)；待細胞貼壁后鋪滿60%～70%，更換為含有秋水仙素的培養(yǎng)液，細胞經(jīng)終濃度為1.25 μmol/L的秋水仙素刺激16 h后，收集全部培養(yǎng)液(含貼壁不牢的細胞)。貼壁細胞經(jīng)胰酶消化后，與培養(yǎng)液混合，1 000 r/min離心5 min，加入適當培養(yǎng)液稀釋，細胞計數(shù)后每份樣本取1×106個細胞至離心管，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液后分別按下列3種方式固定：緩慢逐滴滴入預冷的70%乙醇2 mL；一邊渦旋一邊加預冷的70%乙醇2 mL；經(jīng)0.6 mL PBS吹散細胞后再加1.4 mL預冷的純乙醇(均為3個平行，共9個樣本)。4℃固定過夜后，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次，1 500 r/min離心5 min，加0.5 mL細胞周期試劑，避光15 min后300目濾網(wǎng)過濾，上機。

1.2.2 細胞數(shù)量對結(jié)果的影響 細胞加藥處理同“1.2.1”。細胞計數(shù)后每份樣本分別取1×106、0.33×106、0.5×106、2×106和5×106個細胞至離心管(均為3個平行，共15個樣本)，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min后按“1.2.1”中的第3種方式固定，4℃過夜后，PBS洗、染色步驟同“1.2.1”。

1.2.3 固定溫度對結(jié)果的影響 細胞加藥處理同“1.2.1”。細胞計數(shù)后每份樣本取1×106個細胞至離心管，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min后按“1.2.1”中的第3種方式固定，分別放置于4℃過夜、-20℃過夜、4℃放置6 h后于-20℃過夜和常溫過夜(均為3個平行，共12個樣本)。第2天，PBS洗、染色步驟同“1.2.1”。

1.2.4 固定時間對結(jié)果的影響 細胞加藥處理同“1.2.1”。細胞計數(shù)后每份樣本取1×106個細胞至離心管，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min后按“1.2.1”中的第3種方式固定，分別放置于-20 ℃ 1 d(過夜)，28 d，56 d，70 d(均為3個平行，共12個樣本)。固定后，PBS洗、染色步驟同“1.2.1”。

1.2.5 染色時間對結(jié)果的影響 細胞加藥處理同“1.2.1”。細胞計數(shù)后每份樣本取1×106個細胞至離心管，PBS洗1次，1 000 r/min離心5 min后按“1.2.1”中的第3種方式固定，4℃過夜，PBS 洗，加0.5 mL細胞周期試劑染色，分別于染色15 min后放置0、1、2、4、8 h檢測(均為3個平行，共15個樣本)。

1.3 上機檢測

用流式細胞儀檢測樣本，以FSC-H為橫坐標，SSC-H為縱坐標，設置門R1，以FL2-A為橫坐標，F(xiàn)L2-W為縱坐標，設置門R2，總共收集R2門內(nèi)20 000個細胞。

1.4 細胞周期結(jié)果分析

Modfit 軟件分析，得出各個期細胞百分比及CV值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 固定方式的影響

3種固定方式的檢測結(jié)果見表1?！?0%冷乙醇在渦旋儀上加入”組的CV值大于“70%冷乙醇逐滴加入”組，且差異有統(tǒng)計學意義，而 “PBS和純乙醇(3 ∶7)”組與“70% 冷乙醇逐滴加入” 組的差異無統(tǒng)計學意義。但從散點圖(圖1)看，“PBS和純乙醇(3 ∶7)”組的固定效果最好，表現(xiàn)為細胞群最集中。因此在后續(xù)的實驗中，均采取PBS和純冷乙醇(3 ∶7)的方法固定。

固定方式G1期(%)G2期(%)S期(%)CV(%) 70%冷乙醇逐滴加入1.71±0.2190.50±0.657.79±0.746.71±0.12 70%冷乙醇在渦旋儀上加入1.64±0.2891.57±0.636.80±0.367.23±0.03a PBS和純冷乙醇(3 ∶7)1.94±0.0789.90±0.288.16±0.326.81±0.10 F值1.8777.2005.69828.730 P值0.2330.0250.0410.001

a：P<0.05，與“70%冷乙醇逐滴加入”組相比

A：70%冷乙醇逐滴加入；B：70%冷乙醇在渦旋儀上加入；C：PBS 和純冷乙醇(3 ∶7)

圖1 3種固定方式的樣本Modfit分析圖

2.2 細胞數(shù)量的影響

見表2。細胞數(shù)量不同會在一定程度上影響結(jié)果，當細胞數(shù)為標準數(shù)量的1/3時，CV值比標準數(shù)量組大，且差異有統(tǒng)計學意義，可能影響數(shù)據(jù)的可信度。當細胞數(shù)為標準數(shù)量的1/2時，G2期的比例較標準數(shù)量組大，且CV值增大，差異有統(tǒng)計學意義。當細胞數(shù)達到標準數(shù)量的2倍時，G2、S期的比例改變(P<0.05)，且CV值明顯增大(P<0.05)。當細胞數(shù)達到標準數(shù)量的5倍時，雖然各期值的變化無明顯差異，但CV值明顯增大，可能與試劑量相對于細胞數(shù)量而言不夠、染色不充分有關。從圖2可見，細胞數(shù)太多或太少時，曲線極不平滑或G2峰出現(xiàn)了雙峰，數(shù)據(jù)可信度降低。因此，取細胞數(shù)為1×106進行后續(xù)實驗。

2.3 固定溫度的影響

與4℃組相比，-20℃組、“4℃～-20℃”組的檢測結(jié)果及CV值差異無統(tǒng)計學意義。常溫組G2期、S期的比例與4℃組相比，差異有統(tǒng)計學意義，見表3。因此固定后的樣本不能放置于常溫。

2.4 固定時間對結(jié)果的影響

由表4可見，28 d組，56 d組，70 d組的各期比例與1 d組相比，差異均無統(tǒng)計學意義；CV值明顯增大(P<0.05)，但并無隨固定時間逐漸增大的趨勢。

細胞數(shù)G1期(%)G2期(%)S期(%)CV(%) 1×1065.60±0.1179.90±0.9014.50±0.997.19±0.16 0.33×1065.23±0.2881.29±0.9713.48±1.248.95±0.62a 0.5×1064.65±0.2281.46±0.34a13.89±0.528.00±0.21a 2×1066.05±0.1983.43±0.33a10.52±0.52a8.67±0.12a 5×1066.48±1.3380.57±0.4212.95±0.959.33±0.16a F值3.89312.2878.90321.897 P值0.0370.0010.0020.000

a：P<0.05，與1×106細胞數(shù)組相比

A：1×106；B：0.33×106；C：0.5×106；D：2×106；E：5×106

表3 不同固定溫度的檢測結(jié)果

a：P<0.05，與4℃組相比

固定時間G1期(%)G2期(%)S期(%)CV(%)1 d0.75±0.0586.78±0.7012.47±0.748.00±0.1628 d1.14±0.5487.48±0.6611.38±1.048.88±0.18a56 d0.87±0.1187.73±1.1011.40±1.118.78±0.41a70 d1.03±0.1687.53±0.6211.44±0.478.73±0.06aF值1.0600.8021.1038.422P值0.4180.5270.4030.007

a：P<0.05，與1 d組相比

2.5 染色時間對結(jié)果的影響

由表5可見，1 h、2 h組與0 h相比，各期比例及CV值無有統(tǒng)計學意義的改變。4 h組G2期的比例比0 h明顯降低(P<0.05)。8 h組G1期的比例較0 h明顯升高，CV值明顯增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，染色完成后需在2 h之內(nèi)完成檢測。

染色時間G1期(%)G2期(%)S期(%)CV(%)0 h0.98±0.0590.39±0.188.63±0.237.87±0.101 h1.36±0.2690.48±0.198.16±0.448.23±0.432 h1.12±0.0890.22±0.498.66±0.568.19±0.154 h1.34±0.2289.01±0.73a9.65±0.808.36±0.25

(續(xù)表5)

a：P<0.05，與0 h相比

3 討論

細胞周期檢測看似簡單，但是要獲得可信和穩(wěn)定的結(jié)果卻并不容易。本實驗從固定方法、細胞數(shù)量、固定后存放溫度，固定后存放于-20℃的時間，以及染色時間等多方面探討其可能的影響因素。

最常用、簡單的固定方式是在細胞沉淀中直接加入70%冷乙醇固定，但從本實驗結(jié)果來看，用PBS吹成單細胞懸液后再加預冷純乙醇的方法能獲得更好的效果，該方法也曾有文獻報道[3]。PBS吹散細胞沉淀后加入純乙醇(兩者比例為3 ∶7)是筆者推薦的方法，其原因可能是PBS吹散后形成單細胞懸液，從而使單細胞更加快速地與乙醇接觸，所以固定效果更好。該方法對于狀態(tài)不佳的細胞樣本(如轉(zhuǎn)染后的細胞等)的實驗結(jié)果有很好的改善作用。另外，董波等[4]認為，固定細胞的過程中加入終濃度為 3%的小牛血清是一種簡單的、能有效地保護細胞膜使細胞不易粘連的技術措施。

按照試劑盒說明書的要求，每份樣本應含有1×106細胞，而在實際工作中，由于每個樣本計數(shù)太耗時而未做計數(shù)或者一份樣本的全部細胞都不夠1×106等原因，導致樣本間的細胞數(shù)量差異很大。從我們的實驗結(jié)果來看，細胞數(shù)的差異影響檢測結(jié)果以及CV值。因此，每份樣本均應計數(shù)，與試劑盒要求一致，避免由此引起的誤差。胡夢裳等[5]的實驗結(jié)果表明，碘化丙啶濃度在一定范圍內(nèi)的變化并不影響檢測的各期百分比的數(shù)值。而本實驗結(jié)果表明，同樣劑量的試劑，不同的細胞數(shù)，對各期的百分比有一定的影響，但影響最大的還是CV值。唐國華等[6]報道，每秒進樣細胞數(shù)影響各期的百分比。在我們的實驗中，雖然都使用低速上樣，但由于樣本的細胞濃度不同，導致每個樣本的每秒上樣細胞數(shù)目不同，也可能是導致結(jié)果差異的原因之一。

由于固定后短期存放于4℃或-20℃無差異，因此建議可以直接將樣本放入-20℃，過夜后檢測或長期存放均可。-20℃存放70 d之內(nèi)檢測僅對CV值稍有影響，對各周期的細胞百分比無明顯影響。有學者認為固定20 min[7]或30 min[3]即可，且結(jié)果與固定較長時間(18 d)的結(jié)果類似。這也說明，只要固定所使用的試劑以及操作正確，固定后的細胞狀態(tài)非常穩(wěn)定，固定時間對結(jié)果的影響并不明顯。

染色完成后2 h檢測對結(jié)果影響不大，若樣本太多，而且樣本細胞數(shù)太少，應進行分批染色，減少染色后的等待上機時間。

總的來說，用流式細胞術檢測細胞周期時，細胞數(shù)應遵照試劑盒要求，推薦用PBS吹散加入預冷的純乙醇固定，固定后置于-20℃，70 d內(nèi)用周期試劑染色，染完后2 h內(nèi)上機檢測。