虎杖苷改善氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷的機(jī)制

曹媛媛，李桂成，鄧加雄，李云峰，段智

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，郴州 423000)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是膿毒癥的常見并發(fā)癥，但因其缺乏有效的治療手段，在臨床上具有較高的病死率。研究證實(shí)，肺泡上皮線粒體損傷是ALI的重要發(fā)病機(jī)制，因此維護(hù)線粒體穩(wěn)定可以顯著改善ALI[1]。線粒體自噬是指細(xì)胞通過選擇性自噬清除受損或功能紊亂的線粒體以維持正常線粒體質(zhì)量或功能[2，3]的現(xiàn)象，該作用已在心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等方面的疾病中被證實(shí)[4-6]，但在肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用研究較為鮮見。在本研究中我們通過H2O2的氧化應(yīng)激作用介導(dǎo)肺泡上皮損傷細(xì)胞模型，探討虎杖苷是否通過上調(diào)線粒體自噬減輕肺泡上皮線粒體損傷，從而闡述線粒體自噬在ALI發(fā)病中的重要作用，為臨床治療ALI尋找可能靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

熒光素-熒光素酶試劑盒購于美國Promega公司；膜電位JC-1探針及鈣黃綠素-氯化鈷購自美國Sigma公司；DCFH-DA活性氧(reactive oxygen species,ROS)熒光探針購自上海碧云天公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 (cell count kit-8,CCK-8)購自上海Dojindo公司；線粒體膜蛋白[線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶(translocase of outer mitochondrial membrane 20,TOM20)和線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶(translocase of inner mitochondrial membrane 23,TIM23)]，及線粒體生成調(diào)節(jié)因子[線粒體轉(zhuǎn)錄因子(mitochondrial transcription factor A,mTFA)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α, PGC-1α)]單克隆抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自武漢ABclonal公司；mt-Keima-COX8慢病毒滴度液購于南京PPL公司；A549細(xì)胞購自廣州賽庫生物公司。

1.2 分組及處理

將A549細(xì)胞分為4組(n=6)：對照組細(xì)胞僅接受0.1%濃度的DMSO處理60 min；模型組細(xì)胞同等濃度DMSO預(yù)處理30 min后予以H2O2250 μmol/L刺激30 min[7]；治療組細(xì)胞接受虎杖苷50 μmol/L[3]預(yù)處理30 min后予以H2O2250 μmol/L刺激30 min；抑制劑組細(xì)胞接受線粒體自噬抑制劑mdivi-1 10 μmol/L[3]及虎杖苷50 μmol/L預(yù)處理30 min后予以H2O2250 μmol/L刺激30 min。

1.3 線粒體自噬水平檢測

(1)通過Western blotting檢測TOM20(1∶2 000)、TIM23(1∶2 000)、mTFA(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)表達(dá)水平。細(xì)胞充分裂解，凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。(2)參照既往研究[3]，采用Keima法檢測線粒體自噬，按照說明書操作將mt-Keima-COX8慢病毒滴度液與細(xì)胞共同孵育48 h，并以Puromycin藥物篩選后穩(wěn)定傳代。4組細(xì)胞經(jīng)不同處理后，置于共聚焦顯微鏡下觀察。綠色熒光代表未發(fā)生自噬的線粒體，紅色熒光代表發(fā)生自噬的線粒體，以紅色/綠色熒光面積作為線粒體自噬水平。

1.4 線粒體膜電位測定

4組細(xì)胞經(jīng)不同處理后經(jīng)PBS洗后重懸，與JC-1(工作濃度為5 μmol/L)在37℃孵育15 min 后共聚焦顯微鏡下觀察并記錄數(shù)據(jù)。以紅色/綠色熒光的比值來衡量線粒體去極化的程度，并以對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。比值越高表明線粒體去極化降低，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)增加，反之則去極化增加，MMP下降。

1.5 ROS檢測

采用DCFH-DA ROS熒光探針檢測細(xì)胞ROS水平。4組細(xì)胞經(jīng)不同處理后與5 μmol/L濃度的DCFH-DA工作液在37℃下共孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，并以對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。

1.6 細(xì)胞ATP含量測定

采用熒光素-熒光素酶法檢測線粒體ATP水平。將細(xì)胞懸液加入96孔白板，每孔100 μl(約2×104個(gè)細(xì)胞)。于室溫下加入等體積CellTiter-Glo檢測試劑，混勻細(xì)胞，并孵育10 min，用酶標(biāo)儀檢測各組A值，并以對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 細(xì)胞活性檢測

在96孔板中接種200 ul的細(xì)胞懸液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組經(jīng)過不同條件處理后棄上清，加入10 μl CCK-8溶液及培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀上檢測A值，并以對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 4組細(xì)胞線粒體自噬水平比較

與對照組比較，模型組細(xì)胞TOM20及TIM23表達(dá)顯著下降，提示發(fā)生線粒體自噬；與模型組比較，治療組TOM20及TIM23表達(dá)顯著下降，提示線粒體自噬增強(qiáng)；與治療組比較，抑制劑組TOM20及TIM23表達(dá)顯著增加，提示mdivi-1抑制了虎杖苷上調(diào)的線粒體自噬，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。為排除線粒體生成下降對線粒體自噬的影響，我們檢測了用以反映線粒體生成的mTFA及PGC-1α。結(jié)果顯示，4組細(xì)胞mTFA及PGC-1α水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過Keima法進(jìn)一步檢測并驗(yàn)證線粒體自噬水平，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細(xì)胞紅色/綠色熒光面積比值顯著增加，提示發(fā)生線粒體自噬；與模型組比較，治療組細(xì)胞紅色/綠色熒光面積比值顯著增加，提示線粒體自噬增強(qiáng)；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞紅色/綠色熒光面積比值顯著減小，提示線粒體自噬被抑制(圖1，表1)。

圖1 4組細(xì)胞線粒體自噬結(jié)果

表1 4 組細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白比較

TOM20: translocase of outer mitochondrial membrane 20; TIM23: translocase of inner mitochondrial membrane 23; mt-TFA: mitochondrial transcription factor A; PGC-1α: peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Compared with control group,*P<0.05; compared with model group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

2.2 4組細(xì)胞MMP比較

對照組、模型組、治療組與抑制劑組MMP分別為(100.0±5.9)%、(54.2±4.8)%、(70.8±3.6)%和(56.0±6.1)%。與對照組比較，模型組細(xì)胞MMP顯著下降，治療組MMP較模型組顯著增加，而抑制劑組MMP較治療組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖2)。

圖2 JC-1法檢測4組細(xì)胞MMP結(jié)果

MMP: mitochondrial membrane potential; JC-1: 5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide.

2.3 4組細(xì)胞ROS水平比較

對組組、模型組、治療組與抑制劑組細(xì)胞ROS水平分別為(100.0±5.2)%、(213.0±20.1)%、(173.0±15.9)%和(201.5±17.5)%。與對照組比較，模型組細(xì)胞ROS水平顯著上升；與模型組比較，治療組ROS水平顯著下降；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞ROS水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖3)。

圖3 DCFH-DA檢測細(xì)胞ROS水平結(jié)果

2.4 4組細(xì)胞ATP和活性水平比較

對照組、模型組、治療組及抑制劑組ATP分別為(100.0±4.3)%、(70.8±6.3)%、(82.7±4.2)%和(71.3±5.2)%；細(xì)胞活性依次是(100.0±3.8)%、(73.2±4.4)%、(82.7±6.3)%和(74.1±4.8)%。與對照組比較，模型組細(xì)胞活性、ATP水平顯著下降；與模型組比較，治療組細(xì)胞活性、ATP水平顯著增加；與治療組比較，抑制劑組細(xì)胞活性、ATP水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

線粒體是普遍存在于真核生物的細(xì)胞器，有細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”之稱[8]，在氧化應(yīng)激、細(xì)胞信息傳遞、代謝調(diào)節(jié)及內(nèi)源性凋亡途徑的啟動(dòng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1]。研究證實(shí)，肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷是ALI的重要發(fā)病機(jī)制，線粒體可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)參與ALI[1,3]。因此，維持線粒體功能正常是可能治療ALI的方法之一[9,10]。線粒體自噬指細(xì)胞線粒體發(fā)生去極化損傷，損傷線粒體被特異性包裹進(jìn)自噬體中，并與溶酶體融合，從而完成損傷線粒體的降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[3]。研究表明上調(diào)線粒體自噬可以減輕百草枯介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡[11]。而抑制絲裂原活化蛋白激酶3表達(dá)可以減輕ALI，這可能與其上調(diào)線粒體自噬有關(guān)[12]。我們以往證實(shí)，虎杖苷可以通過抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)減輕脂多糖介導(dǎo)的ALI，但機(jī)制尚未明確[2]?；谝陨涎芯浚狙芯考僭O(shè)并探討了虎杖苷是通過上調(diào)線粒體自噬減輕氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可以顯著抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞ROS水平上升及細(xì)胞活力下降。另外，TOM20及TIM23是線粒體膜蛋白，只存在于線粒體中，當(dāng)線粒體自噬增強(qiáng)時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平下降[3]。為檢測虎杖苷對線粒體自噬的影響，我們檢測了線粒體質(zhì)量蛋白TOM20及TIM23，結(jié)果顯示虎杖苷可以下調(diào)TOM20及TIM23表達(dá)，即增強(qiáng)了線粒體自噬水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，被廣泛應(yīng)用為線粒體自噬抑制劑的mdivi-1[3]可以顯著抑制虎杖苷誘導(dǎo)的自噬保護(hù)作用。這些結(jié)果表明虎杖苷可能通過上調(diào)線粒體自噬水平發(fā)揮保護(hù)作用。mTFA是線粒體轉(zhuǎn)錄因子，在線粒體DNA的復(fù)制和線粒體生成中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用；PGC-1α是共激活轉(zhuǎn)錄因子成員，可調(diào)控線粒體生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)線粒體生成；在以往研究中通過檢測mTFA及PGC-1α表達(dá)可以反映線粒體生成[3]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)虎杖苷不會(huì)引起mTFA及PGC-1α表達(dá)的變化，因而排除了因線粒體生成下降造成TOM20及TIM23表達(dá)下降的可能。另外我們還通過Keima法檢測線粒體自噬變化。Keima蛋白定位于線粒體基質(zhì),當(dāng)線粒體自噬體與酸性溶酶體融合后Keima蛋白的熒光信號(hào)由綠色轉(zhuǎn)為紅色，因此通過熒光信號(hào)的轉(zhuǎn)換可定量反映線粒體自噬的水平。結(jié)果顯示虎杖苷可以增強(qiáng)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體自噬，而mdivi-1可以抑制虎杖苷對線粒體自噬的增強(qiáng)作用。

線粒體自噬通過清除損傷的線粒體維持線粒體正常功能，我們進(jìn)一步檢測了虎杖苷對線粒體功能的影響。線粒體功能不全通常是由于線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放引起[13]。正常線粒體處于電壓內(nèi)負(fù)外正的極化狀態(tài)，這種跨膜電位是線粒體合成ATP必備的電壓驅(qū)動(dòng)力。我們結(jié)果顯示虎杖苷顯著抑制了氧化應(yīng)激介導(dǎo)的MMP下降，而這種保護(hù)作用可以被mdivi-1顯著抑制。另外，線粒體是ATP生成的主要細(xì)胞器，我們還檢測了細(xì)胞ATP水平以反映線粒體功能的變化。結(jié)果顯示虎杖苷可以顯著抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的ATP水平下降，同樣，這種保護(hù)作用被mdivi-1抑制。

總之，我們的研究認(rèn)為虎杖苷可能通過上調(diào)線粒體自噬水平以減輕氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體損傷，而抑制線粒體自噬可以顯著降低虎杖苷的保護(hù)作用。