粒細胞集落刺激因子在新生兒缺氧缺血性腦病中的腦保護作用研究進展

許夢杰 杜 江 綜述 王 斌 審校

1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院兒科中心（廣東廣州 510280）；2.廣州市炎癥與免疫性疾病重點實驗室（廣東廣州 510280）

缺氧缺血性腦病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是指大腦的血液和氧氣供應(yīng)不足而導(dǎo)致的嚴重腦損傷。盡管胎兒監(jiān)測和新生兒重癥監(jiān)護醫(yī)學(xué)不斷改進，圍產(chǎn)期HIE仍然是新生兒死亡和永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因，如腦癱，智力低下，學(xué)習障礙和癲癇等[1]。目前HIE的主要臨床治療包括，抗驚厥藥、低溫治療以及液體和電解質(zhì)管理，但療效并不明確。由于目前新生兒HIE發(fā)病率仍較高，因此需要尋求更有效的治療方法[2-3]。

粒細胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）是一種骨髓干細胞動員劑，主要作用于中性粒細胞系造血細胞的增殖、分化和活化，臨床主要用于預(yù)防和治療腫瘤放療或化療后引起的白細胞減少癥[4]。越來越多的證據(jù)表明，G-CSF 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的神經(jīng)保護功能，G-CSF介導(dǎo)的腦保護作用的潛在機制是抗細胞凋亡，誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)與血管形成的再生以及抗炎作用等[5]。但其確切的神經(jīng)保護機制尚不明確。本文綜述G-CSF 在治療新生兒缺氧缺血性腦病中的信號傳導(dǎo)通路、腦保護機制，以及G-CSF聯(lián)合其他藥物治療HIE的方法。

1 G-CSF腦保護作用的 信號傳導(dǎo)通路

G-CSF 通過結(jié)合特定的G-CSF 受體（G-CSF receptor，G-CSFR）而產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)。G-CSFR 是一種I 型跨膜蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)由免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、細胞因子受體同源結(jié)構(gòu)域和三個纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物組成，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)由三個氨基酸序列組成[6]。G-CSFR不僅存在于多種造血細胞，如嗜中性粒細胞，單核細胞和血小板上，還存在于非造血細胞，如內(nèi)皮細胞，神經(jīng)元細胞，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，室管膜細胞和脈絡(luò)叢細胞等細胞中。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，G-CSFR 廣泛但不均勻地分布于海馬CA 3 區(qū)、齒狀回、嗅球、大腦皮層的錐體細胞、小腦、腦干的浦肯野細胞、腹側(cè)外側(cè)核以及內(nèi)側(cè)和外側(cè)丘腦[7-8]。成年人大腦缺血損傷后，G-CSFR 在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的表達上調(diào)，而新生兒在缺氧缺血損傷后大腦同樣有G-CSFR的表達，且表達量明顯高于正常大腦[9]。當G-CSF與G-CSFR 結(jié)合后，主要是通過三條信號通路來發(fā)揮神經(jīng)保護作用的：兩面神激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus Kinase/ Signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）、Ras/絲裂原活化蛋白激酶（Ras/Mitogen-activated protein kinase，Ras/MAPK）、磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/ Protein Kinase B，PI3K/Akt）[10]。

1.1 JAK/STAT通路

當G-CSF與受體結(jié)合后，活化G-CSFR引發(fā)JAK激酶的磷酸化并隨后募集STATs 等轉(zhuǎn)錄因子，進一步影響細胞核內(nèi)的基因表達。STATs 家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6組成，其中STAT1、STAT3、STAT5參與G-CSF誘導(dǎo)的細胞增殖、分化及抗細胞凋亡作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血大鼠在給予G-CSF治療后，梗死半影區(qū)神經(jīng)元上的STAT3表達上調(diào)，STAT3通過激活bcl-2來介導(dǎo)抗細胞凋亡功能，除外STAT3 表達上調(diào)還可增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子或堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持[12]。

1.2 Ras/MAPK通路

MAPK 可分為4 個亞族：ERK、p 38、JNK 和ERK5。G-CSF與受體結(jié)合后可激活Ras蛋白，進而活化神經(jīng)元上的ERK，其中ERK 1/2 的短暫激活以及ERK5強烈而持續(xù)的激活在抗神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮作用[13]。實驗中發(fā)現(xiàn)，G-CSF通過一系列細胞內(nèi)途徑減弱高糖、游離脂肪酸和低氧引起的人腦血管內(nèi)皮細胞損傷，其中包括調(diào)節(jié)ERK1/2的激活及JNK和p38的失活[14]。還有實驗證明，ERK 1 和ERK 2 為神經(jīng)營養(yǎng)因子，而JNK3 及ERK5 則有提高神經(jīng)元存活率的作用[15-16]。

1.3 PI3K/Akt通路

研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF 在抗神經(jīng)元細胞凋亡作用中，PI 3K/Akt 途徑起到了最顯著的作用[13]。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，G-CSF 與受體結(jié)合后通過PI 3K/Akt 途徑抑制糖原合成激酶3β（Glycogen synthesis kinase-3β，GSK-3 β）活性來減弱新生SD 大鼠缺血缺氧后的神經(jīng)細胞凋亡、神經(jīng)炎癥和血腦屏障的破壞[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF 在腦出血后通過增強PI 3K/Akt 信號通路活性，促進B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因和血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達，減少神經(jīng)細胞凋亡，增加血容量，改善腦出血后神經(jīng)功能和促進血管生成[19]。

2 G-CSF 的神經(jīng)保護作用機制

2.1 抗凋亡

HIE 神經(jīng)元受損的主要機制之一就是細胞凋亡，而成熟度低的大腦在缺血后則會出現(xiàn)更嚴重的細胞凋亡[20]。在新生大鼠實驗中，G-CSF 與受體結(jié)合后，通過多種途徑抑制細胞凋亡誘發(fā)的程序性細胞死亡，從而保護神經(jīng)元[9,18,21]。G-CSF通過JAK/STAT3信號傳導(dǎo)途徑上調(diào)Pim-1基因表達，從而增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，抑制促凋亡蛋白Bax調(diào)節(jié)細胞色素c 從線粒體釋放，進一步抑制凋亡執(zhí)行蛋白半胱天冬酶3（Caspase 3）的激活，從而抑制細胞凋亡[9]。研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF 通過PI 3K/Akt 途徑抑制下游GSK-3β表達水平，從而減少凋亡神經(jīng)細胞數(shù)目及大腦梗塞面積[18,21]。

2.2 抗炎

在腦損傷時誘發(fā)炎癥反應(yīng)已被大家熟知，包括中性粒細胞浸潤，小膠質(zhì)細胞活化和循環(huán)單核細胞數(shù)量的增加。在缺血期間，炎癥因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β和趨化因子由多種活化細胞產(chǎn)生，包括內(nèi)皮細胞，小膠質(zhì)細胞，神經(jīng)元，血小板，白細胞和成纖維細胞[22-23]。缺血缺氧新生大鼠給予G-CSF治療后，炎癥因子核因子κB激酶抑制劑（Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKKβ），NF-κB，TNF-α，IL-1 β 和IL-12 下調(diào)，而抗炎細胞因子IL-10 表達增強[17]。在早產(chǎn)羊HIE模型中發(fā)現(xiàn)，G-CSF治療可減少腦部炎癥，明顯降低小膠質(zhì)細胞的高度特異性標志物離子化鈣結(jié)合銜接分子1（Ionized calcium binding adapter molecule 1，IBA-1）的水平，即說明G-CSF抑制了小膠質(zhì)細胞增殖來減少腦部炎癥反應(yīng)[24]。

2.3 穩(wěn)定血腦屏障

血腦屏障是一種高度專化的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，可作為生化屏障，將腦組織與血液中循環(huán)的物質(zhì)分開，并維持腦微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。由于新生兒血腦屏障發(fā)育尚未成熟，當發(fā)生缺血缺氧時極易引起血腦屏障連接復(fù)合體的破壞，可進一步加重腦水腫損傷，這是HIE 腦損傷和腦組織損傷的重要原因之一[25]。在新生大鼠HIE模型中，G-CSF 能夠通過降低β-連環(huán)蛋白磷酸化和通過G-CSFR/PI3K/Akt/GSK-3β途徑的p120-連環(huán)蛋白磷酸化來減少血腦屏障的破壞[17]。在同一模型中還發(fā)現(xiàn)，給予G-CSF 治療后，HIE 新生大鼠腦水含量下降，說明G-CSF保持血腦屏障的完整性的作用[26]。

2.4 抑制下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamuspituitary-adrenal gland，HPA）軸活性

腦損傷包括胎兒在宮內(nèi)的缺氧會上調(diào)HPA 軸的活性導(dǎo)致基礎(chǔ)血漿皮質(zhì)醇水平升高，而出生后若早期降低HPA 軸活性可以預(yù)防顱內(nèi)出血等與缺血缺氧性腦損傷相關(guān)的顱腦神經(jīng)損傷[27]。在HIE新生大鼠中發(fā)現(xiàn)，G-CSF通過激活JAK2/PI3K/PDE3B途徑降解細胞內(nèi)cAMP，從而抑制HPA軸活性來降低腎上腺皮質(zhì)酮合成，進一步減小腦梗死面積，逆轉(zhuǎn)體重減輕，減少腦水含量，減少神經(jīng)細胞凋亡等來實現(xiàn)對神經(jīng)的保護作用[26,28]。

2.5 促進神經(jīng)血管再生

在腦組織缺氧缺血時，VEGF 與受體結(jié)合后可刺激血管與神經(jīng)再生實現(xiàn)對腦組織保護作用。當腦組織缺氧缺血時，氧分壓及二氧化碳分壓的失衡刺激VEGF的分泌增加，進一步誘導(dǎo)血管生成，提高血流灌注，改善氧合，減輕腦損傷及神經(jīng)細胞凋亡，促進神經(jīng)發(fā)生[29-30]。在急性缺血性腦損傷大鼠中，G-CSF治療組的VEGF表達強度顯著高于對照組，提示G-CSF在缺氧缺血性腦損傷中可能通過提高VEGF的表達水平實現(xiàn)血管生成及神經(jīng)再生的保護作用[31]。

2.6 動員造血干細胞

G-CSF是一種強大的骨髓干細胞動員劑，可刺激自體骨髓干細胞的增殖，并動員骨髓干細胞從骨髓進入外周血。研究證明，G-CSF可直接動員骨髓干細胞，促使外周血中的大量骨髓干細胞向腦缺血區(qū)遷移，形成內(nèi)源性骨髓干細胞移植，使大腦梗死灶周圍的CD 34+細胞明顯增多，大腦梗死灶減小，神經(jīng)功能修復(fù)能力增強，動物生存率提高[32-33]。在HIE早產(chǎn)羊模型中，早產(chǎn)羊接受G-CSF治療后外周血中CD34+細胞在白細胞中所占比例明顯提高，治療組在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞再生，增強髓鞘再生能力方面優(yōu)于非治療組。這一結(jié)果也說明G-CSF在HIE中發(fā)揮神經(jīng)保護作用與動員造血干細胞密切相關(guān)[34]。

3 聯(lián)合治療

HIE 在臨床上是一種需要綜合治療的疾病，目前研究者也在不斷探索G-CSF與其他藥物聯(lián)合治療HIE的方法，以更好促進受損神經(jīng)的恢復(fù)。在新生大鼠動物試驗中，G-CSF與抗中性粒細胞胞抗體聯(lián)合治療可顯著減少大腦梗塞體積，改善神經(jīng)功能且能同時減少中性粒細胞計數(shù)，提高用藥的安全性[35]。G-CSF和促紅細胞生成素的組合療法不僅協(xié)同改善行為功能，而且還促進神經(jīng)發(fā)生和血管生成，同時降低星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)，減輕HIE新生大鼠的腦損傷[36]。在HIE大鼠模型中，G-CSF與干細胞因子聯(lián)合治療不僅可以在預(yù)防腦萎縮方面起到協(xié)同作用，還可以顯著改善神經(jīng)功能[37]。上述研究顯示，G-CSF與其他藥物的聯(lián)合治療在HIE治療上有很好的發(fā)展前景，不僅可以增強神經(jīng)保護作用，還可以提高用藥的安全性，但如何選用最好的治療組合仍需不斷地進行探索。

綜上，在動物模型中，G-CSF 被證實可通過抗凋亡、抗炎、穩(wěn)定血腦屏障、抑制HPA軸活性、促進神經(jīng)血管再生及動員造血干細胞等多種機制，在HIE中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。近年來，G-CSF 在治療成人神經(jīng)損傷性疾病上已進行I期、II期臨床試驗，在新生兒HIE治療及改善預(yù)后等方面可能也具有廣闊的前景。但在G-CSF在真正運用到HIE臨床治療前，仍需進一步探討其作用機制、最佳劑量、治療時間窗及不良反應(yīng)等。