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    現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物領(lǐng)域的應(yīng)用

    2020-03-01 09:47:55
    建筑與預(yù)算 2020年1期
    關(guān)鍵詞:原位雜交分子生物學(xué)高通量

    曹 雨

    (沈陽建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院,遼寧 沈陽 110168)

    隨著水體污染的加重,水體中有機(jī)污染物的降解成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。作為降解有機(jī)污染物質(zhì)的主力軍——微生物,其物種多樣性及群落結(jié)構(gòu)對生態(tài)環(huán)境均會造成一定的影響。為了更好地了解微生物的狀態(tài)、確保生態(tài)環(huán)境安全、改善生態(tài)環(huán)境質(zhì)量,將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)引入到環(huán)境工程微生物領(lǐng)域中。

    現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),即通過對分子水平的線性結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測,進(jìn)而比較各個物種、細(xì)胞的生理狀態(tài)。May等[1]構(gòu)建了含有引物結(jié)合位點(diǎn)的合成DNA片段,用于定量分析10種不同的微生物;Zabkiewicz等[2]使用基于16S rRNA基因的序列分析的方法,確定從外生菌根和樺樹根部分離的細(xì)菌種類。武志華等[3]采用PCR-DGGE技術(shù)分析內(nèi)蒙古西部地區(qū)土壤細(xì)菌的多樣性,為未來該地區(qū)的細(xì)菌資源開發(fā)利用及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    現(xiàn)如今廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)有Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、

    熒光原位雜交技術(shù)、基因芯片、qPCR技術(shù)及高通量測序技術(shù)等[4],這些技術(shù)在分析微生物多樣性、判別微生物種類、降解有機(jī)污染物等方面發(fā)揮著重要作用。

    1現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)

    1.1核酸雜交技術(shù)

    核酸雜交技術(shù)是通過核酸分子雜交檢測靶序列,進(jìn)而可以定量或定性檢測DNA序列片段。隨著核酸雜交技術(shù)不斷的完善,在此基礎(chǔ)上,又形成了一系列衍生技術(shù)。

    印跡雜交技術(shù)根據(jù)所分析的物質(zhì)是DNA還是RNA,分為Southern印跡雜交和Northern印跡雜交,這種雜交技術(shù)多用于染色體檢查等生物領(lǐng)域。原位雜交可以準(zhǔn)確地對核酸序列進(jìn)行定位,有利于分析微生物種類多樣性。在原位雜交的基礎(chǔ)上,用熒光進(jìn)行標(biāo)記,便形成了新的雜交方法——熒光原位雜交。由于熒光原位雜交具有定位準(zhǔn)確、特異性好等優(yōu)點(diǎn),因此在環(huán)境微生物領(lǐng)域中應(yīng)用的最為廣泛[5]。

    1.2基因芯片技術(shù)

    基因芯片又稱生物芯片,是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的,通過檢測雜交信號強(qiáng)度,從而得出分子信息的一種技術(shù)?;蛐酒姆诸惙绞胶头N類多種多樣,可分為原位合成、DNA微陣列[6]、無機(jī)片基等。在微生物群落和多樣性的研究中,多采用系統(tǒng)寡核苷酸芯片、群落基因組芯片及宏基因組芯片[7]。除此之外,基因芯片還大范圍地應(yīng)用于食品、藥物、機(jī)械、航天、農(nóng)作物優(yōu)選等領(lǐng)域。盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)得到了良好的發(fā)展,但仍有一些目前無法解決的難題,如它的成本高、靈敏度較低、重復(fù)性差、操作復(fù)雜等,使得它很難對大量信息進(jìn)行解讀。這些問題通過樣品的制備、探針固定、數(shù)據(jù)讀取及分析等幾個方面反映出來。

    1.3 PCR技術(shù)

    PCR技術(shù),又稱為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)中的一種。這種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)不僅靈敏度高,而且反應(yīng)快速。隨著PCR技術(shù)的不斷完善,形成了定量實(shí)時PCR(qPCR)、PCR基因測序、PCR-SSCP、PCRDGGE、PCR-RFLP等一系列衍生技術(shù),并在環(huán)境微生物領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。qPCR作為檢測和量化目標(biāo)微生物的工具,已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中,以便于更好地理解廢水中微生物群落的復(fù)雜性[8]。定量實(shí)時PCR可提供比其他分子技術(shù)更加具體、準(zhǔn)確的定量,但在實(shí)際中應(yīng)用時仍需要考慮一些必要的限制;PCR-SSCP分析技術(shù)可使構(gòu)象上有差異的分子進(jìn)行分離,而且這種技術(shù)的操作過程簡單、反應(yīng)快速、靈敏,毋需其他特殊的儀器;PCR-DGGE則是將序列不一樣的DNA分開;PCR-RFLP技術(shù),即通過特異性內(nèi)切酶消化切割成不同長度的DNA片段條帶。這種技術(shù)操作方法簡單、DNA的含量也得到了很大的提高。Shannon等 采用實(shí)時定量PCR(qPCR)檢測城市污水處理的五個階段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),這種qPCR方法可有效地檢測廢水中的病原體。

    1.4高通量測序技術(shù)

    高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和日趨成熟,為微生物領(lǐng)域研究的深入開展提供了契機(jī)[10]。1975年桑格和考爾森開創(chuàng)了鏈終止法,兩年后,桑格測定了第一個基因組序列,這便是第一代DNA測序技術(shù)。第一代測序技術(shù)的準(zhǔn)確性可達(dá)到99%以上,但它的測序成本高、通量低,這些缺點(diǎn)使它難以進(jìn)行大規(guī)模的應(yīng)用。因此,它并不是十分理想的測序技術(shù)。經(jīng)過技術(shù)的研發(fā)和改進(jìn),第二代測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生了。與第一代測序技術(shù)相比,第二代測序技術(shù)在保持高準(zhǔn)確性的前提下,降低了測序成本,并且提高了測序速度。近幾年,測序技術(shù)不斷地完善,逐步形成第三代測序技術(shù)。與前兩代測序技術(shù)相比,它的最大特點(diǎn)是無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。不進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是為了在保持第二代測序技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上,避免因PCR所導(dǎo)致的系統(tǒng)錯誤。因?yàn)楦咄繙y序的快速發(fā)展,使得對數(shù)百萬個PCR擴(kuò)增子進(jìn)行測序得以實(shí)現(xiàn)?;贒NA多樣性的高通量測序技術(shù)可對難以觀測的水環(huán)境微生物及其群落進(jìn)行觀測,在生物研究中發(fā)揮著重要作用[11]。

    2在環(huán)境工程微生物領(lǐng)域中的應(yīng)用

    2.1對微生物多樣性的分析

    現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以對微生物的結(jié)構(gòu)、種類、群落進(jìn)行分析。Moreno等[12]使用擴(kuò)增子長度異質(zhì)性PCR(LH-PCR)評估土壤中的微生物群落變化;王靖淇等[11]采用高通量測序技術(shù)對遼河真核浮游藻類的群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究,研究結(jié)果表明,應(yīng)用高通量測序技術(shù)觀察到的優(yōu)勢群落與應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察到的一樣,均為硅藻門和綠藻門,并且高通量測序技術(shù)在觀測過程中不會丟失種類信息,使測序結(jié)果更加準(zhǔn)確;為了對處于不同培養(yǎng)階段的微生物的種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定,姚倩等[13]采用熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行研究。在剛接種的活性污泥中,研究發(fā)現(xiàn),硝化菌所占的比例僅為總微生物量的二十分之一,其中氨氧化細(xì)菌約占硝化菌的二分之一;隨著硝化菌富集培養(yǎng)的進(jìn)行,氨氧化細(xì)菌的數(shù)量逐漸減少,目標(biāo)微生物硝化菌的份額逐步提高,成為優(yōu)勢種群。除此之外,還可以通過對微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變,使其更有利于研究、應(yīng)用。根據(jù)細(xì)菌rRNA的基因序列Zhang等[14]設(shè)計(jì)特異性引物,從而獲得可變和相鄰的基因序列,提高物種水平的細(xì)菌鑒定分辨率。

    2.2對污染物的降解

    利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),研究微生物分解有機(jī)污染物的過程,通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)手段,使其在最佳的試驗(yàn)條件下達(dá)到更高的去除率。Ge等[15]利用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的序批式反應(yīng)器,應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)評估污泥中微生物的比例,對提高廢水中生物除磷效率進(jìn)行研究,從而得到最佳的試驗(yàn)條件。以西安市第三污水處理廠為研究地點(diǎn),以氧化溝工藝為研究對象,采用熒光原位雜交技術(shù),彭黨聰?shù)龋?6]研究溫度對強(qiáng)化除磷性能的影響。

    2.3分析結(jié)果的技術(shù)手段

    作為分析手段,現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)廣泛的應(yīng)用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中。為了檢測阿留申貂病毒對農(nóng)場造成的污染,Prieto等[17]采用qPCR技術(shù)對幾個環(huán)境樣品進(jìn)行檢測;Aydin等[18]采用定量實(shí)時PCR技術(shù)用于確定不同抗生素組合對總細(xì)菌、活性細(xì)菌及古細(xì)菌等的影響;GAN等[19]為了對天然群落中的有毒和無毒微囊藻進(jìn)行分析,采用熒光原位雜交(FISH)和流式細(xì)胞儀(FCM)相結(jié)合的分析方法,并量化大量存在的有毒微囊藻的百分比。研究結(jié)果表明,F(xiàn)ISH和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)合是研究微囊藻毒素生產(chǎn)生態(tài)學(xué)和對有毒微囊藻提供早期預(yù)警的有用方法;姚倩等[20]對污水處理廠活性污泥系統(tǒng)中的硝化螺菌富集培養(yǎng)進(jìn)行研究,雜交結(jié)果表明,硝化螺菌占活性污泥總微生物量的四分之三左右,而硝化桿菌所占的比例很小,僅為0.1%;Zhou等[21]為了檢測一般和特定的厭氧氨氧化菌細(xì)菌群,提供了針對不同環(huán)境樣品的PCR引物以及針對不同目的選擇合適的引物對的實(shí)際應(yīng)用指導(dǎo)。

    3結(jié)語與展望

    (1)現(xiàn)代分子生物技術(shù)為環(huán)境工程微生物領(lǐng)域提供了分析技術(shù)支撐,使深入探究微生物的多樣性以及微生物與污染物之間的關(guān)系成為可能。

    (2)現(xiàn)代分子生物技術(shù)在檢測過程中可得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果,若將現(xiàn)代分子生物技術(shù)與其他的環(huán)境檢測技術(shù)相結(jié)合,可使得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確、更加可靠。

    (3)在小范圍內(nèi),通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以改變微生物的結(jié)構(gòu),使其變得更易于處理污染物。但如何大規(guī)模的利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)對微生物進(jìn)行操作、如何高效快速地降解有機(jī)污染物,這應(yīng)是未來的研究方向。

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