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    基于液相色譜-飛行時間質譜聯用和質量虧損過濾技術的黃葵黃酮類成分系統(tǒng)分析

    2020-02-29 10:42:28高芯萬瑤瑤李長印段徐彬丁選勝居文政
    分析化學 2020年2期
    關鍵詞:黃酮

    高芯 萬瑤瑤 李長印 段徐彬 丁選勝 居文政

    摘?要?采用液相色譜-飛行時間質譜聯用(High-performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry,LC-TOF-MS)分析黃葵總黃酮(Total flavones of Abelmoschus manihot L. Medic,TFA)提取物,采集其正負離子模式下的LC-TOF-MS分析數據。借助質量虧損過濾(Mass defect filter,MDF)技術提取原始數據中黃酮類相關特征離子,通過TOF-MS精確分子量歸屬各離子的元素組成及離子類型,根據元素組成和離子類型的相關性合并可能源自同一個化合物的準分子離子和碎片離子,依據不少于2個準分子離子的出現篩選確認目標化合物。借助標準品比對、 文獻查閱、 數據庫搜索等手段解析選定的目標化合物的母離子和子離子圖譜,對其結構進行鑒定或合理歸屬。最終從TFA中篩選并初步鑒定出49種黃酮類化合物。鑒定結果表明, TFA中黃酮類化合物的形成主要涉及糖基化、 甲基化、 甲?;?、 乙?;推咸烟侨┧峄绒D化反應。本研究豐富了對黃葵化學物質基礎的認識,可為全面評價黃葵制劑質量、 深入開展黃葵藥效學研究提供重要參考; 同時也表明LC-TOF-MS分析結合MDF技術是一種適用于中藥化學成分的系統(tǒng)篩選方法。

    關鍵詞?黃葵; 黃酮; 液相色譜-飛行時間質譜; 質量虧損過濾; 成分系統(tǒng)篩選; 結構鑒定

    1?引 言

    中藥黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵(Abelmoschus manihot L. Medic)的干燥花,在《嘉佑本草》和《中華本草》中均有記載,其味甘、 辛,性涼,入肺、 腎、 膀胱經,有清利活血、 消腫解毒之功效,用于治療淋病及癰疽腫毒。黃葵膠囊為黃蜀葵花的特色中藥制劑,臨床上廣泛用于慢性腎病、 糖尿病腎病等疾病的治療,療效確切且安全性良好[1~3]。研究表明,黃酮類成分為黃葵膠囊和黃蜀葵花的主要化學成分和藥效活性成分[4~9]。

    全面了解黃葵制劑中黃酮類成分的化學結構信息,是闡明黃葵藥效物質基礎、 評價黃葵相關制劑質量和安全性的前提和基礎。液相色譜-飛行時間質譜聯用(Liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry,LC-TOF-MS)技術結合了液相色譜高效的分離能力及質譜高分辨率、 高質量精度的檢測能力,非常適用于中藥復雜化學成分的系統(tǒng)定性分析[9,10]。但是,LC-TOF-MS分析會產生復雜多維的研究數據,解析這些數據對于研究者是很大的挑戰(zhàn)。近年來,質量虧損過濾(Mass defect filtering,MDF)技術作為處理TOF-MS等高分辨質譜數據的新方法[11],已被證明非常適用于中藥化學成分的定性分析,特別是對某一類型(如黃酮、 皂苷等)化學成分的全面篩選和提取[12~16]。另一方面,各種開源和商業(yè)的化合物數據庫則為中藥化學成分的結構鑒定提供了極大便利。如AB Sciex和Agilent等儀器公司近期先后推出了與儀器配套的中藥高分辨質譜數據庫; 而PubChem、 ChemSpider等開源數據也在不斷豐富和完善中。參考上述數據庫,結合化學標準品比對和裂解規(guī)律解析,可以對篩選所得的中藥材化學成分進行合理的結構解析和歸屬。基于此,本研究首先對黃葵總黃酮(Total flavones of Abelmoschus manihot,TFA)提取物進行LC-TOF-MS數據采集; 而后根據文獻報道[4~9],建立篩選黃葵黃酮類化合物的MDF方法,全面提取LC-TOF-MS分析數據中的黃酮類化合物相關離子; 然后結合母離子的共存在,系統(tǒng)篩選確認TFA中存在的黃酮類化合物; 最后,參考標準品比對及其特征離子解析、 AB Sciex中藥高分辨質譜數據庫、 PubChem等網絡數據庫,對篩選所得化合物進行結構鑒定或合理歸屬,以期全面表征黃葵中所含有的黃酮類化合物的種類和存在形式。

    2?實驗部分

    2.1?儀器與試劑

    LC(美國Agilent公司)-Triple TOFTM 5600液相色譜-質譜聯用儀(美國AB公司),配有PeakView version1.2數據處理軟件和質譜自動校準調諧系統(tǒng)(CDS); CPA225D電子天平(德國Sartorius公司); Thermo Sorvall Legend Micro 17R離心機(美國Thermo公司); WH2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠); Millipore Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(Milli-Q公司)。

    甲醇和乙腈(HPLC級,德國Merck公司); 甲酸、 甲酸銨(質譜級,瑞士Fluka-Sigma-Aldrich公司); TOF-MS正離子調諧液(美國AB Sciex公司),批號4460131; TOF-MS負離子調諧液(美國AB Sciex公司),批號4460134; 化學對照品共8個,分別為: 蘆?。≧utin,批號B20771,上海源葉生物科技有限公司)、 金絲桃苷(Hyperoside,批號B20631,上海源葉生物科技有限公司)、 棉皮苷(Gossypin,批號B29264,上海源葉生物科技有限公司)、 棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸(Gossypetin-8-O-β-D-glucuronide,批號ZES-1364S,法國EXTRASYNTHESE公司)、 棉皮素(Gossypetin,批號ZES-1176,法國EXTRASYNTHESE公司); 楊梅素(Myricetin,批號B21458,上海源葉生物科技有限公司)、 異槲皮素(Isoquercitrin,南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)、 槲皮素(Quercetin,批號13072505,購自成都曼思特生物科技有限公司)。

    TFA提取物工藝簡述如下: 黃蜀葵花藥材先以60%乙醇回流提取,醇提液減壓濃縮,得到不含醇的水提液; 而后將水提液用乙酸乙酯萃取,收集乙酸乙酯萃取液,在旋蒸儀上減壓濃縮,并將所得物干燥粉碎,得粉末狀TFA提取物,其含量以總黃酮計>60%。

    2.2?實驗方法

    2.2.1?樣品處理?準確稱取TFA提取物20 mg, 溶于10 mL 70% 甲醇中, 制成母液, 取1 mL母液稀釋10倍, 渦旋混勻, 在4℃以12000 g離心5 min, 取5 μL上清液進樣分析。

    準確稱取8個對照品適量, 以甲醇溶解并稀釋至適當濃度, 等量混合, 制備混合標準溶液, 混合標準溶液中各化合物的終濃度均約為100 ng/mL。取5 μL上清液進樣分析。

    2.2.2?色譜-質譜條件?AgilentPoroshell 120 SB-C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 2.7 m); Agilent Poroshell 120 SB-C18預柱(5 mm ×3.0 mm, 2.7 m); 流動相A為水+5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸+0.1%甲醇, 流動相B為乙腈-水(9∶1,V/V)+5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸。梯度洗脫程序: 0~0.5 min, 5% B; 0.5~12 min, 5%~100% B; 12~16 min, 100% B; 16~16.1 min,100%~5% B; 16.1~22 min, 5% B。流速為300 L/min, 柱溫為35℃, 進樣體積5 L, 進樣室溫度為8℃。

    電噴霧離子源以正負離子模式采集數據, TOF-MS掃描模式參數設置如下: 分子量掃描范圍m/z 100~1000, 累積時間0.250015 s; 離子化溫度(TEM): 550℃; 霧化氣(GS1): 60 psi (1 psi=6.895 kPa); 輔助加熱氣(GS2): 60 psi; 氣簾氣(CUR): 35 psi; 去簇電壓(DP): 80 V; 碰撞能量(CE): 10 eV; 正負離子模式下噴霧電壓(ISVF)分別為5500 V和4500 V。采用信息關聯采集(Information dependent acquisition, IDA)、 智能化的動態(tài)背景扣除(Dynamic background subtraction, DBS)和高靈敏度的模式采集數據。主要的IDA轉換標準如下: 信號強度大于500 cps, 4 Da以內排除同位素, 分子量誤差50 mDa, 每個循環(huán)最多監(jiān)測8個候選離子。子離子掃描模式的參數設置如下: 分子量掃描范圍m/z 50~m/z1000, 累積時間0.100006 s; CE: (35±15) eV; 其它主要參數同TOF-MS掃描模式。采用AB公司的調諧液傳遞系統(tǒng)(CDS)對分子量準確度進行自動校準。通過AB公司的軟件Analyst TF 1.6.2 software控制儀器操作和數據采集。

    2.2.3?黃葵黃酮類化合物的MDF篩選和鑒定?首先,根據文獻[4~9]報道構建黃葵中黃酮類化合物的分子式數據庫,通過PeakView軟件(AB Sciex公司,Version 1.2)的Mass Calculator功能計算得到該類化合物的7種常見準分子離子(正離子模式下的[M+H]+、 [M+Na]+和[M+NH4]+,負離子模式下的分子量和質量虧損范圍,詳見表1。

    在此基礎上,引入適當的允許誤差,設定合適的分子量和質量虧損范圍,對LC-TOF-MS原始數據進行黃酮類相關特征離子的MDF過濾。通過PeakView的IDA Explorer功能從MDF過濾后的數據中提取可產生子離子的特征離子。結合前期研究[15,16],初設離子信號強度下限分別設為12000 cps(正離子模式)和7000 cps(負離子模式)。

    利用PeakView的Formula Finder功能對篩選所得目標離子的元素組成進行預測。其中,碳氫氧原子數目和不飽和度的范圍設定如表1所示,分子量最大允許誤差10

    5,正離子模式下氮、 鈉和鉀原子0~1個; 負離子模式下氮、 氯原子0~1個。

    采用XIC Manager功能提取篩選所得的目標離子,以檢驗其峰形完整性,確認其準確保留時間; 根據保留時間和TOF-MS提供的精確分子質量的匹配度,合并源自一個化合物的多個特征準分子離子(如正離子模式下的[M+H]+、 [M+Na]+、 [M+K]+、 [M+NH4]+,及負離子模式下的[M-H]

    、 [M+HCl-H]

    、 [M+HCOOH-H]

    、 [M+HNO3-H]

    等),通過至少兩個準分子離子的存在確認每個化合物的存在。同時通過XIC提取,確認鎖定的化合物并補充其同分異構體。

    借助標準品比對、 文獻報道和PubChem等數據庫檢索,解析IDA Explorer提供的子離子信息,對篩選得到的目標化合物進行初步鑒定。

    3?結果與討論

    3.1?化合物篩選方法的確定

    質量虧損和分子量篩選范圍的設定依據為已有文獻報道的黃葵黃酮類化合物。匯總文獻[4~9]中相關信息可知,已知的黃葵相關黃酮類化合物共涉及到32個不同的分子式。借助Peakview軟件的Mass calculator功能計算獲得32個分子式的各種準分子加合離子包括正離子模式下[M+H]+、 [M+NH4]+和[M+Na]+及負離子模式下[M-H]

    、 [M+HCOOH-H]

    、 [M+HNO3-H]

    和[M+HCl-H]

    的精確分子質量,構建相應的黃葵黃酮類化合物加合離子數據庫。其中,加合離子的選擇主要依據前期研究和文獻報道[4~9,15,16]而定。此數據庫中包括了各化合物正負離子模式下質量虧損、 分子量、 分子組成及不飽和度的最大值和最小值,在此基礎上,引入適當的允許誤差,即可得到本研究中所設定的MDF和Formula finder的相關參數(表1)。MDF過濾前后TFA提取物總離子流色譜圖(TIC)的對比如圖1所示,經MDF過濾后的TIC基線更加平穩(wěn),而黃酮類化合物對應的色譜峰也得到了增強。理論上,凡是質量虧損落在設定范圍內的信號離子均應作為黃酮類相關離子被篩選出來,進行進一步研究,而本研究設定了只篩選能產生子離子且信號強度在12000 cps(正離子模式)或7000 cps(負離子模式)以上的黃酮相關離子,以集中發(fā)現提取物中相對含量較高的黃酮類化合物。在鎖定目標化合物后,通過提取目標化合物的提取離子流色譜圖(XIC),確認目標化合物的存在; 同時,根據XIC圖譜確認補充了一些豐度較大,但低于初篩閾值(即12000 cps或7000 cps)的同分異構體。

    3.2?篩選結果

    從TFA中共篩選出49種黃酮類化合物(見電子版文后支持信息表S1),各個黃酮類成分均存在2個以上的準分子離子, 進一步證明了篩選結果的可靠性; 各種準分子離子類型出現的頻率從高到低依次為: [M-H]

    (49次)>[M+H]+(41次)>[M+HNO3-H]

    (37次)>[M+Na]+(27次)>[M+HCl-H]

    (21次)>[M+HCOOH-H]

    (13次); 其中,化合物C5、 C11、 C26、 C47、 C48和C49為根據鎖定化合物的[M-H]的XIC圖譜補充的豐度較高但小于7000 cps的黃酮類化合物。由于所有化合物都可產生[M-H],本研究給出了所有化合物此離子的峰強度信息,以初步提供各個化合物的相對含量信息。

    3.3?篩選化合物的鑒定

    黃酮類化合物的鑒定主要依據標準物質比對、 標準物質子離子色譜圖的特征診斷離子比對、AB sciex中藥高分辨質譜數據庫搜索、 化合物元素組成與已報道的黃酮類化合物間的聯系,以及PubChem等網絡數據庫的搜索匹配。為了提高鑒定的準確度,并為類似結構化合物的鑒定提供參考,在同樣的LC-MS分析條件下分析了8種黃葵中常見的黃酮類標準品。通過保留時間和TOF-MS及TOF-MS/MS圖譜比對,發(fā)現它們在TFA提取物中均可作為豐度比較高的色譜峰而被檢測得到,分別為Rutin(C14)、 Hyperoside(C17)、 Gossypin(C18)、 Gossypetin-8-O-β-D-glucuronide(C25)、 Gossypetin(C30)、 Myricetin(C33)、 Isoquercitrin(C35)和Quercetin(C43)。圖2所示為3種苷元化合物C43、 C33和C30在混合標準溶液和藥材提取液中的二級TOF-MS質譜圖。上述8種化合物,特別是3種苷元化合物的母離子和子離子特征分布可為解析其它41種黃酮類化合物的結構提供重要參考。用于鑒定各化合物的子離子詳細信息和鑒定結果見電子版文后支持信息表S2; 各化合物可能的化學結構詳見電子版文后支持信息圖S1。本研究僅以棉皮素(Gossypetin)類化合物鑒定或歸屬過程為例,簡述具體鑒定思路和過程如下:

    如圖2C~2F所示,經標準品比對可知,棉皮素(C30)和楊梅素(C33)雖為一組同分異構體,均可產生特征性母離子m/z 317和一系列共同的子離子,如m/z 299、 271、 245、 227、 195、 179、 167、 151、 139、 137、 111和109等,但兩者產生的子離子的豐度明顯不同。相比之下,棉皮素可產生高豐度的m/z 299、 245、 227、 195、 167、 139和111,而楊梅素則可產生高豐度的m/z 179、 151、 137和109; 這些子離子特征性分布有助于以兩者為母核的化合物的結構區(qū)分和鑒定。以C25為例,其豐富的加合離子和m/z 317子離子的出現均提示,此化合物是以m/z 317為苷元離子

    的葡萄糖醛酸苷; 而高豐度的系列上述棉皮素子離子的出現,表明C25為棉皮素的葡萄糖醛酸苷。通過標準品比對,C25被準確鑒定為Gossypetin-8-O-β-D-glucuronide,進一步驗證了上述特征子離子分布在結構鑒定中的重要作用。

    類似地,C1、 C3、 C18可被合理歸屬為棉皮素的葡萄糖苷,參考PubChem數據庫,初步將其結構分別定為Gossypetin 3-glucoside、 Gossypetin 3'-glucoside和Gossypin,其中,C18可通過標準品比對進一步確認; 而其同分異構體C7則由于可產生明顯的m/z 179、 m/z 151等特征離子而被合理歸屬為Myricetin 3-glucoside。 C38也可產生棉皮素上述特征子離子分布,且精確分子量提示C38與C25相比多一個CH2,參考芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸甲酯苷[17]等結構類似的化合物,初步確定棉皮苷的甲基化位點發(fā)生在葡萄糖醛酸基的8位,據此,將C38歸屬為Gossypetin 8-O-methylglucuronide。同樣地,C34、 C40和C45為一組同分異構體,由精確分子量得到的元素組成提示它們比C38多一個甲基(CH2),且具有棉皮素的特征子離子分布,據此,將其歸屬為雙甲基化的C25。進一步對比其子離子可以發(fā)現,C34在母離子m/z 521和棉皮素苷元子離子間未見明顯碎片離子,提示兩個甲基應位于糖基上,而非苷元上; C45可產生明顯的m/z 331子離子,與母離子m/z 521相差m/z 190,提示甲基化葡萄糖醛酸殘基(m/z 176+14)的存在; C40可產生m/z 503和461的子離子,兩者相差一個乙?;╩/z 42,CH3CH2O),提示乙酰基的存在。根據以上分析,參考已知黃葵中黃酮類化合物的糖基化位點,C34、 C40和C45分別被初步確定為Gossypetin 8-dimethylglucuronide、 Gossypetin 3-acetylglucoside和4'-methylgossypetin 8-methylglucuronide。

    C20可產生與C38類似的特征子離子,如m/z 507、 m/z 317等,提示其結構中具有C38母核。C20與C38母離子相差兩個CH2O,且C20可產生明顯的[M-H2O-H]

    離子m/z 549,據此,初步推斷其結構為C38在糖基上加乙二醇,即C20為C25的丙三醇酯,其具體精確結構有待進一步深入研究。

    C8、 C16均可依次丟失m/z 162(葡萄糖),兩次生成m/z 479(單糖苷離子)和m/z 317(苷元離子),并伴有m/z 299和m/z 271等棉皮素特征子離子出現,提示其均為棉皮素的二糖苷。鑒于C16糖苷碎片離子少見,且可產生較多的小分子苷元相關碎片離子; 而C8則具有m/z 595、 m/z 478等糖苷相關子離子,且苷元碎片離子較少; 結合PubChem數據庫搜索,將C8和C16分別初步歸屬為Gossypetin-3,8-O-diglucoside和Gossypetin 3-sophoroside。類似地,C11、 C19、 C21分別初步鑒定為Gossypetin 8-glucuronide 3-glucoside、 Gossypetin-8-O-glucosyl-(1->2)-glucuronide和Gossypetin 8-methylglucuronide 3-glucoside。

    綜上,共有17種黃酮類化合物被歸屬或鑒定為棉皮素類化合物。類似地,共鑒定或歸屬25種槲皮素(Quercetin)類化合物,5種其它類黃酮化合物以及甘草苷和異甘草苷,鑒定過程詳見電子版文后支持信息S3.3.1~S3.3.3。

    3.4?篩選鑒定結果分析

    根據上述篩選鑒定結果,以槲皮素和棉皮素兩個苷元為轉化起點,對TFA中黃酮類成分可能涉及到的轉化反應進行歸納總結(電子版文后支持信息圖S1)。結果表明,糖基化、 甲基化、 甲?;?乙?;?內酯化、 葡萄糖醛酸化、 甘油酯化共7種轉化反應參與了黃葵黃酮類化合物的生成,其中,以糖基化最為常見。需要指出的是,上述轉化反應是以苷元為起點作為假設的,因此,其逆反應也可能是常見的轉化反應; 同時,由于槲皮素和棉皮素僅相差一個羥基,因此,這兩者之間,以及以該兩者為母核的多種化合物間均有可能發(fā)生相互轉化。

    對比各化合物[M-H]的峰強度可知,Gossypetin 8-O-methylglucuronide(C38)峰高最強,但此化合物在以往的黃葵制劑質量評價中很少提及; 類似的化合物還有C27、 C28、 C2、 C31和C7等。在后續(xù)的黃葵制劑質量評價及活性研究中,關注或增加對于這些化合物的相關研究十分必要。

    4?結 論

    通過LC-TOF-MS技術并結合MDF方法,對TFA中黃酮類成分進行系統(tǒng)篩查和初步鑒定,共篩選鑒定出49種黃酮類化合物,并歸納出了糖基化、 葡萄糖醛酸化、 甲基化等黃酮類化合物的次生代謝轉化途徑,極大地豐富了對黃葵黃酮類化學成分的認識,對于全面評價黃葵相關制劑質量,闡明其藥效物質基礎具有重要的參考意義。同時,本研究也充分表明, LC-TOF-MS技術結合MDF方法可用于中藥等復雜體系的化學成分的系統(tǒng)定性分析。

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    Systematic Screening and Assignment of Flavones in Total Flavones

    of Abelmoschus Manihot Based on High-performance Liquid

    Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry

    Analysis and Mass Defect Filter

    GAO Xin1, WAN Yao-Yao1, LI Chang-Yin*1, DUAN Xu-Bin1, DING Xuan-Sheng*2, JU Wen-Zheng1

    1(Department of Clinical Pharmacology, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China)

    2(School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

    Abstract?High-performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry (HPLC-TOF-MS) was employed to analyze the extract of total flavones of Abelmoschus manihot L. Medic (TFA) in both positive and negative ion mode. The raw LC-MS data were filtered by a well-established mass defect filter (MDF) approach to screen the flavone-related ions, and then, each screened ion was assigned by TOF-MS accurate mass measurement to certain elemental composition and ion type. Next, the co-eluted ions from one single compound were attempted to be combined, and the presence of each compound was confirmed by at least two quasi-molecular ions. Aided by authentic standards comparison and searching literature and databases, the targeted compounds were tentatively identified or assigned according to their parent and fragment ions. Finally, 49 flavones were screened and tentatively identified or assigned from the TFA extract. The results showed that, glycosylation, methylation, formylation, acetylation and glucuronidation were considered to be the major conversion involved in the formation of the TFA flavones. The current study not only provided the sufficient chemical substance for further studies of TFA, such as quality control and pharmacological activity, but also demonstrated the potential of the combination of LC-TOF-MS and MDF for systematically screening the constituents of herbal medicines.

    Keywords?Abelmoschus manihot L. Medic; Flavones; High performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry; Mass defect filter; Systematic compound screening; Compound identification

    (Received 25 September 2019; accepted 20 December 2019)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81503300).

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