納米鐵氰化鈷電化學傳感器檢測細胞釋放的超氧陰離子

崔敏 溫曉芳 任聚杰 張聰 李娜 韓元元 余旭東 籍雪平

摘?要?采用共沉淀方法制備的鐵氰化鈷（Co3[Fe（CN）6]2）和Hummers法制備的還原氧化石墨烯（RGO）共沉積修飾玻碳電極（GCE），制備了無酶型超氧陰離子（O·-2）電化學傳感器（Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE）。采用掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線衍射（XRD）、電化學交流阻抗法（EIS）、循環(huán)伏安法（CV）等研究了復合材料Co3[Fe（CN）6]2-RGO的特征及其對水中O·-2的電化學檢測的可行性，分析了Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE 檢測O·-2的作用機理。傳感器對O·-2濃度的檢測范圍為0.5～30 μmol/L，靈敏度為 91.8 μA L/（μmol cm2）， 檢出限為0.071 μmol/L（S/N = 3），而且具有良好的選擇性，H2O2、O2及其它體內(nèi)電化學活性物質均不干擾O·-2的測定，成功地應用于MCF-7細胞中釋放的O·-2的電化學檢測。此傳感器在病理和生物學領域定量測定O·-2方面具有潛在的應用價值。

關鍵詞?電化學傳感器; 超氧陰離子; 鐵氰化鈷; 還原氧化石墨烯; MCF-7細胞

1?引 言

超氧陰離子自由基（O·-2）是活性氧的重要組成部分，與很多生理和病理過程密切相關。在正常的生理條件下，O·-2在體內(nèi)保持相對平衡的狀態(tài)，當細胞受到外界刺激或者發(fā)生病變，會產(chǎn)生過量O·-2，造成DNA損傷，從而影響基因的表達，導致衰老、惡性腫瘤和一些神經(jīng)性疾病，如帕金森病等[1，2]。因此，建立實時、準確、簡便、快速的O·-2檢測技術，對于研究機體的生理和致病機理具有重要的意義。

常見的檢測O·-2的方法有電子自旋共振法[3，4]、分光光度法[5，6]、化學發(fā)光法[7，8]、色譜法[9，10]、熒光法[11，12]和電化學法[13～19]等。由于O·-2的活性高、半衰期短，雖然常規(guī)方法也能檢測O·-2，但相對而言，電化學儀器比較便宜，操作簡單，易于實現(xiàn)實時、在體監(jiān)測，因此在定量分析活體細胞中O·-2方面具有優(yōu)勢[13]。

已報道的O·-2電化學傳感器按敏感單元是否使用酶可分為有酶型[14～16]和無酶型[17～20]。有酶型傳感器的選擇性通常較好，但缺點是天然酶易受外界條件影響而性能不穩(wěn)甚至失活，導致所構建的傳感器穩(wěn)定性和重現(xiàn)性差、壽命較短。無酶型傳感器多采用新型無機納米材料或人工合成的有機材料，這些修飾材料不僅具有良好的催化性、生物相容性、強的電子轉移能力等優(yōu)點，而且制作成本低、穩(wěn)定性好，能克服天然酶易失活、易受外界條件影響等缺點，增強傳感器的穩(wěn)定性，延長傳感器的使用壽命，所以無酶型O·-2電化學傳感器備受關注[21～23]。Liu等[21]采用氮摻雜中空介孔碳球修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極檢測超氧陰離子，Kim等[18]利用Pt共價鍵合的多壁碳納米管（MCNTs）復合材料電化學檢測O·-2，雖然這些電極都能高效定量分析O·-2，但沒有探討對O·-2檢測的作用機理。Liu等[17，22]利用Ag納米顆粒與功能化的MCNTs的復合物檢測O·-2，通過檢測O·-2歧化反應生成的O2，間接定量分析O·-2的濃度，這可能會受到生物體內(nèi)其它來源O2的影響。研究者采用磷酸錳（Mn3（PO4）2）自組裝的納米表面檢測O·-2[23，24]，由于加入O·-2，引起Mn3（PO4）2自身的氧化還原峰電流的變化，通過這種變化檢測O·-2，避免了體內(nèi)其它來源的H2O2和O2產(chǎn)生的干擾。也有研究者采用相同的機理建立了檢測O·-2的方法[25，26]。

過渡金屬鐵氰化物 （MHCFs） 是一類以過渡金屬為中心的無機配位化合物，由過渡金屬中心離子和氰根基團配體構成，是一種最古老、最簡單的金屬有機框架化合物[27]，而且過渡金屬（M）有多種價態(tài)，以MHCFs作為敏感材料，可以實現(xiàn)對O·-2的高選擇性檢測，且不受H2O2和O2干擾。石墨烯是一種由單層sp2雜化碳原子組成的蜂窩狀結構的二維碳納米材料[28，29]，由于構成還原氧化石墨烯（RGO）結構的碳原子都處于sp2雜化態(tài)，額外的p軌道可以形成大的共軛π鍵，并且π電子可以自由移動。因此，RGO具有優(yōu)異的導電性、大的比表面積和良好的生物相容性，被廣泛應用于電子器件、電化學傳感器等領域[28～31]。

本研究以CoHCFs為敏感材料，與導電性良好的RGO形成復合材料，構建了無酶型O·-2電化學傳感器，并探究了O·-2的檢測機理。此傳感器不受H2O2和O2干擾，具有良好的選擇性、靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。研究表明，CoHCFs對O·-2具有高催化活性，是非常有潛力的無酶型O·-2電化學傳感器敏感材料。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

CHI760E電化學工作站（上海辰華儀器公司）; BT125D電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）; PHS-2F pH計（雷磁-上海儀電科學儀器股份有限公司）; HITACHI S-4800掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）; UV-5200PC紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

超氧化鉀（KO2）、二甲基亞砜（DMSO）、18-冠醚-6（阿拉丁試劑公司）; 乙酸鈷、聚乙烯基吡咯烷酮（天津大茂化學試劑公司）; KCl、Na2HPO4、NaH2PO4、K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]（天津永大化學試劑公司）; 葡萄糖（Glu）、尿酸（UA）、多巴胺（DA）、抗壞血酸（AA）、H2O2（天津博迪化工股份有限公司）。 所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

2.2?Co3[Fe（CN）6]2的制備[32]

A溶液： 0.075 mmol Co（CH3COO）2·4H2O溶于10 mL水中; B溶液： 0.04 mmol K3[Fe（CN）6]和0.3 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在劇烈攪拌下溶于10 mL水中，得到透明溶液。在磁力攪拌下， 將A溶液用注射器緩緩滴加到B溶液中，磁力攪拌10 min后，靜置24 h，離心分離， 得到紅色沉淀Co3[Fe（CN）6]2·10H2O，水洗數(shù)次，在干燥箱中40℃烘干。

2.3?RGO的制備

利用Hummers法制備氧化石墨烯（GO）[30]。取2.0 g氧化石墨烯，溶于20 mL水中，超聲分散均勻。取0.3 g NaBH4溶于10 mL乙醇中，緩慢滴加上述液體，攪拌24 h，水洗數(shù)次，得到RGO，凍干。

2.4?修飾電極的制備

將玻碳電極分別用粒徑1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉打磨，每次打磨后依次用水、乙醇、水超聲清洗，氮氣吹干，備用。將1 mg/mL Co3[Fe（CN）6]2溶液和1 mg/mL RGO懸浮液按體積比2∶1配成混合液。取8 μL混合液滴涂在處理好的玻碳電極上，在空氣中干燥，得到修飾電極Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE。

2.5?超氧陰離子（O·-2）的產(chǎn)生[?14]

將0.0147 g KO2溶解在2 mL 18-冠醚-6的DMSO溶液（含有0.4 nm分子篩），超聲處理5 min。由于DMSO溶液中O·-2在271 nm 處的摩爾吸光系數(shù)為2006 L/（mol cm），本研究采用紫外-可見分光光度計估算DMSO溶液中O·-2的濃度[33]。

2.6?電化學測試

電化學檢測采用三電極體系： 鉑絲為對電極，銀-氯化銀電極（Ag/AgCl）為參比電極，玻碳電極（直徑3 mm）或修飾后的玻碳電極為工作電極。電化學阻抗（EIS）測試是在含5 mmol/L [Fe（CN6）]3/4的0.1 mol/L KCl溶液中進行，振幅為5 mV，頻率為0.1～105 Hz。循環(huán)伏安（CV）測試在0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS， pH 7.4）中進行，電壓范圍0～0.9 V。

3?結果與討論

3.1?材料表征

采用XRD對制備的過渡金屬鐵氰化物進行了表征，由圖1C可見，制備的材料的XRD圖的峰位置與Co3[Fe（CN）6]2·10H2O標準卡片上的峰位置高度吻合，說明其為帶有10個結晶水的Co3[Fe（CN）6]2。采用掃描電子顯微鏡（SEM）對制備好的Co3[Fe（CN）6]2和Co3[Fe（CN）6]2-RGO的形貌進行了表征，如圖1A和圖1B所示，Co3[Fe（CN）6]2呈現(xiàn)出均勻分布，且粒徑大小約100 nm的正立方體結構，薄紗狀的RGO包裹在Co3[Fe（CN）6]2表面，表明兩種材料成功復合在一起。

圖1D為修飾電極在0.05 mol/L PBS中的CV圖，在0～0.9 V的電化學窗口下，裸GCE（曲線a）和RGO/GCE（曲線b）都未出現(xiàn)氧化還原峰，修飾Co3[Fe（CN）6]2后的CV曲線（曲線c）出現(xiàn)了一對氧化還原峰，這是由于Co3[Fe（CN）6]2在電極上發(fā)生了氧化還原反應; 修飾了Co3[Fe（CN）6]2-RGO復合材料的CV曲線（曲線d）上的氧化還原峰電流值更大?？赡苡袃蓚€原因： 一方面，由于RGO的導電性好，加入RGO后，導電性增強，導致峰電流變大; 另一方面，由于RGO的比表面積大，使較多的Co3[Fe（CN）6]2修飾到電極上，增強了電流響應信號。

電化學阻抗譜（EIS）是探測修飾電極表面特征的簡便有效的方法之一，可用于描述電極的界面特性[34]。圖1E是以[Fe（CN）6]3/4作為電化學探針的不同修飾電極的Nyquist圖。通過ZSimpWin軟件擬合Nyquist圖，等效電路如圖1E左上方插圖所示，Rs為未補償?shù)碾娮?，Rct為電子轉移電阻，Zw為Warburg阻抗，Cd為雙電層電容[35，36]。 高頻區(qū)的半圓直徑大小對應Rct，裸玻碳電極（曲線a）的Rct≈200 Ω，電極上修飾了Co3[Fe（CN）6]2后（曲線c），Rct增大，約為1700 Ω，說明Co3[Fe（CN）6]2并不利于電子的傳遞。但是，裸玻碳電極上修飾RGO后，Nyquist圖（曲線b）幾乎是一條直線，Rct明顯降低，說明RGO具有很好的導電性，可以提高電子轉移速率。當RGO和Co3[Fe（CN）6]2一起修飾到電極上（Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE，曲線d）， Rct≈120 Ω，與只修飾Co3[Fe（CN）6]2相比，Rct大幅降低，說明RGO與Co3[Fe（CN）6]2的復合，增加了材料的導電性，使制備的電極Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE具有良好的導電性能，更有利于電子轉移，有利于提高傳感器的靈敏性。

3.2?可行性分析

采用循環(huán)伏安法（CV）考察了Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE電極檢測O·-2的可行性。圖2為在0.05 mol/L PBS （pH 7.4）中加入不同濃度O·-2時的CV曲線。當PBS中加入O·-2時，CV曲線（曲線a）出現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰，這是修飾在電極上的Co3[Fe（CN）6]2本身的氧化還原峰（反應方程式（1）、（2）所示）。在PBS中未加入O·-2后，氧化峰和還原峰電流都增大，且隨著O·-2含量的增加而增大，尤其在0.6 V附近氧化峰電流值增大比較明顯。這是由于加入的O·-2與CoⅢ[FeⅢ（CN）6]反應，使CoⅢ還原成CoⅡ，如反應方程式（3）所示，再加上CoⅢ被電還原的CoⅡ（反應方程式（1）），使電極CoⅡ的量增加，施加正電位時（正掃），就會有較多的CoⅡ被電氧化為CoⅢ（反應方程式（3）），從而使氧化峰電流增大。所以，可以利用CV曲線上氧化峰電流的變化定量分析O·-2。由于本研究通過檢測Co3[Fe（CN）6]2本身的氧化峰定量分析O·-2，所以不受H2O2和O2的干擾，后面的抗干擾實驗也證明了這一點。以上實驗說明，所制備的電極Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE可用于檢測O·-2。

CoⅢ[FeⅢ（CN）6]?+K++ e

K CoⅡ[FeⅢ（CN）6]（1）

K CoⅡ[FeⅢ（CN）6]CoⅢ[FeⅢ（CN）6]?+K++ e

（2）

CoⅢ[FeⅢ（CN）6]?+ O·-2+K+ K CoⅡ[FeⅢ（CN）6]?+O2（3）

由于本研究是利用Co3[Fe（CN）6]2本身的氧化還原峰的變化檢測O·-2，所以單位電極面積上修飾的Co3[Fe（CN）6]2越多，理論上效果越好。但考慮到Co3[Fe（CN）6]2導電性較差，單位電極面積上修飾的Co3[Fe（CN）6]2過多，會阻礙電子傳遞速率。綜合兩方面的因素，考察了RGO與Co3[Fe（CN）6]2的比例及滴涂量對O·-2電流響應的影響，如圖3A和3B所示。當RGO與Co3[Fe（CN）6]2的比例為1∶2、滴涂量為8 μL時，Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE電極對20 μmol/L O·-2的響應電流最大，所以本研究采用此條件制備修飾電極Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE。

3.3?掃描速率對O·-2電化學行為的影響

為進一步探究O·-2在Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE電極表面的反應特性，考察了掃速對Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE電極電流響應的影響。不同掃速下， Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE電極在含20 μmol/L O·-2的0.05 mol/L PBS中的CV圖見圖4， 氧化還原峰電流隨著掃速的增大而增大（圖4A），且與掃速的平方根呈線性關系（圖4B），線性方程分別為：Ipa（μA）=8.13×105ν1/2（（mV/s）1/2）-248，R2=0.999; Ipc（μA）=7.49×10ν1/2（（mV/s）1/2）-220，R2=0.999，表明O·-2在Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE修飾電極上的反應是擴散控制過程。

3.4?超氧陰離子的定量檢測

用CV方法對O·-2進行定量檢測，在0.05 mol/L PBS（pH 7.4）中依次加入不同濃度O·-2，進行循環(huán)伏安掃描。CV曲線的氧化峰電流和還原峰電流都隨O·-2濃度的增加而增大（圖5A），氧化峰電流響應增大的更明顯，所以本研究利用修飾電極的氧化峰電流與O·-2濃度的關系定量檢測O·-2。如圖5B所示， O·-2濃度在0.5～30 μmol/L范圍內(nèi)二者呈線性關系，線性方程為I（μA）=6.49c（μmol/L）+218（R2=0.993），靈敏度為91.8 μA L/（μmol cm2），檢出限為0.071 μmol/L（S/N=3）。與其它已報道的不同修飾電極對O·-2檢測性能相比，本研究制備的傳感器對O·-2的檢測性能良好（表1），這是因為Co3[Fe（CN）6]2能與O·-2快速反應，且RGO大的比表面積增加了修飾電極上的Co3[Fe（CN）6]2的固定量及化學活性位點，以及ROG良好的導電性加大了Co3[Fe（CN）6]2的電子轉移，使傳感器具有較高的靈敏度和較低的檢出限。

本工作 This work考察了修飾電極的選擇性（圖6A）。選擇了在生物體系中可能會對O·-2的檢測有干擾的物質，包括尿酸（UA）、葡萄糖（Glu）、抗壞血酸（AA）、多巴胺（DA）、H2O2，50倍O·-2濃度的這些干擾物與O·-2共存時產(chǎn)生的電流響應，為沒有干擾物時的響應的91.6%～94.9%，說明這些物質都不對O·-2的檢測造成干擾，修飾電極具有良好的選擇性，有望應用于實體細胞內(nèi)O·-2的檢測。

在相同條件下， 制備5根Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE，分別在0.05 mol/L PBS中檢測其對20 μmol/L O·-2的電流響應值，相對偏差為4.4%。用同一根電極Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE檢測20 μmol/L O·-2的電流響應，5次檢測的相對偏差為4.7%。以上結果表明，所制備的電極Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE具有優(yōu)良的重現(xiàn)性。將修飾電極在4℃環(huán)境中保存30 d，在此期間定期對25 μmol/L O·-2進行檢測，結果如圖6B所示，保存30 d后，修飾電極的電流響應值是初始響應的94.8%，說明所制備的修飾電極具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

3.5?活體細胞中超氧陰離子的檢測

通過檢測MCF-7細胞釋放的O·-2考察修飾電極的實時檢測性能。采用本傳感器檢測MCF-7細胞釋放的O·-2。在含有1.0×106個細胞的5 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）中，注射0.24 mg/mL酵母聚糖A，以刺激MCF-7細胞產(chǎn)生O·-2，由O·-2的電流響應值可以求得刺激MCF-7細胞產(chǎn)生的O·-2為4.90 μmol/L。當PBS中只有酵母多糖A或只有MCF-7細胞時，都沒有電流響應，說明電極檢測到的是細胞MCF-7被刺激后產(chǎn)生的O·-2，此電極能對O·-2進行實體檢測。5 mL 0.01 mol/L PBS中1.0×106 cells/mL細胞MCF-7受刺激所產(chǎn)生的O·-2的加標回收率見表2，回收率為98.5%～106.0%，相對標準偏差為3.75%～4.31%，表明所制備的傳感器能夠用于實體細胞中被刺激后產(chǎn)生的O·-2的測定。

4?結 論

基于Co3[Fe（CN）6]2和RGO構建了一種新型無酶超氧陰離子電化學傳感器，并成功定量測定了活體細胞受激下產(chǎn)生的O·-2濃度。Co3[Fe（CN）6]2作為傳感器的敏感元件，利用其本身的氧化還原反應峰電流隨加入O·-2濃度的改變而改變的特性定量分析O·-2濃度，且不受O2和H2O2的干擾。RGO作為電極支撐材料，由于其良好的導電性，增強了傳感器的電子傳導，同時由于其大的比表面積使更多的Co3[Fe（CN）6]2固定在電極表面，提高了Co3[Fe（CN）6]2的穩(wěn)定性及傳感器的電催化性能。由于復合材料Co3[Fe（CN）6]2-RGO的這種協(xié)同效應，使制備的電化學傳感器具有優(yōu)良性能，靈敏度為91.8 μA L/（μmol cm2）， 檢出限為0.071 μmol/L（S/N=3），具有良好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性等，并實現(xiàn)了對刺激后MCF-7細胞所產(chǎn)生的O·-2濃度的檢測。所制備的超氧陰離子電化學傳感器在監(jiān)測O·-2濃度方面具有良好的應用前景。

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36?Hou C， Tai Z， Zhao L， Zhai Y， Hou Y， Fan Y， Dang F， Wang J， Liu H. J. Mater. Chem. A，2018，6（20）： 9723-9736

37?Wang Q， Zhou Q， Zhang Q， Shi R， Ma S， Zhao W， Zhou M. Talanta，2018，179： 145-152

38?Liu T， Niu X， Shi L， Zhu X， Zhao H， Lana M. Electrochim. Acta，2015，176： 1280-1287

Electrochemical Detection of Superoxide Anion Released

from Living Cells Using Nano Cobalt Ferricyanide

CUI Min1， WEN Xiao-Fang1， REN Ju-Jie*1， ZHANG Cong1， LI Na1，

HAN Yuan-Yuan1， YU Xu-Dong1， JI Xue-Ping*2

1（Department of Chemistry， School of Sciences， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018， China）

2（Department of Medical Chemistry， Hebei Medical University， Shijiazhuang 050017， China）

Abstract?A non-enzymatic superoxide anion （O·-2） electrochemical sensor （Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE） was fabricated by co-depositing cobalt ferricyanide （Co3[Fe（CN）6]2） prepared by coprecipitation method and reduced graphene oxide （RGO） prepared by Hummers method on a glassy carbon electrode （GCE）. The characteristics of Co3[Fe（CN）6]2-RGO nanocomposites and the possibility for electrochemical detection of O·-2 were studied using scanning electron microscopy （SEM）， X-ray diffraction （XRD）， electrochemical impedance spectroscopy （EIS） and cyclic voltammetry （CV）. The mechanism of Co3[Fe（CN）6]2-RGO for O·

2 detection was investigated in this work. The sensor had a sensitivity of 91.8 μA L/（μmol cm2） and a detection limit of 0.071 μmol/L （S/N = 3）. Besides， it had excellent selectivity and could avoid the interference of hydrogen peroxide， oxygen and other electrochemical active substances in vivo. It was successfully applied to the electrochemical detection of superoxide anions in stimulated MCF-7 cells. The sensor had potential application for quantifying superoxide anions in the field of pathology and biology.

Keywords?Electrochemical sensor; Superoxide anion; Cobalt ferricyanide; Reduced graphene oxide; MCF-7 cells

（Received 12 October 2019; accepted 6 December 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81872669） and the Research Foundation of Education Department of Hebei Province of China （Nos. ZD2018037， QN2019140）.