沙門氏菌檢驗(yàn)及分析

譚慧林　余琪　吳忠紅　牛貴洋

摘? 要：沙門氏菌的檢驗(yàn)工作比較復(fù)雜，對(duì)檢驗(yàn)員的要求比較高，通過(guò)參加能力驗(yàn)證可以提高檢驗(yàn)?zāi)芰?，發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)中的關(guān)鍵點(diǎn)控制。文章通過(guò)沙門氏菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證，分析沙門氏菌檢驗(yàn)過(guò)程中存在的問題，并分析原因，提高本檢驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

關(guān)鍵詞：沙門氏菌;檢驗(yàn);分析

中圖分類號(hào)：R155.5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-2945（2020）07-0079-02

Abstract： The inspection work of salmonella is more complex， and the requirements for inspectors are relatively high. By participating in the ability verification， we can improve the inspection ability and find the control of the key points in the inspection. Through the verification of the testing ability of salmonella， this paper analyzes the problems existing in the testing process of salmonella， and analyzes the reasons， so as to improve the testing ability of this laboratory.

Keywords： salmonella; examination; analysis

沙門氏菌屬是腸桿菌科中的一個(gè)重要菌屬，對(duì)人、動(dòng)物或兩者引起多種類型的疾病， 與人類健康和畜牧業(yè)及國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展關(guān)系密切。沙門氏菌病是我國(guó)和世界各地的常見病和多發(fā)病。目前全球已知的沙門氏菌屬，有的專對(duì)人類致病，有的只對(duì)動(dòng)物致病，也有對(duì)人和動(dòng)物都致病的。并且能夠在短時(shí)間內(nèi)大量繁殖。傷寒、急性腸胃炎、菌血癥和敗血癥等疾病皆是由沙門氏菌感染所引起的。嚴(yán)重致死病例多見于老人、幼童及免疫系統(tǒng)有缺陷的易感人群[1]。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌的食物中毒位居第二[2]。沙門氏菌屬菌型繁多，抗原復(fù)雜，目前從世界各地檢出的沙門氏菌菌型近兩千個(gè)（包括亞利桑那菌在內(nèi)），食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》規(guī)定[3]，食品微生物沙門氏菌的限量指標(biāo)采用采樣方案n=5，c=0，m=0/25，M=-，即檢驗(yàn)的5個(gè)樣品沙門氏菌不得檢出。在其他食品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中沙門氏菌均不得檢出。在沙門氏菌的檢驗(yàn)工作中，生化鑒定存在一定的難度，在生化鑒定過(guò)程中需要操作者有較好的工作經(jīng)驗(yàn)。提高微生物檢驗(yàn)員的檢驗(yàn)技能，提升實(shí)驗(yàn)室能力，參加能力驗(yàn)證是比較有效的手段，是識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問題并啟動(dòng)改進(jìn)措施，提高實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)?zāi)芰Φ萚4]。食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)參照國(guó)標(biāo)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

待測(cè)樣品為白色粉末，西林瓶包裝，由中國(guó)檢科院提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC） 增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽 （XLD）瓊脂、三糖鐵（TSI）瓊脂培養(yǎng)基及沙門氏菌屬生化試劑鑒定盒，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 儀器設(shè)備

滅菌鍋（施都凱公司，MJ78A）、生化培養(yǎng)箱（美墨爾特，IPP260），生物安全柜（海爾，HR50-IIA2）。

2 方法

2.1 增菌

能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書稀釋樣品到無(wú)菌BPW中進(jìn)行前增菌，放置（36±1）℃培養(yǎng)6-18h。為觀察沙門氏菌在BPW中的生長(zhǎng)情況，樣品雜菌生長(zhǎng)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置BPW培養(yǎng)6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)，這5個(gè)是階段培養(yǎng)物接種進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。即吸取1mlBPW培養(yǎng)物到轉(zhuǎn)種10ml的TTB中（42±1）℃培養(yǎng)24h，同時(shí)吸取1mlBPW培養(yǎng)物到10mlSC中（36±1）℃培養(yǎng)24h。

2.2 分離

將上述BPW不同生長(zhǎng)時(shí)段轉(zhuǎn)接的選擇性增菌液劃線分離于XLD、BS平板。BS 平板（36±1）℃培養(yǎng)48h，HE平板（36±1）℃培養(yǎng)24h。

2.3 鑒定

將在XLD、BS上的可以菌落進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

（1）沙門氏菌增菌實(shí)驗(yàn)不同培養(yǎng)時(shí)間接種到TTB、SC中的生長(zhǎng)情況見表1。

從表1可以看出在BPW中培養(yǎng)6h后轉(zhuǎn)接到SC中，SC培養(yǎng)24h略顯渾濁，隨著在BPW中前增菌的時(shí)間增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)接到SC中也渾濁明顯。而在BPW前增菌6h、8h、10h、12h、16h轉(zhuǎn)接到TTB中培養(yǎng)24h，TTB中均為澄清。

（2）轉(zhuǎn)接TTB、SC培養(yǎng)24h后劃線HE、BS平板，結(jié)果如表2，表3。

（3）挑取典型菌落劃線到營(yíng)養(yǎng)瓊脂上后，接種到三糖鐵斜面上，在斜面上的現(xiàn)象是斜面產(chǎn)堿底層產(chǎn)酸，產(chǎn)H2S，產(chǎn)氣。制備菌懸液接種到沙門氏菌生化鑒定盒進(jìn)行生化分析。結(jié)果如表4。

革蘭氏染色：從營(yíng)養(yǎng)瓊脂上挑取一株菌，進(jìn)行革蘭氏染色，通過(guò)染色后鏡檢為紅色，無(wú)芽孢。說(shuō)明我們檢驗(yàn)的目標(biāo)菌為革蘭氏陰性菌。

（4）血清分析

在潔凈的玻片上滴加一滴生理鹽水，將待試培養(yǎng)物混合于生理鹽水滴內(nèi)，使成為均一性的混濁懸液，將玻片輕輕搖動(dòng)30s～60s，在黑色背景下觀察反應(yīng)，出現(xiàn)凝結(jié)，需同時(shí)做生理鹽水空白對(duì)照。

4 討論

通過(guò)生化分析和血清學(xué)分析判斷為沙門氏菌屬。

（1）在進(jìn)行沙門氏菌的檢驗(yàn)中BPW的前增菌，我們選擇了培養(yǎng)6h、8h、10h、12h、18h，我們發(fā)現(xiàn)BPW培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)本次實(shí)驗(yàn)影響不大。但是BPW提供豐富的營(yíng)養(yǎng)使目標(biāo)菌復(fù)蘇，所以BPW的培養(yǎng)時(shí)間不能太短，不然目標(biāo)菌沒有復(fù)蘇好;也不能時(shí)間太長(zhǎng)，不然雜菌也會(huì)相應(yīng)增多，增加目標(biāo)菌的鑒別難度。我們?cè)谠囼?yàn)中可以選擇培養(yǎng)18h，避免漏檢。

（2）在生化分析從營(yíng)養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)制備菌懸液，麥?zhǔn)蠞舛瓤刂圃?.5左右，麥?zhǔn)蠞舛忍突蛱叨紩?huì)造成判斷的失誤。

（3）前增菌后必須轉(zhuǎn)接到TTB、SC中，TTB澄清的也必須同時(shí)接種BS和HE（或XLD、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基）。

（4）不同培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)弱不同，一種培養(yǎng)基不可能適合所有的沙門氏菌，所以要同時(shí)使用兩種以上的培養(yǎng)基，必須用一個(gè) BS，同時(shí)再用一個(gè) XLD或 HE或顯色培養(yǎng)基，形成互補(bǔ)，提高檢出率，以防漏檢。BS平板的選擇性比較強(qiáng)，最好現(xiàn)用現(xiàn)配，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至40-48h，甚至更久。

（5）由于選擇性培養(yǎng)基含有抑菌劑，所以生長(zhǎng)出的菌苔生化特性不是很好，會(huì)影響山梨醇、甘露醇接種前后顏色變化的判斷，極易出現(xiàn)似黃非黃，似綠非綠這樣模棱兩可的結(jié)果。所以應(yīng)盡量選擇營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的新鮮菌苔，如為營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，則選用斜面中段的菌苔，進(jìn)行生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]王學(xué)碩，崔生輝，邢書霞，等.餐飲食品中沙門氏菌的危害分析、污染調(diào)查與防控[J].中國(guó)藥事，2013，27（9）：974-979.

[2]楊正時(shí)，房海.人及動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué)[M].石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，2003：497-502.

[3]GB29921-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量[S].

[4]舒鵑娟，張偉沖，袁峰，等.食品微生物的檢測(cè)能力驗(yàn)證[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，26（3）：154-157.

[5]GB4789.4-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)[S].