花旗松素、槲皮素和桑色素與丙二胺橋聯(lián)β-環(huán)糊精的包合作用及抗氧化活性

遲紹明 楊松霖 晉文 楊惠文 王宇飛 雷澤 朱洪友 趙焱

摘?要?黃酮類化合物花旗松素（TFL）、槲皮素（QCT）和桑色素（MH）具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多種生物活性，但這些化合物水溶性差，口服利用率低，影響其藥效的發(fā)揮。橋聯(lián)β-環(huán)糊精（bis（β-CD）s）可通過兩個環(huán)糊精空腔對客體分子的協(xié)同鍵合，增強(qiáng)環(huán)糊精對藥物分子的鍵合能力，從而顯著改善藥物分子的水溶性。本研究考察了TFL、QCT和MH在溶液和固相中與丙二胺橋聯(lián)β-環(huán)糊精（H2）的包合行為。通過紫外-可見吸收光光譜（UV-Vis）、一維核磁共振氫譜（1H NMR）、二維核磁共振氫譜（2D NMR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線衍射（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）等對3種包合物（TFL/H2、QCT/H2和MH/H2）進(jìn)行表征。結(jié)果表明，3種黃酮類化合物的A環(huán)和C環(huán)分別從環(huán)糊精的小口端包結(jié)到H2的兩個空腔中，形成1∶1夾心式的包結(jié)模式。3種包合物的穩(wěn)定常數(shù)（KS）大小順序?yàn)镵MH/H2>KTFL/H2>KQCT/H2。主-客體的尺寸、形狀匹配關(guān)系和氫鍵相互作用力，是影響包合物穩(wěn)定的重要因素。形成包合物后，TFL、QCT和MH在水中的溶解度分別提高了130.2、180.4和210.1倍。此外，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，包合物TFL/H2、MH/H2的抗氧化活性顯著增強(qiáng)了游離藥物的活性。本研究為高水溶性、較好抗氧化活性的黃酮類化合物藥物的開發(fā)提供了重要參考。

關(guān)鍵詞?花旗松素; 槲皮素; 桑色素; 丙二胺橋聯(lián)β-環(huán)糊精;協(xié)同鍵合;水溶性;抗氧化活性

1?引 言

花旗松素（Taxifolin， TFL）、槲皮素（Quercetin， QCT）、桑色素（Morin hydrate， MH）（圖1）3種黃酮是在植物中發(fā)現(xiàn)的天然多酚類化合物，普遍存在于水果、蔬菜、堅(jiān)果、花和茶等多種植物中[1，2]。這些黃酮類化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗增殖、抗誘變、抗動脈粥樣硬化、保護(hù)心臟和肝臟、抗DNA損傷等多種生物活性[3，4]，特別是其優(yōu)良的抗氧化活性，因而受到廣泛關(guān)注[5]。如TFL抗氧化能力顯著，效果遠(yuǎn)優(yōu)于維生素C和維生素E，素有“清基之王”的美稱[6];QCT對油脂在氧化過程中產(chǎn)生的游離基團(tuán)具有接受體的功能，常被用作食品的抗氧化劑[7];MH除能直接清除自由基外，還可通過與體內(nèi)一些氧化酶結(jié)合，影響其構(gòu)型、構(gòu)象，抑制酶的活性，從而有效抑制自由基的生成[8，9]。但TFL、QCT和MH的水溶性較差，口服生物利用度低，限制了它們在食品和制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，開發(fā)提高這些黃酮類化合物水溶解度的方法至關(guān)重要。

環(huán)糊精（Cyclodextrin， CD）具有疏水的內(nèi)腔和親水的外表面，能夠通過主-客體包合作用，選擇性鍵合藥物分子，廣泛應(yīng)用于提高藥物的穩(wěn)定性、改善藥物的水溶解度和生物利用率、降低藥物的毒副作用和刺激性、控制藥物的釋放等領(lǐng)域[10～16]。然而，單修飾環(huán)糊精與大分子藥物的鍵合常數(shù)通常較小，而通過特定鏈連接的橋聯(lián)環(huán)糊精，兩個相鄰的環(huán)糊精空腔可以協(xié)同參與大分子藥物的包結(jié)配位作用，從而擴(kuò)展分子的鍵合能力，進(jìn)而顯著提高藥物的穩(wěn)定性和水溶解度。因此，擁有各種不同功能基橋聯(lián)環(huán)糊精的合成及其對藥物的鍵合作用研究也備受關(guān)注。如Liu等[17，18]合成了三乙烯四胺橋聯(lián)環(huán)糊精，通過兩個環(huán)糊精空腔的協(xié)同鍵合，將紫杉醇的水溶解度提高了2857倍，同時對K562白血病細(xì)胞的IC50值相比于紫杉醇降低了1.63倍。Menuel等[19]合成了冠醚偶聯(lián)橋聯(lián)β-環(huán)糊精，通過主-客體間的強(qiáng)鍵合作用將白消安的溶解度提升到10 mg/mL。本研究組近期合成了一種丙二胺橋聯(lián)環(huán)糊精，包合雷公藤紅素后，其水溶性提高60倍，同時，包合物對5株腫瘤細(xì)胞的毒性顯著強(qiáng)于對照物順鉑，對正常細(xì)胞的毒副作用弱于游離藥物[20]。然而，橋聯(lián)環(huán)糊精對黃酮類化合物包合作用的研究較少[21]。

本研究制備了1，3-丙二胺橋聯(lián)β-環(huán)糊精（H2）與TFL、QCT和MH的3種水溶性包合物，對其性質(zhì)進(jìn)行了表征，探討了H2對3種黃酮類化合物的協(xié)同鍵合行為、增溶作用以及抗氧化作用的影響。本研究為高水溶性、高抗氧化活性黃酮類化合物藥物的開發(fā)提供了重要參考。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

UV-8000S型紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析公司）; DRX500 型核磁共振儀（德國Bruker公司）; Nicolet IS10型紅外光譜儀（美國Thermo科技有限公司）; DX-2700 型X 射線衍射儀（中國丹東浩元公司）; Flex-1000 型掃描電子顯微鏡（日本日立高新公司）。

β-CD（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）;1，3-丙二胺（分析純，阿法埃莎化學(xué)有限公司）; TFL、QCT和MH（分析純，成都曼斯特生物科技有限公司），未經(jīng)純化直接使用。對甲基苯磺酰氯（TsCl，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司），按文獻(xiàn)[22]的方法純化。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。N，N′-二甲基甲酰胺（DMF）用CaO干燥24 h，然后再減壓蒸餾后使用。以β-CD和對甲苯磺酰氯為原料，在堿性水溶液中合成了單-（6-脫氧-6-對甲苯磺?；?β-環(huán)糊精[23]。

2.2?1，3-丙二胺橋聯(lián)（6-氨基-6-脫氧-β-環(huán)糊精）（H2）的合成

按文獻(xiàn)[20]的方法合成H2。1H NMR （D2O， 500MHz， TMS）：δ 4.97～5.07 （s， 14H， H-1 of CD），δ 3.67～4.01 （m， 56H， H-3， 6， 5 of CD），δ 3.40～3.61 （m， 28H， H-2， 4 of CD），δ 2.75～2.98 （m， 4H， CCH2N）， δ 1.78～1.91 （m， 2H， CCH2C）。

2.3?TFL/H2、QCT/H2和MH/H2包合物的制備

TFL、QCT和MH包合物的制備采用飽和水溶液法[24，25]。分別取0.01 mmol（0.023 g） H2溶于3 mL水，0.03 mmol TFL（或QCT或MH）溶于2 mL無水乙醇中?；旌虾?，于45℃攪拌反應(yīng)48 h。干燥，以少量水溶解，使用0.45 μm纖維素膜過濾除去未反應(yīng)的客體，真空干燥得淡黃色固體，即為TFL/H2、QCT/H2和MH/H2的包合物。

2.4?Job曲線測定

包合物的包合比用Job 曲線法測定[20，25]。由于TFL、QCT和MH客體難溶于水，所以溶劑采用無水乙醇和水的混合溶劑（體積比為3∶2），混合溶液[主體]+[客體]=3.5×10

5 mol/L。測定其最大吸收波長λmax=295 nm（TFL）和λmax=265 nm（QCT、MH）處的吸光度值。

2.5?紫外-可見（UV-Vis）光譜滴定實(shí)驗(yàn)

保持客體的濃度為3.5×105 mol/L，分別加入不同體積的主體H2的溶液（混合溶劑為體積比3∶2的乙醇-水），使最終主體的濃度分別為0、3.5、7.0、10.5、14.0、17.5、21.0 和24.5 μmol/L， 孵育1 h后，測定溶液的紫外-可見吸收光譜。

2.6?TFL/H2、QCT/H2和MH/H2包合物的水溶性實(shí)驗(yàn)

通過飽和水溶液法測定包合物在水中的溶解度。將過量的包合物溶于含有4 mL水的離心管中，于25℃恒溫2 h，其間短暫超聲3次，離心分離，取上層清液得到飽和溶液，分別測量待測液在λmax=295 nm （TFL）和λmax=265 nm （QCT，MH）處的吸光度值。

2.7?X-射線粉末衍射（XRD）、掃描電子顯微鏡（SEM）測試

X-射線粉末衍射（XRD）（Cu靶kα=0.154056 nm）測定： 工作電壓40 kV， 電流35 mA， 掃描步寬0.02 s， 采樣時間0.2 s，起止角度為5°～50°。電子顯微鏡（SEM）測試的電子加速電壓為5或3 kV。

2.8?抗氧化活性測試

通過清除穩(wěn)定的自由基2，2-二苯基-1-吡啶酰肼（DPPH）的反應(yīng)，測定3種黃酮類化合物及其包合物的抗氧化活性，此自由基在乙醇中的最大吸收波長λmax=517 nm[26，27]。將DPPH配制成8.6×105 mol/L的乙醇溶液?？腕wTFL、QCT和MH，以及包合物TFL/H2、QCT/H2和MH/H2分別用體積比為3∶2的乙醇-水混合溶劑配制成3.3×104 mol/L的待測溶液，得到客體和包合物的待測溶液。取3 mL DPPH溶液測定初始吸光度值，分別將客體待測液以第一次加10.0 μL，每次遞增10.0 μL定量加入到DPPH溶液中，使客體待測液的濃度范圍為1.1×106 ～1.1×105 mol/L。每加入一次，靜置5 min后，測定其吸光度值，監(jiān)測λmax=517 nm處的變化。包合物以同樣的方法測定?？寡趸钚裕?）通過公式（1）計(jì)算：

AOactivity（%）=Acontrol-Asample）/Acontrol（1）

其中， Acontrol代表DPPH溶液初始吸光度值， Asample代表加入待測樣品后的吸光度值。

3?結(jié)果與討論

3.1?Job曲線

通過Job法測定3種黃酮類化合物與橋聯(lián)環(huán)糊精H2之間的包合比。Job曲線（圖2）表明，在主體H2摩爾分?jǐn)?shù)為0.5時，吸光度均出現(xiàn)最大值，表明H2與TFL、QCT和MH之間均為1∶1包合。

3.2?紫外-可見（UV-Vis）吸收光譜滴定

采用紫外-可見吸收光譜滴定測定主客體的包合穩(wěn)定常數(shù)。如圖3所示，固定H2濃度（1.05×105 mol/L），隨著客體TFL濃度不斷增加，H2的吸收值不斷增大，在290和332 nm處呈現(xiàn)主峰和肩峰兩個吸收帶。

290 nm處的吸收帶歸屬于TFL中B環(huán)HOMOLUMO能級和π-π電子躍遷產(chǎn)生[28]，而332 nm處的吸收帶源于TFL中A和C環(huán)的π-π躍遷產(chǎn)生[29]。同時，隨TFL的加入，H2在330 nm處的吸收帶輕微紅移。以上結(jié)果表明，TLF與H2在溶液中形成了包合物。

如將主體H2中的兩個β-環(huán)糊精空腔視為一個主體單元[30]， 此主體（H）與客體（G）的包合過程可用方程（2）描述：

H+GKsH·G（2）

包合物的光譜滴定實(shí)驗(yàn)中， 主體的濃度一般遠(yuǎn)大于客體的濃度， 即[H]0>>[G]0。因此，包合物的穩(wěn)定常數(shù)（KS）可由方程（3）計(jì)算[1， 25， 31]：

[H]0[G]0ΔΑ=1KsΔΑ+[G]0ΔA（3）

式中，[H]0、[G]0分別表示主體環(huán)糊精衍生物和客體分子的初始濃度，A為加入客體前后主體的光譜相對強(qiáng)度變化，即△A= A（有客體）A（無客體）。

圖3中的插圖為[H]0[G]0/ΔA對[G]0繪制的擬合曲線，二者呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系， 再次表明H2與TFL的包合比為1∶1，同時， 由斜率和截距計(jì)算出包合物TFL/H2的穩(wěn)定常數(shù)（表1）。由表1可見，由于主-客體間弱的疏水相互作用，丙二胺單修飾β-環(huán)糊精H1與3種黃酮類化合物的鍵合能力較低。而采用丙二胺基團(tuán)將兩個環(huán)糊精空腔橋連接起來后，可得到具有雙重疏水結(jié)合作用和多重識別功能的丙二胺橋聯(lián)β-環(huán)糊精H2，由于結(jié)合位點(diǎn)增加，極大地提高環(huán)糊精對客體的鍵合能力。H2與H1相比，對TFL、QCT和MH的包結(jié)穩(wěn)定常數(shù)分別提高了4.3、11.5和1.9倍。H1和H2對黃酮分子的選擇性順序均為： MH>TFL>QCT。原因可能是由于3種黃酮類化合物雖然具有相似的結(jié)構(gòu)，但MH中C環(huán)上的兩個羥基位于間位，而TFL和QCT化合物C環(huán)上的兩個羥基位于鄰位，故MH具有更小的空間位阻，更容易嵌入到環(huán)糊精的空腔中，導(dǎo)致主體化合物對MH鍵合能力最強(qiáng)。同時，TFL與QCT結(jié)構(gòu)相似，但比較兩者的B環(huán)后發(fā)現(xiàn)，前者更趨近立體化，后者為一個平面結(jié)構(gòu)。由于TFL中B環(huán)上的羥基向外，更易與H2橋鏈上的胺基形成氫鍵，所以主體化合物對TFL的鍵合能力強(qiáng)于QCT。上述結(jié)果表明，主-客體的尺寸、形狀匹配關(guān)系和氫鍵相互作用力，是決定3種黃酮類化合物包合物穩(wěn)定性的重要因素。

3.3?一維核磁共振氫譜（1 H NMR）

主客體分子在包合過程中，化學(xué)位移的變化是表征包合物的一種有效方法[32]。 圖4為MH（a）、H2（b）、MH/H2（c）包合物的1H NMR譜圖， MH的溶劑為CD3OD， 其它溶劑為D2O。由圖4a可見，MH的特征峰主要集中在δ 6.0×106～7.8 ×106之間; 圖4b中H2的特征峰主要集中在δ 3.0×106～4.0 ×106之間，在δ 6.0×106～7.0 ×106之間沒有任何峰; 圖4c中包合物既有H2，又有MH的特征峰。由于TFL、QCT和MH水溶性較差，當(dāng)采用D2O作溶劑時幾乎不溶，而其包合物在D2O中都能較好溶解，表明H2對客體具有增溶作用，初步說明包合物制備成功。由表2可知， 形成包合物后，環(huán)糊精上H1-6的化學(xué)位移均向高場移動（δ=0.02×106～0.03 ×106），其中H3和H5化學(xué)位移變化最大，達(dá)到了0.04 ×106。這可能是由于MH分子的兩端分別進(jìn)入H2的兩個空腔，環(huán)糊精上的H3和H5與MH靠得較近，受A、C苯環(huán)環(huán)形電子流屏蔽影響，化學(xué)位移略移向高場，而H1、H2 、H4和H6在空腔外受MH的影響很小[1，33]。QCT、TFL與H2的包合情況與此類似。由此表明，已形成TFL/H2、QCT/H2和MH/H2包合物。

3.4?二維核磁共振氫譜（2D NMR）

旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系NOE譜，即ROESY譜，常用來檢測 H-H 的空間相關(guān)， 若存在NOE， 則表示相關(guān)氫H-H較接近。因此， 常用ROESY譜推測主客體的包結(jié)模式[34～36]。圖5為MH/H2包合物的2D ROESY譜圖，相關(guān)峰A、B表明MH的H6'、H7'和H8'質(zhì)子與H2的H5質(zhì)子有著較強(qiáng)的相關(guān)，而與H2的H3質(zhì)子有著相對較弱的相關(guān);相關(guān)峰C表明MH的H1'、H2'和與H2的H3、H5質(zhì)子相關(guān)。由于H3位于環(huán)糊精的大口端，H5位于小口端，由此推斷MH的A環(huán)和C環(huán)分別從環(huán)糊精的小口端包結(jié)到兩個空腔中，形成了夾心式的包結(jié)模式，如圖6所示。TFL/H2、QCT/H2包合物給出了類似的包結(jié)模式。在這種模式下，黃酮類化合物的A環(huán)和C環(huán)通過主客體相互作用分別從環(huán)糊精的小口端包結(jié)到H2的兩個空腔中，同時，橋鏈基團(tuán)上的胺基與黃酮B環(huán)上的羥基或羰基存在氫鍵相互作用，這種雙重疏水結(jié)合作用和多重識別功能，可以顯著提高H2對黃酮類化合物的鍵合能力，從而改善其水溶解度。

3.5?紅外吸收光譜

圖7為TFL/H2包合物的紅外光譜（FT-IR）圖，其中a為客體分子，b為主體，c為包合物。TFL的紅外譜圖（圖7a）由3417、1646、1607、1474、1378、1168、1136、1079和1000 cm1等主要吸收峰組成，分別歸屬于芳香環(huán)的ν（OH）、ν（CO）、ν（CC）;C環(huán)的δip（CH）、 δ（OOH）、δ（COC）、δip（CH）、 δip（CH）和δ（CH）。在H2的紅外光譜（圖7b）中，主要吸收峰出現(xiàn)在3415 cm1（ν（OH））、1637 cm1（ν （OH））、1147和1023 cm1（分別為H2葡萄糖單元中的ν（CO））和ν（COC））。 而TFL/H2包合物中H2的νOH）（的特征吸收峰由3415 cm1移動到3438 cm1處，且峰形也發(fā)生了變化（圖7c），這可能是由于形成包合物后，環(huán)糊精小口端羥基之間的氫鍵被破壞，使其吸收峰紅移了21 cm1。并且，包合物在800～1000 cm1 處TFL的特征吸收帶強(qiáng)度明顯減弱，而展現(xiàn)出H2的特征吸收帶，但與H2相比，峰形的變化較明顯。其它包合物中展現(xiàn)出了相似的結(jié)果，表明包合物制備成功。

3.6?X-射線粉末衍射

圖8為TFL/H2包合物的X-射線粉末衍射（XRD）圖，TFL（圖8a）具有與晶體性質(zhì)一致的衍射圖，而H2（圖8b）是無定型的粉末形態(tài)， TFL/H2包合物（圖8c）并未展現(xiàn)出晶體的形態(tài)特征，而是表現(xiàn)出與H2更加相似的非晶體形態(tài)特征。與H2相比，TFL/H2包合物在12°、19°（2θ）區(qū)域的峰強(qiáng)度均有所減弱，且19°區(qū)域的峰明顯變鈍，同時，包合物在24°、27°（2θ）區(qū)域出現(xiàn)新的衍射峰，這種相對的變化，表明TFL/H2包合物形成。其它的包合物展現(xiàn)出了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.7?掃描電子顯微鏡分析

由TFL、H2、TFL/H2的SEM圖（圖9）可見，TFL具有疏松顆粒狀形態(tài)（圖9A），H2呈現(xiàn)表面光滑的類似塊狀晶體形態(tài)（圖9B），TFL/H2包合物為光滑平面上嵌入類似細(xì)小晶體的形態(tài) （圖9C）。QCT和MH的是針狀類晶體的外形，與H2形成包合物（圖略）后，在光滑表面都較均勻嵌入了細(xì)小的顆粒，形態(tài)發(fā)生了明顯變化。由此可推斷，TFL、QCT和MH均與H2有效形成包合物。

3.8?包合物水溶性分析

如表3所示，通過飽和水溶液法[25]，測得TFL、QCT、MH飽和溶液的吸光度值，代入其標(biāo)準(zhǔn)工作曲線， 得到TFL、QCT和MH在水中的溶解度，分別為20.06、12.72和12.40 g/mL。由于H1-2具有疏水的空腔和親水的表面， 都可通過非共價鍵相互作用與水溶性差的客體形成包合物，使客體的水溶解度大大提高。但由于主-客體間弱的疏水相互作用，丙二胺單修飾β-環(huán)糊精H1與3種黃酮類化合物的鍵合能力較低，而丙二胺橋聯(lián)β-環(huán)糊精H2通過兩個環(huán)糊精空腔對客體分子的協(xié)同包結(jié)，從而顯著提高環(huán)糊精的鍵合能力以及增溶能力，與H2形成包合物后，TFL、QCT和MH在水中的溶解度分別提高了130.2、 180.4和210.1倍。

3.9?抗氧化性活性

DPPH自由基清除法常用于評價天然抗氧化劑清除自由基的能力[27，37]。由于氫或電子供體化合物在517 nm處有吸收，通過測量此處吸光度的降低值，可測定其抗氧化活性。結(jié)果如圖10所示，隨著TFL、QCT、MH濃度不斷增加，DPPH清除率呈現(xiàn)梯度增加。與H2包合后，TFL和MH的抗氧化活性顯著提高。當(dāng)濃度為8.8×106 mol/L時，MH/H2和TFL/H2分別為53.5%和51.7%，游離MH僅為42.0%，相應(yīng)的包合物抗氧化活性均值比未包結(jié)物分別提高2.43%和5.58%。通過T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)表明，兩組數(shù)據(jù)具有顯著性差異（p<0.05），表明數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而與游離的QCT相比，QCT/H2的抗氧化能力有所降低。

抗氧化劑清除DPPH自由基的能力與其供氫能力有關(guān)[21，38]。TFL/H2和MH/H2抗氧化活性的提高可能是由于包合時，TFL、MH與H2間形成了分子間氫鍵，削弱了分子內(nèi)氫鍵，有利于供氫。然而QCT化合物C環(huán)鄰位上的羥基，由于空間位阻作用只能部分進(jìn)入到CD空腔中，形成較弱的包合物，從而削弱了QCT與H2之間的氫鍵相互作用，包合物的抗氧化活性有所降低。由此可見，橋聯(lián)環(huán)糊精H2對TFL、QCT、MH鍵合模式的強(qiáng)弱會影響到這些黃酮類化合物的抗氧化活性。

4?結(jié) 論

制備了丙二胺橋聯(lián)環(huán)糊精H2與TFL、QCT、MH的3種水溶性較好、摩爾比為1∶1的包合物。研究表明，H2通過兩個環(huán)糊精空腔對客體分子的協(xié)同包結(jié)，從而提高了環(huán)糊精對3種黃酮類化合物的鍵合能力，進(jìn)而顯著改善TFL、QCT、MH的水溶性?？寡趸钚苑治霰砻?，H2通過包合作用增強(qiáng)了TFL、MH的抗氧化能力。本研究為獲得新型高水溶性、較好抗氧化活性的黃酮類化合物提供了一條可行的途徑，其在食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療保健品等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。

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Inclusion and Antioxidant Properties of Taxifolin， Quercetin and Morin

Hydrate with Diaminopropane Bridged Bis（β-cyclodextrin）s

CHI Shao-Ming1， YANG Song-Lin1， JIN Wen1， YANG Hui-Wen1， WANG Yu-Fei1，

LEI Ze2， ZHU Hong-You2， ZHAO Yan*1

1（College of Chemistry and Chemical Engineering， Yunnan Normal University， Kunming 650500， China）

2（Guangdong Goodscend Pharmaceutical Technology Co.， Ltd， Shantou 515098， China）

Abstract?Taxifolin （TFL）， quercetin （QCT） and morin hydrate （MH） are common flavonoids in nature. They have many biological activities， such as antioxidant， anti-inflammatory， anti-allergic， anti-tumor and so on， but these compounds have poor water solubility and low oral utilization rate， which hinder the pharmacological action of these compounds. The bridged bis（β-cyclodextrin）s （bis（β-CD）s） has been known as it can significantly alter the molecular binding ability and the water solubility toward drug molecules， through the cooperative binding of drug molecule by two hydrophobic cavities located in close vicinity. In this work， the inclusion behavior of TFL， QCT and MH with diaminopropane bridged bis （β-CD）s） （H2） in solution and solid phase was studied. The three inclusion complexes （TFL/H2， QCT/H2 and MH/H2） were characterized by ultraviolet visible spectrum （UV-VIS）， 1H nuclear magnetic resonance spectrum （1H NMR）， two-dimensional nuclear magnetic resonance spectrum （2D NMR）， scanning electron microscope （SEM）， X-Ray diffraction spectrum （XRD） and Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR）. The results showed that the A ring and C ring of the three flavonoids were separately included in two β-CD cavities from narrow side of H2， forming a 1∶1 cooperative sandwich binding mode. The order of stability constant （KS） of the three inclusion complexes was KMH/H2>KTFL/H2>KQCT/H2. The inclusion complex stability depended greatly on the host-guest size， shape matching relation and hydrogen bond interaction force. After the formation of inclusion complex， the solubility of TFL， QCT and MH in water increased by 130.2， 180.4 and 210.1 times， respectively. In addition， the antioxidant activities were determined by 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazide （DPPH） radical scavenging method. Excitingly， the antioxidant activities of TFL/H2and MH/H2 inclusion complexes presented a satisfactory antioxidant activity， which was even higher than that of free drugs. The study provided an important reference for the development of flavonoids with high water solubility and good antioxidant activity.

Keywords?Taxifolin; Quercetin; Morin hydrate; Diaminopropane bridged bis（β-cyclodextrin）s; Cooperative bonding; Water solubility; Antioxidant activity

（Received 16 September 2019; accepted 21 November 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos.21362046， 21062030） and the Yangfan Innovative and Entepreneurial Research Team Project （No. 201312S09）.