GAP1基因缺失對上面發(fā)酵酵母高級醇代謝能力的影響

孫中貫，王孟祺，王亞平，肖冬光

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

小麥啤酒是以小麥芽作為主要原料，有時也使用未發(fā)芽的小麥作為原料生產(chǎn)的一類啤酒[1]．根據(jù)我國2008年頒布的GB/T 4927—2008[2]規(guī)定：小麥芽應(yīng)占麥芽使用總量的 40%以上，而德國啤酒《純凈法》規(guī)定小麥芽用量占總原料的50%以上[3]；目前在國際上并未形成統(tǒng)一的規(guī)定．小麥啤酒采用上面發(fā)酵法釀制，發(fā)酵溫度一般為 20～24℃[4]，成品小麥啤酒具有泡沫潔白細(xì)膩、口味醇厚、苦味較輕、熱量高、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[5-6]．

20世紀(jì)80年代，我國啤酒企業(yè)就已經(jīng)開始引進(jìn)小麥啤酒，但多年來小麥啤酒在消費(fèi)者中的認(rèn)知度并不高．近年來，隨著消費(fèi)者的需求日趨多元化、細(xì)分化、個性化，同時由于全球大麥資源的短缺、價格的上漲；各地啤酒企業(yè)積極調(diào)整產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，開發(fā)高品質(zhì)、多元化、個性化的產(chǎn)品[7]．其中，小麥芽以其優(yōu)良的釀造特性而受到釀造者們的青睞[8-9]．但小麥啤酒由于其較高的發(fā)酵溫度以及原料中豐富的蛋白質(zhì)含量，導(dǎo)致成品中高級醇含量高達(dá)300mg/L以上，而大麥啤酒的高級醇含量一般在 100mg/L以下，優(yōu)質(zhì)啤酒則需控制在 50mg/L左右[10-11]．高級醇含量過高，將導(dǎo)致飲用后產(chǎn)生口渴、頭痛等癥狀，不利于飲用者的身體健康，嚴(yán)重影響小麥啤酒的發(fā)展[12]．

高級醇是在啤酒釀造過程中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)產(chǎn)生的主要風(fēng)味代謝產(chǎn)物之一；其合成過程主要有兩條途徑：一種是以丙酮酸為代謝起始物的糖酵解合成代謝途徑；另一種是以氨基酸為代謝起始物的氨基酸分解代謝途徑，如圖1所示[10-13]．目前，有關(guān)高級醇的代謝研究主要集中在這兩條途徑上[11]，而有關(guān)酵母菌株碳、氮源代謝調(diào)控對高級醇代謝影響的研究還鮮有報道．

在釀酒酵母中，GAP1基因編碼的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種通用型的氨基酸運(yùn)輸載體，能夠?qū)⑴囵B(yǎng)物中所有的在蛋白質(zhì)中常見的D型和L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到酵母細(xì)胞內(nèi)，供酵母生長代謝所用[14-15]．Chiva等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GAP1基因的缺失不僅會影響釀酒酵母對氮源的利用，還對其他氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生了影響．GAP1基因?qū)︶劸平湍赴被岬睦镁哂惺种匾淖饔?，這有可能影響釀酒酵母合成高級醇的代謝能力，但目前還沒有研究報道GAP1基因與高級醇代謝之間的關(guān)系．

本研究以上面發(fā)酵酵母 S17為出發(fā)菌株，通過構(gòu)建GAP1一個等位基因敲除菌株和GAP1兩個等位基因敲除菌株，考察GAP1基因缺失對釀酒酵母高級醇代謝能力及發(fā)酵性能的影響．

圖1 釀酒酵母高級醇代謝網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 Biosynthetic pathways of higher alcohols formation in Saccharomyces cerevisiae

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

本研究中所用菌株見表 1，引物見表 2．質(zhì)粒pUG6(Kanr，包含loxP-KanMX-loxP)為本實(shí)驗(yàn)室保存．其中，上面發(fā)酵酵母S17購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(保藏號為CICC1929)．

表1 菌株Tab. 1 Strains

表2 引物Tab. 2 Primers

1.1.2 主要儀器

MS204S電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；PCR儀、核酸分析儀，美國Bio-Rad公司；全自動生長曲線分析儀，芬蘭 Bioscreen公司；1100系列高效液相色譜儀、7890A型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；實(shí)時熒光定量PCR儀，美國AB公司．

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母培養(yǎng)基(YEPD，g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH．

細(xì)菌培養(yǎng)基(LB，g/L)：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母浸粉5，自然pH．

半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(YEPG，g/L)：半乳糖 20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH．

麥芽汁培養(yǎng)基：稱量粉碎后的小麥芽，按 1﹕4的料水比，30℃投料并保持 30min，65℃保持90min，78℃保持 10min，經(jīng)過濾、煮沸、冷卻至室溫后，調(diào)整表觀糖度至12°P．

以上培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基需加20g/L瓊脂粉．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的片段的擴(kuò)增

以上面發(fā)酵酵母 S17菌株的基因組 DNA為模板，利用引物對 GA-F/GA-R、DGA-F/DGA-R、GBF/GB-R、DGB-F/DGB-R擴(kuò)增GAP1基因的兩條上游同源序列 GA和 DGA、兩條下游同源序列 GB和DGB．以質(zhì)粒 pUG6為模板，GK-F/GK-R、DGKF/DGK-R為引物擴(kuò)增KanMX、KanMX-D片段．

1.2.2 酵母的轉(zhuǎn)化和重組子的篩選

釀酒酵母的轉(zhuǎn)化采用 LiAc/SSDNA/PEG法[17].利用G418篩選轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR定點(diǎn)驗(yàn)證．

1.2.3 啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將甘油管中保存菌種轉(zhuǎn)接至 YEPD試管斜面30℃活化培養(yǎng) 2d．取活化后的斜面菌種 1環(huán)，接種于裝有50mL 12°P麥芽汁培養(yǎng)基的250mL三角瓶內(nèi)，24℃靜置培養(yǎng) 36h．種子液經(jīng)離心無菌水洗滌2次后得到酵母泥，按 0.5%的接種量接入盛有150mL麥芽汁培養(yǎng)基的 250mL三角瓶內(nèi)，20℃靜置發(fā)酵．

1.2.4KanMX抗性基因的去除

采用 Cre/loxP報告基因挽救系統(tǒng)[18]，剔除陽性轉(zhuǎn)化子中的篩選標(biāo)記基因KanMX．利用影印平板法篩選 G418抗性陰性轉(zhuǎn)化子，以 K-U/K-D為引物對進(jìn)行PCR驗(yàn)證．

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)

酵母RNA的提取使用Yeast RNAiso Kit酵母總RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行基因組 DNA的去除和 cDNA的合成．使用SYBR?PremixEx TaqTMⅡ 試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR，通過 ΔΔC(t)值法對目的基因及內(nèi)參基因UBC6進(jìn)行基因表達(dá)量的分析．

1.2.6 指標(biāo)測定

生長曲線的測定：以 YEPD液體培養(yǎng)基為空白對照，采用全自動生長曲線測定儀測定菌液在波長為600nm處的吸光度．以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線．

CO2排放量的測定：發(fā)酵前預(yù)先稱量發(fā)酵體系總質(zhì)量，發(fā)酵過程中每隔12h稱量1次，稱量前應(yīng)先搖晃三角瓶，以去除發(fā)酵液中的 CO2，當(dāng)質(zhì)量減少小于0.1g時，表示發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束[19]．

糖類物質(zhì)的測定：葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖含量測定采用高效液相色譜法[19]．高效液相色譜條件為：Bio-Rad公司的 Aminex HPX-87H色譜柱(300mm×7.8mm，9μm)，流動相為 5mmol/L 的稀硫酸，流量 0.6mL/min，柱溫 65℃，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度 45℃．樣品稀釋到合適的質(zhì)量濃度(低于 1000mg/L)并用 0.22μm 的濾膜過濾，進(jìn)樣量20μL．

α–氨基氮含量的測定：采用茚三酮比色法測定．2mL樣品稀釋液中加入 1mL顯色劑，沸水浴中加熱 16min，立即在 20℃水浴中冷卻 20min，于570nm測定吸光度．

啤酒中高級醇含量的測定：啤酒發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后得到的樣品使用氣相色譜法測定．色譜條件：LAP-930色譜柱(50m×0.32mm×1.0μm)；檢測器為氫火焰離子化檢測器；初始柱溫 50℃，保持 8min，以5℃/min的升溫速率升至200℃，保持5min；進(jìn)樣量1.0μL；分流比 10﹕1．

其他發(fā)酵參數(shù)的測定：利用手持糖度折光儀測定原麥汁的表觀糖度；利用斐林試劑法測定發(fā)酵液中還原糖的含量；酒精度及發(fā)酵度的測定依據(jù)啤酒分析方法進(jìn)行[20]．

2 結(jié)果與討論

2.1 GAP1一個等位基因敲除重組菌株的構(gòu)建

將GAP1基因上游同源序列GA片段、下游同源序列 GB片段和KanMX片段轉(zhuǎn)化上面發(fā)酵酵母S17，同源重組過程如圖2所示．對在G418質(zhì)量濃度為50mg/L的YEPD平板上生長的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子命名為S17G．

重組菌株 S17G的 PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖 3所示．以重組菌株 S17G基因組為模板，以 G1-F/G1-R為引物能夠擴(kuò)增得到長度為 1304bp的片段，以G2-F/G2-R為引物能夠擴(kuò)增得到長度為1012bp的片段，兩條片段均與設(shè)計(jì)片段長度一致；而以出發(fā)菌株 S17基因組為模板無法獲得與目的片段長度一致的條帶，同時也沒有擴(kuò)增得到其他長度的片段．PCR驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)，KanMX片段已整合到出發(fā)菌株 S17的基因組上，且整合位點(diǎn)正確．

構(gòu)建GAP1兩個等位基因敲除的重組菌株，需要以重組菌株 S17G為模板，并再次利用KanMX抗性基因作為篩選標(biāo)記，因而必須剔除存在于重組菌株S17G基因組上的KanMX抗性基因．利用 Cre/loxP報告基因挽救系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)KanMX抗性標(biāo)記的剔除和反復(fù)利用．

圖2 同源重組過程Fig. 2 Homologous recombining process

圖3 重組菌株S17G的PCR驗(yàn)證Fig. 3 PCR verification of the mutant strain S17G

重組菌株S17G基因組中的KanMX抗性基因剔除的 PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖3(b)所示，將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子命名為S17G-K．以K-U與K-D為引物，以重組菌株 S17G為模板，能夠擴(kuò)增出長度為 1613bp的KanMX抗性基因片段；以重組菌株S17G-K為模板，無法擴(kuò)增出與KanMX抗性基因長度一致的目的片段；結(jié)果證實(shí)重組菌株 S17G基因組中的KanMX抗性基因已被剔除．

重組菌株 S17G-K敲除GAP1一個等位基因的PCR驗(yàn)證如圖 3(c)所示．以出發(fā)菌株 S17的基因組為模板，利用引物DG1-F/DG2-R能夠擴(kuò)增得到1條長度為2148bp的片段，片段長度與設(shè)計(jì)片段長度大小一致．以重組菌株 S17G-K的基因組為模板，能夠擴(kuò)增得到 2條長度分別為 2148bp和 755bp的片段，且片段長度與設(shè)計(jì)片段長度大小一致．PCR驗(yàn)證結(jié)果表明重組菌株 S17G-K為GAP1一個等位基因敲除的重組菌株．

2.2 GAP1兩個等位基因敲除重組菌株的構(gòu)建

采用縮進(jìn)式基因整合的方式，即同源序列 DGA位于同源序列GA的下游區(qū)域，同源序列DGB位于同源序列GB的上游區(qū)域，且同源序列彼此之間均無重復(fù)區(qū)域，將上游同源序列 DGA片段、下游同源序列DGB片段和KanMX-D片段轉(zhuǎn)化重組菌株S17GK，同源重組過程參照圖2．獲得的G418抗性轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示．

以重組菌株 S17G-K為出發(fā)菌株，再次進(jìn)行GAP1基因的敲除，將得到的陽性重組菌株命名為S17G2．以重組菌株 S17G2基因組為模板，利用兩對引物 DG1-F/DG1-R、DG2-F/DG2-R能夠擴(kuò)增獲得長度分別為1394bp和1033bp的片段，且片段長度與設(shè)計(jì)片段長度一致．而以出發(fā)菌株S17G-K的基因組為對照，無法擴(kuò)增獲得與目的片段長度一致的片段，同時也沒有擴(kuò)增得到其他長度的片段．PCR驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)，重組片段已整合到出發(fā)菌株S17G-K的基因組上，且整合位點(diǎn)正確．重組菌株 S17G2剔除KanMX抗性基因的重組菌株S17G2-K的PCR驗(yàn)證如圖4(b)所示．以K-U與K-D為引物，以重組菌株S17G2為模板，能夠擴(kuò)增獲得長度為 1613bp的KanMX抗性基因片段；以重組菌株 S17G2-K為模板，無法擴(kuò)增得到與KanMX抗性基因長度一致的目的片段；結(jié)果證實(shí)重組菌株 S17G2基因組中的KanMX抗性基因已被剔除．

以重組菌株 S17G2-K的基因組為模板，利用引物 DG1-F/DG2-R能夠擴(kuò)增得到長度分別為 1705bp和 755bp的片段，所得片段長度與設(shè)計(jì)片段長度大小一致，PCR驗(yàn)證結(jié)果表明獲得的重組菌株 S17G2-K為GAP1兩個等位基因敲除的突變株．

圖4 重組菌株S17G2的PCR 驗(yàn)證Fig. 4 PCR verification of the mutant strain S17G2

2.3 GAP1基因轉(zhuǎn)錄水平

為了檢測GAP1基因在重組菌株中的表達(dá)量，利用實(shí)時熒光定量 PCR技術(shù)，以 GAP1-F與 GAP1-R為引物，對重組菌 S17G、S17G2及親本菌株 S17的GAP1基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，結(jié)果如圖 5所示.

圖5 GAP1基因轉(zhuǎn)錄水平Fig. 5 Transcription of GAP1 gene

GAP1一個等位基因敲除后，其轉(zhuǎn)錄水平約降低了 65%，GAP1兩個等位基因敲除后，其轉(zhuǎn)錄水平為0；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GAP1基因的敲除降低了其在釀酒酵母菌株S17中的表達(dá)水平．

2.4 重組菌株生長性能分析

以原始菌株S17為對照，對敲除GAP1一個等位基因的重組菌株 S17G和敲除GAP1兩個等位基因的重組菌株S17G2進(jìn)行生長曲線的測定，結(jié)果如圖6所示．重組菌株的生長速率均受到了一定程度的影響．與原始菌株相比，重組菌株 S17G的生物量沒有發(fā)現(xiàn)顯著的變化；而重組菌株 S17G2的生物量受到了一定程度的影響，較原始菌株稍有下降．這可能是由于GAP1基因部分或完全敲除后菌株對氨基酸的吸收能力受到了影響，從而阻礙了菌體的生長．

圖6 重組菌株S17G、S17G2及親本S17的生長曲線Fig. 6 Growth curves of mutants S17G，S17G2 and parental strain S17

2.5 重組菌株發(fā)酵性能分析

對重組菌株及親本菌株進(jìn)行全小麥麥芽汁發(fā)酵，每隔12h稱量1次，測定發(fā)酵液的CO2釋放量，結(jié)果如圖 7所示．重組菌株 S17G、S17G2與親本菌株S17相比，在整個發(fā)酵過程中重組菌株S17G的CO2釋放量較親本菌株 S17略低，重組菌株 S17G2的CO2釋放量最低；但重組菌株S17G及S17G2的整體發(fā)酵趨勢與親本菌株S17一致，說明GAP1基因的敲除沒有顯著影響菌株的發(fā)酵速率．

圖7 重組菌株S17G、S17G2及親本S17的CO2釋放量Fig. 7 CO2 emission amount of mutants S17G，S17G2 and parental strain S17

發(fā)酵結(jié)束后，測定各菌株發(fā)酵液中還原糖含量、酒精度及發(fā)酵度，進(jìn)一步探究重組菌株的基本發(fā)酵性能，結(jié)果見表3．對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明重組菌與親本菌株 S17 發(fā)酵液的酒精度、還原糖含量以及發(fā)酵度均無明顯差異，說明GAP1基因的敲除沒有影響啤酒發(fā)酵的基礎(chǔ)指標(biāo)．

2.6 不同菌株風(fēng)味物質(zhì)的代謝能力

重組菌株與親本菌株代謝產(chǎn)生高級醇和酯類物質(zhì)的差異，見表 4．與出發(fā)菌株 S17相比，重組菌株S17G 發(fā)酵產(chǎn)生的總高級醇含量降低了 17.47%，其中異丁醇的生成量下降最為顯著，降低了46.01%，另外，在酯類物質(zhì)中乙酸異戊酯的生成量降低了52.61%；重組菌株 S17G2 發(fā)酵產(chǎn)生的總高級醇含量進(jìn)一步降低，降低了21.98%，其中除異丁醇的生成量下降最為顯著外，活性戊醇、正丙醇、異戊醇也有不同程度的降低，在酯類物質(zhì)中，乙酸異戊酯的生成量降低了約 45.76%．這表明GAP1基因?qū)︶劸平湍父呒壌即x具有極為顯著的影響．

表4 不同菌株風(fēng)味物質(zhì)代謝能力的比較Tab. 4 Comparison of flavor substance produced by different strains

2.7 α-氨基氮及糖類物質(zhì)的代謝能力

利用茚三酮比色法測定發(fā)酵過程中重組菌株與親本菌株發(fā)酵液中α–氨基氮的含量，其變化趨勢如圖8所示．與親本菌株S17相比，重組菌株S17G和S17G2對α–氨基氮的利用能力明顯減弱，不僅利用速率出現(xiàn)不同程度的減緩，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中α–氨基氮的含量也顯著增加．結(jié)果證明，GAP1基因的部分或完全缺失都會對上面發(fā)酵酵母 S17利用α–氨基氮的能力產(chǎn)生影響，但影響程度并沒有隨基因功能的減弱呈疊加效應(yīng)．

圖8 不同菌株發(fā)酵過程中α-氨基氮的含量Fig. 8 Concentration of α-amino acid of different strains during fermentation

通過 HPLC 測定了發(fā)酵結(jié)束后，各菌株發(fā)酵液中麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖的含量，結(jié)果見表5．

表5 不同菌株糖類物質(zhì)代謝能力的比較Tab. 5 Comparison of metabolic capacity of carbohydrates different strains

重組菌株 S17G、S17G2 和親本菌株 S17 均能夠充分利用全小麥麥芽汁中的葡萄糖和麥芽三糖；但對麥芽糖的利用，重組菌株與親本菌株相比存在顯著差異．發(fā)酵結(jié)束后，重組菌株 S17G 的麥芽糖利用能力降低31.08%，重組菌株S17G2 的麥芽糖利用能力降低35.14%．這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GAP1基因的部分或完全缺失對上面發(fā)酵酵母 S17利用麥芽糖的能力產(chǎn)生了一定影響．

重組菌株S17G與S17G2對α–氨基氮和麥芽糖的利用能力均呈現(xiàn)下降的趨勢，對重組菌株的發(fā)酵性能和生長性能產(chǎn)生了一定的影響，同時影響了重組菌株合成高級醇及酯類物質(zhì)等次級代謝產(chǎn)物的能力.這可能是因?yàn)橹亟M菌株對碳源和氮源利用能力的下降不足以對菌株的初級產(chǎn)物合成能力產(chǎn)生顯著的影響，而只是顯著影響了次級代謝產(chǎn)物的合成能力．

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用基因同源重組的原理及 Cre/loxP報告基因挽救系統(tǒng)，在上面發(fā)酵酵母菌株中實(shí)現(xiàn)了GAP1基因的單敲除和雙敲除．重組菌株 S17G及S17G2的高級醇合成能力得到不同程度的減弱．通用型氨基酸通透酶編碼基因GAP1的部分或完全缺失能夠減弱釀酒酵母對α–氨基氮的利用能力，同時對麥芽糖的利用能力產(chǎn)生一定程度的影響．發(fā)酵性能的測定結(jié)果表明，重組菌株符合啤酒發(fā)酵的基本要求，具有一定的實(shí)際應(yīng)用潛力．