尿道組織工程的進展研究

張左 程帆

男性尿道兼具排尿和排精功能[1]。由于先天畸形或后天損傷、疾病等原因導致尿道損傷或狹窄。目前,處理尿道狹窄的方法包括尿道擴張、尿道切開術或者更具侵入性的操作比如吻合尿道成形術和替代尿道成形術[2]。對于廣泛和嚴重的病人，這些方法常常不能解決問題而需要做移植物替代。在移植物短缺的情況下，組織工程技術可能成為解決這一情況的可行的解決方法。本文將從尿道組織工程的細胞來源、材料和方法等進行綜述。

一、支架材料

理想的支架材料應該提供有利于細胞增殖、遷移和再組織化的多孔環(huán)境，擁有適當的拉伸強度和剛性以防新生組織完全形成之前出現崩塌，且支架經過一段時間能夠完全分解和再吸收，以及沒有或有較低的免疫原性、毒性和異物反應。此外，支架材料應當具備適當理化性質能在常規(guī)滅菌條件下進行滅菌使用。尿道重建材料包括天然材料和合成高分子材料兩大類。

1.生物支架：天然支架既可以是供體通過物理或生化方式脫細胞處理得到的脫細胞組織，也可以是利用膠原、彈性蛋白等天然材料編織而成的生物工程補片[3]。尿道修復重建中常用的脫細胞基質有小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)、膀胱脫細胞基質(bladder acellular matrices,BAM)、裸人羊膜支架(denuded human amniotic scaffold,dHAS)和脫細胞海綿體基質(acellular corpus spongiosum matrices,ACSM)等。脫細胞支架有許多優(yōu)點，如保持原有組織的微觀結構和細胞外基質生化成分(包括膠原、彈力蛋白、層黏連蛋白、一些重要的生長因子和生物活性物質)，其缺點在于難以控制結構強度和理化性質，這些特點與植入尿道后發(fā)生纖維化和攣縮相關[4]。Chun等[5]利用脫細胞膀胱黏膜下層基質(bladder submucosa matrix,BSM)與自體尿道組織聯(lián)合治療兔長段尿道狹窄，BSM/自體尿道組織移植組具有正常的尿道內腔，致密的肌層，完全上皮化和再生尿道內血管漸進性浸潤。BSM移植組則顯示角質化上皮，大量膠原化纖維結締組織，缺乏環(huán)狀平滑肌束。因此，采用脫細胞BSM支架與自體尿道組織移植相結合的非橫切腹側嵌套尿道成形術是一種可行的尿道重建方法。除了脫細胞補片外，支架還可以由天然材料制成，因其形狀和構成與所選材料的細胞外基質類似。膠原是最常用的材料，其他材料還有絲素蛋白、藻酸鹽等。精確且優(yōu)化設計支架的各種性能(包括基質的選擇、紋理和孔隙率等)對于在不減少細胞種植和存活率的情況下取得滿意的結構強度顯得至關重要[6]。

2.合成支架：相較于天然支架，合成支架具有較低的成本，獲取便利，倫理學風險更低。合成支架可以根據孔隙尺寸、構成以及是永久性還是可吸收的進行區(qū)分。目前制造合成支架有多種方法，包括針織、機織、電紡織、3D打印、沉淀法和注射成模等[7-8]。轉化生長因子(TGF)-β通過調節(jié)WNT信號通路促進細胞外基質的分泌，Zhang等[9]利用遞送WNT通路抑制劑ICG-001的膠原/PLCL支架用于尿道成形術以及抑制細胞外基質(ECM)體內體外表達可行性研究，發(fā)現該負載有ICG-001的膠原/PLCL復合支架能夠促進成纖維細胞減少ECM沉積。

3.3D生物打印技術：可以精確設計復雜且個體化的支架[10]。3D生物打印機可以對活細胞、合成聚合物和生物材料進行高分辨率定位控制，從而能精確重現特定的組織微結構。生物打印技術已經顯示出在再生醫(yī)學領域中具有產生各種可移植組織(包括皮膚、軟骨和骨骼)潛在用途。Zhang等[11]一支國際聯(lián)合團隊首次證明3D生物打印技術應用于尿道結構的可行性。

4.細胞片層工程(cell sheet engineering，CSE)自2004年由Oka等[12]提出以來已經頻繁應用于再生醫(yī)學領域，包括腎臟病學和泌尿外科方面。細胞片層是用溫度敏感培養(yǎng)皿制備的：溫敏聚合物聚異丙基丙烯酰胺(poly N-isopropyl acrylamide，PIPAAm)通過共價方式結合到培養(yǎng)皿上，使得多種細胞在37 ℃時黏附和增殖；當溫度降到32 ℃時，不需要水解酶，細胞即會自發(fā)分離。國內傅強教授領導的小組應用細胞片層技術制備組織工程仿生尿道并利用超小型超順磁氧化鐵(ultra small super-paramagnetic iron oxide，USPIO)標記技術進行全層尿道重建。收集少量的口腔和脂肪組織，分離出脂肪干細胞、口腔黏膜上皮細胞和成纖維細胞用于制備細胞片層，然后逐層將細胞片層制成三層管狀組織工程尿道并用USPIO進行標記以供后期使用磁共振成像(MRI)進行檢測。接著將管狀尿道植入皮下3周以促進再血管化和增強生物機械強度。最后進行為期3個月的組織工程仿生尿道替代實驗。組織學實驗結果顯示，取出的仿生尿道仍然具有上皮層、纖維層和肌層的三層結構；免疫熒光分析表明，仿生尿道的血管密度在植入皮下3周后顯著提高，并且3個月后恢復到與植入前正常尿道組織相近。這些結果表明，細胞片層技術具有使三層仿生尿道在結構和功能上接近原始尿道組織的潛力。

二、種子細胞

多種自體細胞經過體外培養(yǎng)和增殖后種植到支架上用于修復損傷和狹窄尿道，這些細胞包括尿道上皮細胞、平滑肌細胞、上皮祖細胞以及從脂肪或骨髓中提取的干細胞等。研究人員已經開發(fā)了幾種細胞種植方案以最大程度優(yōu)化細胞存活，增殖和分化。目前，通過灌注或旋轉生物反應器進行動態(tài)培養(yǎng)的方案優(yōu)于靜態(tài)技術進行細胞種植，因為它們可以更好地模擬生理環(huán)境以促進氧和營養(yǎng)物質的均勻分布，并使細胞承受與生理組織相似的機械力和應力[13]。

1.祖細胞：細胞存在于多種組織類型中，其主要作用是補充因為生理更替、衰老或損傷而丟失的細胞以恢復組織穩(wěn)態(tài)。祖細胞的特征是有限的自我更新能力和單分化潛能，其中常見的有上皮細胞和平滑肌細胞[14]。(1)上皮細胞：上皮細胞包括自體尿道上皮細胞、表皮細胞和口腔角質細胞。一般尿道上皮細胞是從膀胱黏膜取活檢獲取的，常用于尿道和膀胱重建。也有研究人員從膀胱沖洗和尿液中收集尿道上皮細胞。從尿液中收集的細胞特征類似于膀胱細胞并且有望用于尿道組織工程。自體表皮細胞可從陰莖包皮獲取，除非病人已經做了包皮環(huán)切術或其他手術。實驗中將這些細胞接種于脫細胞膠原基質然后植入兔尿道，尿道造影顯示尿道沒有任何狹窄跡象且組織學亦提示移行細胞層?？谇唤琴|細胞如頰黏膜角質細胞和舌黏膜角質細胞也可作為上皮細胞來源。頰黏膜具有非角化復層鱗狀上皮，對機械磨損有更大的耐受彈性。活檢取樣雖然也會造成一定損傷，但和膀胱或尿道黏膜活檢取樣相比損害要小得多。(2)平滑肌細胞：自體平滑肌細胞不僅有助于血管生成和上皮組織成熟，而且還具有改善細胞外基質順應性和組織彈力的潛力。Feng等[15]利用自體舌角質細胞和海綿體平滑肌細胞種植于豬脫細胞海綿體基質形成3D新尿道組織修復尿道缺損。實驗結果表明，種植海綿體平滑肌細胞可促進表皮層生長，改善血管分布以及促進自體平滑肌細胞滲入生物材料使移植物的生物機械性能得到提升。

2.干細胞：干細胞是有自我更新潛力的一類細胞，他們能分化為成熟的非再生細胞或效應細胞[16]。一般來說，干細胞比祖細胞未分化程度低，分化潛力更高，其主要特征是自我更新能力和多分化潛能。干細胞可以作為尿道組織工程或膀胱組織工程的細胞成分來源，尤其是當機體因膀胱疾病或惡性膀胱而無法獲取祖細胞時[17]。盡管有許多研究表明，胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)是可以分化為尿道上皮細胞的，但是出于倫理學顧慮、潛在惡性和細胞管理等問題的考量，胚胎干細胞的應用目前仍然受到限制[18]。由于存在這些限制，研究人員試圖利用成體干細胞(adult stem cells，ASCs)作為替代尿道重建的細胞來源[19]，因為ASC具有促血管生成、抗纖維化和免疫抑制等特性以及在適當條件下分化為所有細胞系的能力。間充質干細胞來源包括骨髓、脂肪組織、肝臟和血液組織等。骨髓干細胞在離體條件或在體條件下均可以分化為尿道上皮和膀胱干細胞。Tian等[20]用共培養(yǎng)和條件培養(yǎng)方案成功將人骨髓間充質干細胞分化為尿道上皮樣細胞和平滑肌樣細胞。該研究小組還證實了幾種關鍵生長因子在共培養(yǎng)中的作用，包括肝細胞生長因子，血小板生長因子B鏈同源二聚體，轉化生長因子和血管內皮生長因子等。然而，獲取骨髓間充質干細胞需通過有創(chuàng)的骨髓穿刺，這也就限制了其臨床應用。相反，脂肪干細胞可以通過吸脂術大量獲取且其分化潛能已經得到廣泛研究。人脂肪干細胞可以通過添加全反式維甲酸或與尿道上皮細胞共培養(yǎng)分化為尿道上皮細胞[21]。Moreno-Manzano等[22]發(fā)現，在植入新膀胱10天后，含有脂肪來源間充質干細胞(ADSC)的基質促進了成熟p63和細胞角蛋白7陽性的尿道上皮顯著恢復。在ADSC基質中，波形蛋白中胚層標志物在黏膜下層有明顯的誘導表達。有趣的是，研究者發(fā)現在橫向和縱向平滑肌層中，ADSC基質中平滑肌肌動蛋白的表達更高。此外，CD31和S100β反應性的分布分別決定了ADSC新膀胱血管化和神經支配的增加。尿源性干細胞的特征包括擁有較長的端粒和較活躍的端粒酶，他們能夠分化成多種細胞系并在細胞膜上表達若干種間充質干細胞標志物[23]。通過適當的方式進行誘導分化，尿源性干細胞可以分化為多種膀胱相關細胞，包括功能性尿道上皮細胞和平滑肌細胞[24]。

三、生長因子

多種生長因子對于組織再生起著重要作用。天然支架如SIS和BAM保留著原有的細胞外基質，即使經過處理也仍然能夠維持其特有分子構成并能表達相應的生長因子，包括TGF-β和VEGF[25-26]。Jia等[27]研究發(fā)現，VEGF修飾的膠原支架對比格犬模型中5cm長尿道缺損的矯正效果。術后6個月，VEGF結合的新尿道相比對照組(沒有結合VEGF的膠原支架)管腔明顯增大，纖維化程度降低且血管化程度增強。除了生長因子外，小分子也常作為添加成分以達到增加支架移植成功率的作用。如，通過調節(jié)TGF-β通路抑制過度纖維化[9]。張楷樂等評估了兔尿道狹窄模型中小分子ICG-001對WNT通路的潛在抑制作用。通過核殼共軸靜電紡絲技術，他們制備了一種Ⅰ型膠原-聚混合尿道支架，且負載有ICG-001分子。在藥物遞送支架釋放的培養(yǎng)基處理后，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和成纖維細胞的纖連蛋白的表達在mRNA水平和蛋白質水平受到顯著抑制。

四、結語

基于細胞和可吸收支架的尿道組織工程在未來較長一段時間內將占有重要地位，異體細胞或許也能成為潛在細胞來源。生物活性細胞因子在組織工程中的作用有限，因為移植細胞可以產生多種細胞因子。組織工程尿道成形術是再生醫(yī)學領域的一種比較切實可行的方法，它可以用真正的組織替代技術來取代傳統(tǒng)的手術組織轉移技術。大規(guī)模臨床研究將有助于提高尿道重建組織工程的安全性和可靠性。