罕見(jiàn)病的基因治療應(yīng)用與展望

桂怡婷 李 強(qiáng) 桂永浩

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院（上海 201102）

罕見(jiàn)病又稱為“孤兒病”，大多病情嚴(yán)重且無(wú)有效治療辦法。80%的罕見(jiàn)病由遺傳變異所引起，多為單基因遺傳病。近年來(lái)，隨著罕見(jiàn)病基因診斷技術(shù)的發(fā)展和CRISPR-Cas9等生物技術(shù)的進(jìn)步，基因治療憑借其“一次性徹底治愈”的特點(diǎn)，成為罕見(jiàn)病治療的重點(diǎn)研究方向之一[1]。本文就近年來(lái)遺傳性罕見(jiàn)病的基因治療現(xiàn)狀、傳統(tǒng)基因遞送技術(shù)和以CRISPR-Cas9為代表的基因編輯技術(shù)在罕見(jiàn)病診斷和治療中的應(yīng)用及發(fā)展作一介紹，以期為將來(lái)的生物技術(shù)改進(jìn)和將基因治療應(yīng)用于更多的罕見(jiàn)病治療提供參考。

1 罕見(jiàn)病概述

罕見(jiàn)病是相對(duì)常見(jiàn)病而提出的對(duì)一大類疾病的統(tǒng)稱，其具體定義全球尚未統(tǒng)一。歐盟對(duì)罕見(jiàn)病的定義是，危及生命或慢性漸進(jìn)性疾病，患病率低于1/2000，需要特殊手段干預(yù)的疾病。美國(guó)2002年將罕見(jiàn)病定義為，在美國(guó)患者數(shù)低于20 萬(wàn)人的疾病。2010年5 月，中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分會(huì)在上海召開(kāi)研討會(huì)，與會(huì)專家對(duì)中國(guó)罕見(jiàn)病定義達(dá)成共識(shí)，在中國(guó)的患病率低于1/500 000 或新生兒發(fā)病率低于1/10000的疾病可稱為罕見(jiàn)病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已確認(rèn)的罕見(jiàn)病大約有7 000種，全球約有4億人受到罕見(jiàn)病的影響。我國(guó)大約有1 680萬(wàn)罕見(jiàn)病患者，每年新出生超過(guò)20萬(wàn)人[2]。

罕見(jiàn)病類型較多，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，具有下列特點(diǎn)：①單一病種發(fā)病率和患病率低，但總體基數(shù)大；②約80%由遺傳缺陷引起，50%～75%于兒童期起病[3]；③累及多系統(tǒng)，且病情嚴(yán)重，占嬰兒死亡原因的35%[3]；④臨床表現(xiàn)復(fù)雜，診斷困難，誤診率較高，確診周期可長(zhǎng)達(dá)5～30年[1]；⑤約5%的罕見(jiàn)病有治療措施，不到1%有藥可治，但費(fèi)用高昂。

目前，罕見(jiàn)病的難診難治問(wèn)題已引起全球的重視。2017 年，國(guó)際罕見(jiàn)病研究聯(lián)盟表示，在2027 年前實(shí)現(xiàn)所有罕見(jiàn)病患者在就醫(yī)后一年內(nèi)得到有效診斷和治療[4]。我國(guó)在2018年公布《第一批罕見(jiàn)病名錄》，共收錄121 種罕見(jiàn)病，并在次年發(fā)布《罕見(jiàn)病診療指南》。截至2017 年1 月，美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市了450種罕見(jiàn)病用藥，涵蓋491種適應(yīng)證[5]。

2 基因治療策略

基因治療是一種通過(guò)改變?nèi)祟惢騺?lái)治療和預(yù)防疾病的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在治療遺傳性疾病、腫瘤和某些 病毒感染性疾病中顯示出較好的臨床前景?；蚓?輯技術(shù)的興起拓寬了基因治療在疾病中的應(yīng)用，根據(jù)疾病特點(diǎn)選擇不同的基因治療策略是基因治療的關(guān)鍵。

2.1 基因遞送技術(shù)

利用合適的病毒載體使目的基因在體內(nèi)以最小不良反應(yīng)的劑量穩(wěn)定表達(dá)的同時(shí)，達(dá)到緩解疾病癥狀的效果，是現(xiàn)今基因治療的目標(biāo)[6]。按治療途徑可將基因治療劃分為，體內(nèi)和體外兩種。體外基因治療是指將患者自體細(xì)胞在體外轉(zhuǎn)入目的基因后回輸體內(nèi)的過(guò)程，多運(yùn)用整合型病毒載體（如慢病毒）將目的基因整合至細(xì)胞基因組使其在所有子代細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)[6]。體內(nèi)基因治療則指以局部注射的方式，將目的基因遞送至體內(nèi)，多運(yùn)用非整合型病毒載體（如腺相關(guān)病毒）使目的基因穩(wěn)定存在于胞質(zhì)中，在細(xì)胞生存期內(nèi)表達(dá)[6]。

反轉(zhuǎn)錄病毒和腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是近年來(lái)基因治療中使用較多的病毒載體。慢病毒作為一種特殊的反轉(zhuǎn)錄病毒，可以裝載大至8 kb的目的基因，在整合人類基因組時(shí)比γ 反轉(zhuǎn)錄病毒安全性更高，尤其對(duì)G0和G1期的造血干細(xì)胞具有很高的轉(zhuǎn)染效率[6]，然而，成為現(xiàn)今向造血干細(xì)胞遞送基因的常用工具[1]。不同血清型的AAV 可較特異地感染肝臟、視網(wǎng)膜、肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等不同組織，包裝基因序列長(zhǎng)度一般不超過(guò)5 kb，超過(guò)時(shí)效率驟然下降[1]。

2.2 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)

與病毒載體遞送基因（基因添加）不同，基因編輯可實(shí)現(xiàn)DNA 單個(gè)堿基的精準(zhǔn)校正，介導(dǎo)基因添加、基因消融、基因校正等多種修飾[1]。簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）相關(guān)Cas酶系統(tǒng) 是原核生物針對(duì)外來(lái)核酸特有的獲得性免疫系統(tǒng)[7]?；撔枣溓蚓腃RISPR-Cas 9 系統(tǒng)最先重編程并用于構(gòu)建 基因編輯核酸酶平臺(tái)[8]，開(kāi)啟了繼鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶 （transcription activator-like effector nucleases，TALEN）之后的第三代基因編輯技術(shù)的研究熱潮。

與ZFN 和TALEN 不同，CRISPR-Cas 9 基因編輯技術(shù)依賴于核酸的堿基配對(duì)，而非蛋白質(zhì)DNA 識(shí)別[9]。其中，定制的向?qū)NA（guide RNA，gRNA）中末端20 bp 的特異性序列與靶DNA 結(jié)合，指引Cas 9內(nèi)切酶切割DNA 雙鏈中原間隔子相鄰基序（PAM 序列5’-NGG-3’）上游的第三個(gè)堿基[8,10]。真核生物主要采用非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修復(fù)斷裂的DNA 雙鏈，可使目的基因隱產(chǎn)生插入或缺失突變而失活[1]。為克服這一缺陷，基因治療可利用病毒載體或裸露DNA分子引入同源性DNA修復(fù)模板[6]，可使細(xì)胞依照模板鏈修復(fù)點(diǎn)突變或者插入較長(zhǎng)的DNA 片段[11]，產(chǎn)生同源性定向修復(fù)（homology directed repair，HDR），介導(dǎo)基因敲除、敲入、沉默。

3 罕見(jiàn)病基因治療研究進(jìn)展

2012 年，歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）批準(zhǔn)首個(gè)基因治療藥物——Glybera，治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥（可導(dǎo)致嚴(yán)重的胰腺炎）。截至2019年，F(xiàn)DA和EMA共批準(zhǔn)6項(xiàng)罕見(jiàn)病基因治療藥物，可分別治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥、腺苷缺乏型重癥聯(lián)合免疫缺陷、RPE65型視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、β地中海貧血、帕金森病和脊髓性肌萎縮。

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)憑借其“精確校正突變位點(diǎn)”的優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)基因遞送技術(shù)中病毒載體的包裝限制，成為罕見(jiàn)病基因治療的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，基因治療的安全性和有效性得到提升，在多種遺傳性罕見(jiàn)病，如血友病[12]、囊性纖維化[13]、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）[14]、重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency,SCID）[15]的治療中取得突破成果。

3.1 血液及免疫系統(tǒng)疾病

憑借慢病毒載體對(duì)造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，基因治療已成功在 10種、200余例血液系統(tǒng)疾?。òㄑt蛋白病、原發(fā)性免疫缺陷和代謝性疾?。6,16]的治療中取得進(jìn)展。

SCID 是一種免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能嚴(yán)重缺陷性疾病，患兒易患重癥感染而危及生命[16]。為治療由編碼白介素2 受體γ 亞基（interleukin 2 receptor subunit gamma，IL 2 RG）基因變異所致的X 連鎖型SCID（SCID-X1），2019年研究人員使用cDNA兩端均帶有sgRNA結(jié)合序列的優(yōu)化型IL2RG基因，用AAV6將其導(dǎo)入人CD34+HSPCs中，實(shí)現(xiàn)了在內(nèi)源性起始密碼子后的功能性插入，暫無(wú)脫靶效應(yīng)和移植后不良反應(yīng)，突破了早期臨床試驗(yàn)使用反轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)T細(xì)胞白血病的巨大風(fēng)險(xiǎn)[15]。

在最近的2項(xiàng)關(guān)于基因治療鐮刀型紅細(xì)胞貧血臨床試驗(yàn)中[17-18]，βA-T87Q-珠蛋白基因治療β地中海貧血的安全性和臨床治療效果得到顯著提高，得到EMA批準(zhǔn)用于治療12 歲或以上的非β0/β0 基因型的輸血依賴β地中海貧血[17]。這種成功的治療方法可以擴(kuò)展到治療濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征（Wiskott-Aldrich syndrome，WAS）、X連鎖慢性肉芽腫?。╔-linked chronic granulomatous disease，X-CGD）等更多的免疫系統(tǒng)疾病[19-20]。

3.2 溶酶體貯積癥

溶酶體貯積癥（lysosomal storage disorders，LSD）是由于基因變異導(dǎo)致溶酶體內(nèi)酸性水解酶缺陷所致的遺傳代謝性疾病，約有50余種，病情嚴(yán)重，多無(wú)有效治療辦法，臨床上主要通過(guò)產(chǎn)前診斷加以預(yù)防[21]。異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（metachromatic leukodystrophy，MLD）是溶酶體病中最常見(jiàn)的類型，由芳基硫酸酯酶A（arylsulfatase A，ARSA）缺陷所致，病變主要累及腦白質(zhì)和周圍神經(jīng)。目前，研究人員正嘗試將HSCs基因治療與遞送功能酶腦內(nèi)結(jié)合，提高對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的治療效力[16]。研究顯示，將表達(dá)治療性ARSA基因的慢病毒載體導(dǎo)入HSCs 再將其注入小鼠腦室中，比標(biāo)準(zhǔn)靜脈注射途徑獲得了更高的ARSA腦表達(dá)量[21]。在一項(xiàng)MLD的臨床試驗(yàn)中，9例患者在中位隨訪期時(shí)均獲得了造血重建、基因校正細(xì)胞穩(wěn)定植入、且腦脊液中ARSA 活性同治療6 個(gè)月時(shí)效果一樣好[22]，這種方法可能使更多的LSD患者受益[16]。

3.3 肝臟疾病

利用靶向肝臟的AAV病毒遞送目的基因，可治療因基因缺陷導(dǎo)致的肝臟代謝障礙。血友病是凝血酶缺乏所導(dǎo)致的出血性疾病，靜脈注射編碼FIX的AAV 8病毒至患者體內(nèi)，可明顯提高凝血因子水平，減輕血友病B 患者的出血癥狀。優(yōu)化的FIX基因變體可使FIX的活性水平提升至30%[12]。然而對(duì)于致病基因F8的cDNA 太大的血友病A，最新臨床試驗(yàn)采用AAV 5遞送截短型Ⅷ因子的cDNA[23]，同樣達(dá)到了很好的效果，增加糖皮質(zhì)激素的劑量和療程可以降低對(duì)AAV衣 殼產(chǎn)生的延遲免疫排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)FIX的表達(dá)時(shí)間[24-25]。

除血友病外，不少肝臟代謝性疾病的基因治療在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得較好的結(jié)果。2018年，研究顯示，在疾病發(fā)病早期階段進(jìn)行基因治療，有望減少肝豆?fàn)詈俗冃裕╓ilson disease，WD）的肝臟損傷和糾正其銅代謝異常[26]。同年，對(duì)糖原貯積病Ⅰa型（glycogen storage disease type Ⅰa，GSD-Ⅰa）的狗動(dòng)物模型的基因治療，改善了存活率，證實(shí)基因治療GSD-Ⅰa的安全性和有效性[27]。

3.4 視網(wǎng)膜及視神經(jīng)疾病

生理狀態(tài)下，視網(wǎng)膜處于一種免疫赦免狀態(tài)，因此采用視網(wǎng)膜下注射AAV 的方式局部遞送目的基因入細(xì)胞，可有效避免抗原誘發(fā)的炎癥免疫反應(yīng)，是基因治療視網(wǎng)膜及視神經(jīng)疾病的一大優(yōu)勢(shì)[28-30]。2017年，基因治療藥物L(fēng)uxturna 上市，可治療由RPE65變異所致的2 型雷伯氏先天性黑朦癥（Leber congenital amaurosis，LCA）。LCA 患兒在出生后即出現(xiàn)嚴(yán)重的視力喪失直至失明[28]。然而，10 型LCA 的致病基因CEP 290編碼序列長(zhǎng)達(dá)7.5 kb，正?；蚩截惓鯝AV 病毒的包載能力，無(wú)法用同等方式的基因治療。于是研究者利用CRISPR-Cas 9 基因編輯原理，通過(guò)AAV5載體將saCas9和CEP290特異性gRNA遞送至感光細(xì)胞，直接將變異內(nèi)含子區(qū)域整體刪除或倒位，恢復(fù)了CEP290基因的正常表達(dá)[30]。

3.5 神經(jīng)肌肉疾病

I型脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）是SMN1基因異常所致的新生兒急性致命性神經(jīng)肌肉疾病。現(xiàn)主要有兩種基因治療辦法，其一是利用可穿越血腦屏障的AAV9載體，以靜脈注射的方式將攜帶的SMN1基因遞送給SMA嬰幼兒，受試患兒的生存時(shí)間大大延長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)功能也得到改善[31]。其二是鞘內(nèi)注射反義核苷酸藥物Nusinersen，通過(guò)調(diào)節(jié)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的SMN 2基因選擇性剪接代償SMN 1基因缺失，該療法徹底改變了兒童期SMA的傳統(tǒng)治療[1]，顯示出較好的臨床前景[32]。

CRISPR-Cas 9 基因編輯技術(shù)的成功運(yùn)用使得因致病基因過(guò)大超過(guò)載體承載范圍而無(wú)法運(yùn)用傳統(tǒng)基因遞送方式治療的疾病取得進(jìn)展——先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良1A型（congenital muscular dystrophy type 1A，MDC 1 A）和DMD。2019 年7 月，加拿大多倫多兒童病醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)使用于JCRISPR-dCas9技術(shù)，通過(guò)AAV 9 將dCas 9、VP 64 轉(zhuǎn)錄激活子和靶向LAMA 1 啟動(dòng)子的gRNA 遞送至MDC 1 A 疾病模型小鼠體內(nèi)，上調(diào)LAMA 1基因表達(dá)，幫助MDC 1 A 動(dòng)物模型小鼠恢復(fù)部分肌肉功能[33]。同樣的，使用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生縮短版的抗肌萎縮蛋白，DMD 動(dòng)物模型鼠在注射后長(zhǎng)達(dá)1 年的時(shí)間內(nèi)維持抗肌萎縮蛋白的表達(dá)，且無(wú)神經(jīng)毒性，進(jìn)一步確定了永久性基因校正治療可行性[14]。

4 展望

隨著對(duì)病毒載體安全性和有效性的提升以及CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，基因治療已在較多遺傳性疾病中取得突破進(jìn)展，為罕見(jiàn)病患者帶來(lái)了曙光。然而，基因治療技術(shù)仍存在較大的改進(jìn)空間，如免疫排斥、gRNA的識(shí)別范圍、插入誘變和脫靶效應(yīng)誘發(fā)的基因毒性等，多項(xiàng)研究正致力于解決問(wèn)題使其獲得更高的效率、特異性和安全性。

整合型載體會(huì)面臨隨機(jī)整合目的基因所致的插入誘變風(fēng)險(xiǎn)，誘發(fā)白血病或?qū)嶓w瘤等疾病的發(fā)生[34]，需要使用更安全的載體加以避免[6]。與此同時(shí)，輔助免疫調(diào)節(jié)藥物可減輕體內(nèi)基因治療時(shí)載體誘發(fā)的免疫排斥反應(yīng)[1]。相較于非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ），同源性定向修復(fù)（homology directed repair，HDR）的效率較低，不少研究正致力于提高其修復(fù)效率，產(chǎn)生更精確的基因組編輯[35]。為改進(jìn)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，提高PAM序列對(duì)SpCas 9 切割位點(diǎn)的局限性，增大應(yīng)用范圍，研究人員成功改造出了識(shí)別5’-N 20-NGG[6]、NG、5'-GAA 和5'-GAT 等擴(kuò)展的PAM 序列[36]，擴(kuò)大了原有3 個(gè)堿基的局限性。此外，研究者設(shè)計(jì)了單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）[37]，較之前具有更好的體內(nèi)穩(wěn)定性和識(shí)別效率，且免疫原性減低。在脫靶問(wèn)題上，提高核酸酶的特異性至關(guān)重要，研究者在sgRNA的5’末端加上了設(shè)計(jì)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin），形成的hp-sgRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可提供空間和能量屏障，減少了sgRNA與脫靶位點(diǎn)的結(jié)合[38]。

近年來(lái)，發(fā)展的堿基編輯器（base editor）系統(tǒng)，不依賴于DNA 修復(fù)模板即可誘導(dǎo)從C 到T 或從G 到A的靶向轉(zhuǎn)變，在不產(chǎn)生雙鏈斷裂的情況下單堿基編輯[39]。研究者開(kāi)發(fā)了CRISPR-Cas相關(guān)堿基編輯器，并用AAV病毒載體靜脈注射將其遞送至小鼠體內(nèi)，成功在體內(nèi)校正Pahenu2基因，使苯丙酮尿癥小鼠的癥狀得到了改善[40]，為未來(lái)實(shí)現(xiàn)更多疾病的體內(nèi)基因治療提供了方向。

綜上所述，罕見(jiàn)病的基因治療研究成果大大增加。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用使原有因致病基因過(guò)大超出病毒載體的包裝限制而不能運(yùn)用基因遞送方法治療的疾病得到了突破性進(jìn)展，對(duì)腦部等技術(shù)操作高難度組織的基因治療研究也取得突破。但是，要想將基因治療應(yīng)用至臨床治療更多更廣泛的遺傳性罕見(jiàn)病，還需解決諸多問(wèn)題，如改善整合基因載體和脫靶效應(yīng)帶來(lái)的遺傳毒性、控制靶基因體內(nèi)的表達(dá)量維持在有效治療疾病水平、解決倫理問(wèn)題和高昂的治療費(fèi)用等。此外，罕見(jiàn)病病種復(fù)雜，分型較多，眾多病情嚴(yán)重的罕見(jiàn)病亟待尋找更有效的治療辦法，罕見(jiàn)病的基因治療在未來(lái)依然存在很大的研究空間。隨著研究的逐漸深入和問(wèn)題不斷解決，可期待不久的將來(lái)基因治療在遺傳性罕見(jiàn)病的應(yīng)用定會(huì)不斷取得突破，為眾多罕見(jiàn)病患者帶來(lái)福音。