川崎病診斷相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展

王 亮 司 萍綜述 沈永明審校

天津市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科（天津 300074）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種常見的兒童全身性血管炎綜合征，多見于5 歲以下嬰幼兒，目前發(fā)病率最高的是日本、韓國和臺(tái)灣[1]。KD 的典型臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、皮疹、黏膜炎以及心血管損傷等冠狀動(dòng)脈損傷（coronary artery lesions，CAL）。KD 可累及冠狀動(dòng)脈，引起冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、心肌炎、血栓形成，若得不到及時(shí)治療，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。目前KD 的診斷主要依據(jù)臨床癥狀，但易與其他一些兒童自愈性疾病相混淆，包括麻疹、腺病毒感染、猩紅熱、登革熱。如果KD 的臨床表現(xiàn)不明顯，特別是不完全性KD，容易發(fā)生漏檢。靜脈注射丙種球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）已成為指南推薦的KD治療 首選方案，但大約10%～20%的患兒在單次IVIG 后無反應(yīng)，而IVIG無反應(yīng)型KD發(fā)生CAL的風(fēng)險(xiǎn)更 高[2]。目前KD病因尚不清楚，普遍認(rèn)為與感染、免疫，細(xì)胞因子損傷及遺傳易感性等多種因素相關(guān)。本文重點(diǎn)介紹KD 診斷相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀，并敘述其在疾病診斷和評(píng)估疾病嚴(yán)重程度中的作用。

1 炎癥標(biāo)志物

KD 患者的炎癥標(biāo)志物水平隨疾病進(jìn)展發(fā)生變化。研究報(bào)道，KD急性期患者的紅細(xì)胞沉降率、血小板數(shù)升高，并且急性期有白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)增多，其程度與心功能不全有關(guān)[3]。C反應(yīng)蛋白作為炎癥標(biāo)志物，與KD疾病嚴(yán)重程度和CAL的發(fā)展也有顯著關(guān)系。KD患兒處于急性期時(shí)C反應(yīng)蛋白顯著升高，當(dāng)炎癥得到控制后其含量又會(huì)降低，有可能作為疾病治療和預(yù)后觀察的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素原水平在KD急性期升高，并且IVIG無反應(yīng)型KD患兒升高更加明顯[4]。外周血嗜酸性粒細(xì)胞增多和低白蛋白與 IVIG無反應(yīng)以及冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[5-6]。平均血小板體積、血小板分布寬度降低和血小板衍生微 粒已被證明是KD急性期血小板活化和炎癥的標(biāo)志[7-8]。炎癥標(biāo)志物在很大程度上是非特異性的，因?yàn)檫@些標(biāo)志物在許多其他炎癥和感染條件下也會(huì)升高。這些生物標(biāo)志物可以反映KD 機(jī)體持續(xù)的炎癥狀態(tài)，但在作出明確診斷方面仍作用有限。

2 免疫標(biāo)志物

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）作為最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁，其細(xì)胞數(shù)的動(dòng)態(tài)變化會(huì)引起機(jī)體免疫狀態(tài)變化。研究報(bào)道，在KD急性期外周血中髓細(xì)胞型DCs水平升高，而漿細(xì)胞型DCs 升高不明顯[9]，這提示KD 患兒可能存在免疫耐受。KD急性期CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少，但早期T細(xì)胞活化標(biāo)志CD8+CD69+T細(xì)胞增加，晚期T細(xì)胞活化標(biāo)志CD 8+HLA-DR+T 細(xì)胞未見明顯增加，CD8+CD69+T細(xì)胞可作為病情進(jìn)展的指標(biāo)[10]。KD動(dòng)物模型的冠狀動(dòng)脈免疫組織化學(xué)研究表明，CD8+T細(xì)胞存在于受損的冠狀動(dòng)脈內(nèi)，并且與炎癥性血管炎有關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞活化和抑制失衡可能與KD發(fā)病機(jī)制相關(guān)，IVIG抑制CD8+T細(xì)胞的活化，但CD8+T細(xì)胞的過度激活可能引起IVIG無反應(yīng)，CD8+HLA-DR+T細(xì)胞/CD8+CD69+T細(xì)胞比值可作為預(yù)測(cè)IVIG 敏感性的指標(biāo)[12]。急性期KD 患兒存在明顯的輔助性T 細(xì)胞17(Th 17)和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）失衡[13]，Th17比例上調(diào)，而Treg比例下調(diào)。這些結(jié)果提示KD患者機(jī)體存在免疫系統(tǒng)失衡，特別是CD8相關(guān)免疫系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂。

近年來，關(guān)于KD 急性期的促炎和抗炎細(xì)胞因子的研究多有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中細(xì)胞因子IL-17，IL-23以及Th1/Th2細(xì)胞因子，包括IFNγ、IL-10、IL-6、IL-4 在KD 急性期均有升高[13-14]，并且血漿中Th1/Th2 細(xì)胞因子可用于疾病診斷和治療效果評(píng)價(jià)。血管內(nèi)皮生長因子、IL-6是KD發(fā)生CAL的重要危險(xiǎn)因素[15]。急性期KD 患兒sCD 40 L、E-選擇素、CCL 23、CXCL 10 表達(dá)均高于對(duì)照組[16]。腫瘤壞死因子（TNF-α）在招募炎癥細(xì)胞到冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮的過程以及CAL發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前TNF-α阻斷劑應(yīng)用于KD的治療也得到廣泛研究[17]。這些研究可以為KD 疾病診斷提供生物標(biāo)記物，同時(shí)也提示KD 機(jī)體存在某些級(jí)聯(lián)反應(yīng)，由于機(jī)體免疫功能異常，可能導(dǎo)致KD急性期的炎癥上調(diào)以及IVIG無反應(yīng)。

3 蛋白標(biāo)志物

3.1 氨基末端腦鈉肽前體

氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）是一種無生物活性的肽段，是由心室肌細(xì)胞分泌的腦鈉肽前體降解而成的，是心肌細(xì)胞應(yīng)激的標(biāo)志。急性期KD 患兒存在心肌損害，因此NT-proBNP 作為一種潛在的生物標(biāo)志物得 到廣泛研究。Meta分析發(fā)現(xiàn)，NT-proBNP截?cái)嘀禐?90 pg/mL和260 pg/mL時(shí)，診斷KD的靈敏度為89%和93%，特異度為0.69和0.88[18]。而NT-proBNP截?cái)嘀禐? 300 pg/mL，診斷KD患兒CAL的靈敏度和特異度分別為95%和85%，NT-proBNP截?cái)嘀禐?00 pg/mL，診斷KD 患兒IVIG 無反應(yīng)的靈敏度和特異度分別為71%和62%[19]。NT-proBNP截?cái)嘀禐?025 pg/mL，診斷急性期KD 靈敏度為88%，特異度為96%[20]。根據(jù)患兒年齡不同而設(shè)定不同的NT-proBNP 界值，發(fā)現(xiàn)NT-proBNP 在不同年齡段中診斷的特異度和靈敏度存在差異[21]。但目前對(duì)依據(jù)年齡來確定界值仍存在爭(zhēng)議，因?yàn)檠錘T-proBNP 水平存在一定的年齡依賴性，一般在嬰幼兒期最高，之后降低。此外應(yīng)用NTproBNP診斷KD時(shí)，必須首先排除其他心臟疾病的存在，因?yàn)槠渌呐K疾病患者中也存在NT-proBNP水平增加[22]。

3.2 其他KD相關(guān)蛋白標(biāo)志物

凝血酶致敏蛋白（thrombospondin，TSP）是首次從凝血酶刺激后的血小板細(xì)胞膜中分離的糖蛋白，但此后研究證實(shí)，體內(nèi)多種細(xì)胞均可產(chǎn)生TSP。TSP包含5種亞型，其中TSP-2與KD關(guān)系得到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，KD急性期血漿TSP-2水平明顯升高，而在IVIG無反應(yīng)型KD 患兒血漿中TSP 水平更高。當(dāng)TSP-2 的截?cái)嘀禐?1.50 ng/mL時(shí)，其預(yù)測(cè)IVIG無反應(yīng)的靈敏度為82.35%，特異性度64.81%[23]。骨膜蛋白（periostin）是一種調(diào)節(jié)心血管損傷反應(yīng)的基質(zhì)細(xì)胞蛋白，與其他發(fā)熱患兒相比，KD 急性期和慢性期患兒冠狀動(dòng)脈中骨膜蛋白含量增加[24]?？扇苄陨L刺激表達(dá)基因2蛋白（suppression of tumorigenicity-2，ST2）主要以2種亞型存在，跨膜或細(xì)胞形式的ST2（ST2L）以及可溶性或循環(huán)形式的ST2（sST2），可反映心血管應(yīng)激和心肌纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，sST2在KD急性期升高，其水平與心肌舒張功能受損有關(guān)；此外KD急性期患兒心肌肌鈣蛋白I 水平顯著升高，提示心肌細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞死亡與急性期KD患兒的心肌炎癥有關(guān)[25]。研究發(fā)現(xiàn)，KD急性期患兒體內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（nitric oxide synthases，iNOS）、硫化氫（H2S）水平較對(duì)照組明顯升高，但有CAL的KD患兒的iNOS表達(dá)水平明顯高于無CAL的KD患兒，而H2S與之相反，聯(lián)合應(yīng)用i-NOS（＞10 U/mL）和H2S（＜3.31 μmol/L）預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張的靈敏度為80%，特異度為81%，因此有可能用于指導(dǎo)臨床治療，預(yù)防CAL的發(fā)生[26]。簇蛋白（clusterin）是高密度脂蛋白的一部分，對(duì)于維持冠狀動(dòng)脈壁的完整性發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，KD患兒血漿簇蛋白＜12 mg/L與CAL發(fā)生發(fā)展相關(guān)[27]。細(xì)胞粘合素C（tenascin-C，TN-C）是近年來發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)胞外基質(zhì)成分之一，是組織損傷和炎癥的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，KD急性期TN-C表達(dá)水平與心血管炎癥程度相關(guān)[28]。

目前已知報(bào)道的KD相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物仍處于早期發(fā)現(xiàn)階段，并且大多數(shù)研究結(jié)果是建立在單個(gè)中心的小樣本研究對(duì)象之上，需要在更大的人群進(jìn)行驗(yàn)證，才能將其應(yīng)用于臨床。此外NT-proBNP被認(rèn)為是可進(jìn)行床旁KD 診斷的理想指標(biāo)。但KD 可能與其他伴有心功能障礙的發(fā)熱疾病相混淆。因此NT-proBNP用于KD診斷時(shí)，必須首先排除其他心臟相關(guān)疾病。

4 KD易感基因

日本、韓國和中國臺(tái)灣的KD 的發(fā)病率高于西方國家。這種差異提示遺傳易感性，或反映環(huán)境或生活方式的差異。同時(shí)，亞洲人群中KD 患兒的同胞和有過KD病史的父母的后代的KD發(fā)病率分別是普通人群的6～10倍和2倍[29]。研究發(fā)現(xiàn)，在夏威夷定居的日本裔美國人中，KD 的發(fā)病率與日本本地的發(fā)病率相當(dāng)，進(jìn)一步指向KD 可能的遺傳關(guān)聯(lián)[30]。因此KD 可能是一種多基因復(fù)雜性疾病，隨著與KD 相關(guān)的易感基因的研究，為KD的診斷提供了新的方向。

4.1 CD40基因

CD40是相對(duì)分子量質(zhì)量48 000的細(xì)胞表面受體，其基因定位于20 q 11，屬神經(jīng)生長因子受體/腫瘤壞死因子受體超家族。CD 40-CD 40 L 配基化參與炎癥反應(yīng)過程。與發(fā)熱對(duì)照組相比，KD 患兒CD 4+T 細(xì)胞上CD 40配體的表達(dá)水平較高。這種過度表達(dá)在IVIG治療后下降[31]，這意味著CD 40-CD 40 L 相互作用可能參與KD 的冠脈炎癥改變。目前CD 40基因是與KD發(fā)生相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究（genome-wide association study，GWAS）連鎖的基因位點(diǎn)之一。GWAS分析顯示，CD 40的功能性單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（ainge nucleotide polymorphisms，SNP）與KD的發(fā)病相關(guān)，其中漢族人群中發(fā)現(xiàn)CD 40基因SNP 位點(diǎn)（rs 4813003、rs1535045）與KD的易感性相關(guān)[32]。

4.2 1,4,5 三磷酸肌醇3 激酶C（inositol 1,4,5-triphosphate 3-kinase C，ITPKC） 基因

ITPKC基因定位于19q13.2，是Ca2+/NFAT信號(hào)通路的第二信使分子，在免疫活化和T 細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。ITPKC多態(tài)性影響T細(xì)胞活化，可能導(dǎo)致炎癥性T 細(xì)胞在急性期持續(xù)作用。GWAS 分析顯示，ITPKC基因的單核苷酸多態(tài)性與KD 易感性相關(guān)，ITPKC基因功能性SNP rs 28493229的C等位基因可能增加KD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[33]。ITPKC中的SNP rs7251246與KD嚴(yán)重程度相關(guān)，并與CAL發(fā)生有顯著關(guān)聯(lián)[34]。然而，也有研究報(bào)道，ITPKC基因功能性SNP rs28493229與臺(tái)灣地區(qū)KD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間沒有顯著關(guān)聯(lián)[35]。

4.3 Fcγ受體ⅡA基因

Fcγ 受體ⅡA（Fc fragment of IgG receptor 2 A，F(xiàn)CGR2A）基因定位于人類染色體1q22-23，其編碼的Fc段受體主要表達(dá)于免疫細(xì)胞膜表面，其多態(tài)性可以改變FcγRⅡa與lgG的結(jié)合力。研究發(fā)現(xiàn)，KD急性期患兒FCGR2A mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組[36]。GWAS分析顯示，F(xiàn)CGR 2 A基因與KD 易感性相關(guān)，其中FCGR 2 A基因SNP rs 1801274 與KD 易感性相關(guān)。此外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CGR2A基因SNP rsl801274與男性KD顯著相關(guān)，而與女性相關(guān)性并不明顯，這也可以進(jìn)一步解釋男性KD 發(fā)病率高于女性[37]。此外，F(xiàn)CGR 2 A基因H131R多態(tài)性可能與亞洲人的KD易感性有關(guān)[38]。

4.4 其他KD相關(guān)易感基因

除上述研究較廣泛的KD 易感性相關(guān)基因外，一些其他基因也引起研究者的關(guān)注。CASP 3基因定位于人類染色體4 q 35，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。已知報(bào)道CASP3基因SNP rs 72689236與KD易感性相關(guān)[39]。而ITPKC基因SNP rs28493229以及CASP3基因SNP rs113420705與IVIG無反應(yīng)和CAL風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[40]。TGF-β 信號(hào)通路在炎癥、T 細(xì)胞活化和組織重塑中發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道，KD 患兒TGF-BR 2 mRNA表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組[41]。TGF-BR 2基因SNP rs6550004與KD易感性相關(guān)，SNP rs1495592與CAL相關(guān)[42]。B淋巴酪氨酸激酶（B lymphoid tyrosine kinase，BLK）在B細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。研究報(bào)道，朝鮮族人群中BLK基因SNP rs6993775與KD易感性相關(guān)[43]。人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）主要存在于細(xì)胞膜表面。近期研究發(fā)現(xiàn)，HLA相關(guān)基因（HLA-CSNP rs9380242，HLA-BSNP rs9378199，MICA SNPrs9266669 和HCP5SNP rs6938467 ）與KD易感性顯著相關(guān)[44]。

綜上，目前關(guān)于KD 診斷相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物的研究取得了顯著進(jìn)展。炎癥標(biāo)志物可以幫助用于KD的臨床診斷，但這些標(biāo)志物對(duì)KD 的診斷特異性較低。蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)確定了一些與KD相關(guān)的蛋白生物標(biāo)志物，但這些生物標(biāo)記物仍需進(jìn)一步開展多中心大樣本臨床研究才能用于診斷KD。全基因組關(guān)聯(lián)研究為KD 診斷提供新的研究方向，但研究處于發(fā)展的早期階段，需要在不同人群中進(jìn)行大規(guī)模驗(yàn)證，尚不足以作為KD 診斷的標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于研究KD 的發(fā)病機(jī)制以及精準(zhǔn)治療提供新的思路。