骨髓來源細(xì)胞在眼部新生血管形成中的研究進(jìn)展

呂 洋,蔣 華,曹 虹，曹 娟,李 靜,劉占宏，李 紅

眼部新生血管常導(dǎo)致嚴(yán)重視力喪失[1-2]。近年來，有研究表明除原位細(xì)胞，骨髓來源細(xì)胞(bone marrow derived cells， BMCs)對(duì)眼部新生血管的形成有重要作用[3]。BMCs參與眼部新生血管的機(jī)制非常復(fù)雜，通過多種因素刺激、多種細(xì)胞和因子參與以及多條信號(hào)通路調(diào)控。本文總結(jié)已知BMCs在眼部新生血管，尤其是在角膜新生血管、視網(wǎng)膜新生血管和脈絡(luò)新生血管中的作用和主要機(jī)制，以及影響B(tài)MCs作用的風(fēng)險(xiǎn)因素，綜述如下。

1BMCs和眼部新生血管

眾所周知，新生血管形成包括2個(gè)主要方式：血管發(fā)生和血管生成[4]。大量實(shí)驗(yàn)室研究表明，BMCs可分化為多種干細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，在角膜、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中發(fā)揮重要作用[5]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial precursor cells， EPCs)、造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells， HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSCs)[4]可分化成血管成分[血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)、周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells， ECs)]以及血管外細(xì)胞[肌成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial， RPE)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞][3]。除干細(xì)胞之外，骨髓(bone marrow， BM)來源的單核巨噬細(xì)胞可分泌多種血管生成因子刺激基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal derived factor 1， SDF-1)在RPE細(xì)胞的表達(dá)，參與BMCs遷移及黏附到局部缺血或損傷的組織[5]。提示BMCs不僅可特異性地在眼部新生血管處聚集、增殖和分化為多種細(xì)胞等構(gòu)成血管壁的成分，而且還可分泌多種促血管生成因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor， TGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)等參與新生血管的生成[1,5]。

1.1BMCs和角膜新生血管(corneal neovascularization， CV) 角膜是無血管組織，一些炎癥性疾病、傳染性疾病和外傷被認(rèn)為與CV有關(guān)，CV可通過不同的方法人工誘導(dǎo)，如輔助手術(shù)致術(shù)源性角膜損傷新生血管形成和堿燒傷誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性CV等[6]。有研究顯示炎癥性CV的老鼠模型中，CD11b陽(yáng)性的BMCs參與基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)的裂解，引起該處血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells， VEC)分裂增殖形成幼芽，繼而生成新生血管。提示BMCs參與炎癥性CV[7]。此外，將bFGF的緩釋劑植入角膜板層囊袋中，也可以誘導(dǎo)CV。CV中>90%的BMCs分化的周細(xì)胞可表達(dá)CD45和CD11b[6-7]。另有研究顯示17.7%的VEC和53%的周細(xì)胞是源于CV中的BMCs，而BMCs在CV初始階段即到達(dá)新生血管處。提示BMCs在CV早期就起到關(guān)鍵作用，如果在早期進(jìn)行干預(yù)，那么對(duì)于CV的預(yù)后將起到重要作用。

1.2BMCs和視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization， RNV) RNV是增生性血管病的主要并發(fā)癥，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy， DR)和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。視網(wǎng)膜局部缺血或損害是RNV的主要特點(diǎn)，Grant等[8]研究表明BM中HSCs能分化成所有參與RNV發(fā)病機(jī)制的造血細(xì)胞系，在缺血性病變區(qū)聚集。另一項(xiàng)研究也證實(shí)了視網(wǎng)膜受損后，BMCs靶向黏附于星形膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的ECs外觀和特點(diǎn)[9]。此外，在激光損傷模型和氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy， OIR)模型[10]中RPE細(xì)胞分泌大量的SDF-1參與BMCs遷移和黏附。在手術(shù)切除DR患者的視網(wǎng)膜前膜中有大量表達(dá)CD133+EPCs和CD14+白細(xì)胞，這意味著BMCs參與到了RNV中。

1.3BMCs和脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization， CNV) CNV是多種眼部疾病所共有的病理體征。大量臨床標(biāo)本和動(dòng)物模型研究表明CNV中有BMCs的參與。老年黃斑變性患者手術(shù)切除的CNV膜中，發(fā)現(xiàn)了AC133陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記的EPCs和HSCs[11]。特發(fā)性CNV和病理性近視相關(guān)CNV的形成均與干細(xì)胞的活動(dòng)有關(guān)[12]。CNV中表達(dá)的BMCs明顯高于眼部其他組織，提示BMCs可特異性在CNV區(qū)富集，參與血管形成[1]。其前期研究也表明，CNV中BMCs分化為血管細(xì)胞沿新生血管的管腔分布，激光誘導(dǎo)小鼠CNV初期即可觀察到大量的BMCs聚集，觀察BMCs參與CNV動(dòng)態(tài)的全過程，發(fā)現(xiàn)CNV后第7天病損區(qū)BMCs數(shù)量達(dá)高峰，隨后緩慢下降，到1月余BMCs數(shù)量趨于平穩(wěn)[1]。而BM中的單核巨噬細(xì)胞從造模后早期第7天起就持續(xù)存在于病損區(qū)及眼部其他組織中。用特異性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31染色，發(fā)現(xiàn)大量的CD31聚集在此。提示CNV區(qū)域內(nèi)的BMCs可能分化為VEC參與血管的形成[1]。此外，CNV區(qū)域還有血管平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物，如α-平滑肌激動(dòng)蛋白、結(jié)合蛋白、NG2硫酸軟骨素黏蛋白或單核巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80[13]，提示CNV區(qū)域中BMCs還可以分化為VEC、VSMCs和單核巨噬細(xì)胞等來參與血管的生成。

2 BMCs對(duì)眼部新生血管調(diào)節(jié)機(jī)制

眼部新生血管中BMCs分布的比例和作用時(shí)間是不同的，但他們也有一些相似之處。例如它們參與眼部新生血管的發(fā)育，均包括4個(gè)步驟：動(dòng)員、遷移、黏附和分化，在這一過程中受到多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的調(diào)控。

2.1BMCs在眼部新生血管中的動(dòng)員 當(dāng)機(jī)體在缺氧或受到各種損傷等因素的刺激下，BMCs會(huì)加速趨化至損傷部位，參與局部組織缺血損傷的發(fā)生[14]。BMCs可通過分泌VEGF，發(fā)揮對(duì)BMCs的動(dòng)員作用。使BM微環(huán)境從靜態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，同時(shí)VEGF的升高也帶動(dòng)BMCs活化加速，粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor， G-CSF)和促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin， EPO)水平也開始增加。此外，SDF-1和其特異性受體CXCR4結(jié)合可以加強(qiáng)BMCs的活化作用，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)9在促進(jìn)BMCs的動(dòng)員過程中發(fā)揮重要的作用。

G-CSF通過對(duì)細(xì)胞本身和BM環(huán)境的調(diào)控起到動(dòng)員作用[15]。其可通過影響HSCs的表達(dá)，減少HSCs的凋亡，從而使BM環(huán)境中ECs黏附分子的表達(dá)下降，增加基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases， MMPs)釋放和ECM降解，促進(jìn)BMCs移行到BM外[15]。此外，也有報(bào)告稱G-CSF減少了BM中血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，刺激了MMPs的釋放和ECM的退化。在CV中，G-CSF表達(dá)的增強(qiáng)促進(jìn)了EPCs從BM進(jìn)入血液循環(huán)[6-7,16]。

EPO可以刺激BM中EPCs生成。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死心力衰竭時(shí)，EPO水平上升，增加了周圍血液的EPCs數(shù)量[17-18]。另有研究顯示，OIR小鼠模型中顯示無血管區(qū)域EPO水平被抑制。提示早期使用EPO可以防止缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡，而晚期使用EPO則會(huì)促進(jìn)新生血管的生成，加速視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡。這表明EPO在BMCs參與血管生成開始時(shí)，就進(jìn)入RNV中發(fā)揮動(dòng)員和募集的作用[19]。

2.2BMCs在眼部新生血管中的遷移 VEGF、SDF-1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)和MMPs在調(diào)節(jié)BMCs的遷移過程中起到了重要作用，但具體的分子機(jī)制較為復(fù)雜，現(xiàn)尚未研究清楚。

趨化因子和它們的受體在BMCs遷移過程中起到了重要作用。如VEGF和其趨化因子VEGF-A；SDF-1和趨化因子CXCR4和CX3CR1。事實(shí)上，SDF-1和VEGF之間及CXCR4和VEGF之間呈正相關(guān)關(guān)系。也就是說，一種因子表達(dá)上調(diào)，另一種因子也會(huì)相應(yīng)增高。此外，在腫瘤相關(guān)的研究中，發(fā)現(xiàn)SDF-1和VEGF協(xié)同，可誘導(dǎo)BM來源細(xì)胞的遷移[20]。

在RNV和CNV模型中，SDF-1和CXCR4可誘導(dǎo)EPCs、HSCs和MSCs聚集于眼部新生血管區(qū)域，而CXCE4拮抗劑會(huì)明顯減少BMCs的聚集[5,20]。在低氧誘導(dǎo)的RNV模型中，RPE層中缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1， HIF-1)與SDF-1相互作用、相互影響，從而促進(jìn)更多的BMCs遷移到眼部參與新生血管形成。

TNF-α作為一種特異性的炎性因子表達(dá)于炎性組織中。在CV的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α缺失后更多的單核巨噬細(xì)胞侵入到炎癥部位，增強(qiáng)了眼部新生血管管腔的形成及角膜瘢痕的形成[21]。另一項(xiàng)研究證明了在BM源性炎性細(xì)胞中選擇性表達(dá)的TNF-α受體1b，誘導(dǎo)信號(hào)正向調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞侵入，促進(jìn)CNV中的血管生成[21]。

MMPs在調(diào)節(jié)BMCs的遷移過程中起到了重要作用。眼部組織分泌多種酶類物質(zhì)，如MMP-2、MMP-7、MMP-9及MMP-13等參與細(xì)胞的移行，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)新生血管出芽，從而促進(jìn)BMCs趨化遷移至新生血管部位[22]。CNV發(fā)生過程中，TGF和VEGF表達(dá)上調(diào)，引起MMPs表達(dá)增高，而基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase 1， TIMP-1)增加的不明顯，破壞了MMPs與TIMP-1之間的平衡，增加了ECM的裂解，促進(jìn)了BMCs的移行，VEC增生及管腔的形成。

2.3BMCs在眼部新生血管中的黏附 BMCs的黏附主要是通過血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白、SDF-1和整合素來調(diào)節(jié)。多種黏附因子與相應(yīng)配體結(jié)合，介導(dǎo)BMCs的黏附過程。BMCs在CNV上大量分布，多種因子如VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)明顯增高[10]。提示這些黏附因子在BMCs參與眼部新生血管黏附中發(fā)揮重要作用。在CNV模型中，整合素與多種細(xì)胞因子VEGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子、bFGF及MMPs等，介導(dǎo)BMCs向細(xì)胞間和ECM的移行、黏附。而整合素拮抗劑可抑制VEC與ECM的黏附，進(jìn)而阻止VEC移行和增生，目前已成為臨床上重要的新生血管抑制劑之一。

2.4BMCs在眼部新生血管中的分化 大多數(shù)BMCs在到達(dá)眼部新生血管區(qū)域后分化為ECs、VSMCs和單核巨噬細(xì)胞。一些在穿過玻璃膜疣之前，到達(dá)脈絡(luò)膜血管內(nèi)時(shí)就已經(jīng)完成了分化。有研究表明，在角膜、視神經(jīng)盤和沒有新生血管的虹膜中也發(fā)現(xiàn)了一些BMCs；有些表現(xiàn)出樹枝狀且F4/80陽(yáng)性，表明眼部的BMCs除了對(duì)眼部新生血管的作用，還有其他功能[1]。

不同的微環(huán)境誘導(dǎo)了BMCs向不同方向分化，而BMCs在眼部新生血管中的作用現(xiàn)仍未闡明。在新生小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元的微環(huán)境中，BMCs被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞因子以及參與未知信號(hào)通路[9-10,12]。此外，在RNV和視網(wǎng)膜退化疾病中，移植到視網(wǎng)膜下腔靜脈的BMCs分化成為血管ECs和感光細(xì)胞，對(duì)血管的發(fā)育和神經(jīng)元的保護(hù)有著很大的影響[23]。

近期研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)不僅能抑制或刺激尖端細(xì)胞的形成，也能影響EPCs的活化、增生和分化[24-25]。有研究表明，在缺血性新生血管中，Notch信號(hào)Jagged-1，調(diào)節(jié)Notch信號(hào)來刺激EPCs向ECs分化，增強(qiáng)了新生血管的生成[25]。而CNV的小鼠模型研究表明，Notch受體的轉(zhuǎn)錄因子下游重組細(xì)胞結(jié)合蛋白-Jκ的缺乏，是通過調(diào)節(jié)EPCs分化為ECs誘導(dǎo)了血管損傷，提示轉(zhuǎn)錄因子下游重組細(xì)胞結(jié)合蛋白-Jκ介導(dǎo)Notch信號(hào)可能在一定程度上通過影響EPCs分化，參與了眼部血管穩(wěn)態(tài)的維持[25-27]。

3 BMCs對(duì)眼部新生血管微小RNA(miRNA)作用

miRNA可以調(diào)節(jié)BMCs的生理功能，在骨髓干細(xì)胞中特異性的表達(dá)[1，28]，改變干或祖細(xì)胞的性質(zhì)，可明顯升高或降低miRNA的表達(dá)[1]。項(xiàng)陽(yáng)和姜明紅[29]利用小鼠實(shí)驗(yàn)，證明了在脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)誘導(dǎo)炎癥狀態(tài)下，miRNA-146a表達(dá)失常導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞功能紊亂。

我們研究小組建立嵌合體小鼠CNV模型后發(fā)現(xiàn)，BMCs對(duì)CNV生成時(shí)MMP-2/MMP-13的迅速上調(diào)起主要作用。同時(shí)證實(shí)了CNV中BMCs內(nèi)miR188-5p的表達(dá)亦隨時(shí)間變化。通過雙酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miRNA-188-5p可能是MMP-2和MMP-13的靶基因[12]。研究miRNA-188-5p的作用及其與CNV中BMCs MMP-2和MMP-13的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miRNA-188-5p可能會(huì)通過調(diào)控ECM中色素上皮衍生因子的降解，從而調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-13表達(dá)，VEC增生、移行、凋亡及CNV纖維化，從而影響CNV的嚴(yán)重程度。另外，還發(fā)現(xiàn)在嵌合體小鼠CNV模型中，BMCs對(duì)CNV生成時(shí)SDF-1和CXCR4的迅速上調(diào)起主要作用[12]。

4 影響B(tài)MCs作用于眼部新生血管風(fēng)險(xiǎn)因素

一些新生血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素如衰老、吸煙、高血糖及炎癥等往往會(huì)改變BM的微環(huán)境，影響B(tài)MCs參與新生血管發(fā)生和發(fā)展。眼部新生血管風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)眼部新生血管有一定作用，尤其是對(duì)CNV。

4.1衰老 年齡是增加CNV發(fā)病的重要因素[1]。有研究表明，高齡CNV小鼠較低齡CNV小鼠的CNV體積、面積明顯增多，且BMCs分化的血管平滑肌細(xì)胞明顯增多。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)高齡CNV小鼠較低齡CNV小鼠BMCs分化的VEC數(shù)量則無明顯增減[2]。近期我們的實(shí)驗(yàn)室使用體內(nèi)生物熒光成像，也表明了衰老的BMCs使得CNV更加嚴(yán)重[12]。

4.2吸煙 吸煙是老年黃斑變性中最重要的風(fēng)險(xiǎn)因素，能促進(jìn)BMCs參與CNV的發(fā)育。有學(xué)者在小鼠CNV模型中發(fā)現(xiàn)香煙中微顆粒主要成分尼古丁會(huì)增加CNV的嚴(yán)重程度[20]。一項(xiàng)研究也表明了尼古丁可通過VSMCs中乙酰膽堿受體的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)VEGF釋放，此過程是由表皮生長(zhǎng)因子受體胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路調(diào)節(jié)[30]。另有研究也表明尼古丁促進(jìn)了BMCs到CNV中的聚集、趨化并對(duì)BMCs分化有影響，是通過VEGF、bFGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子1的上調(diào)來影響的[20,30]。表明尼古丁對(duì)BMCs在CNV作用的間接影響，可能是通過其他因素調(diào)節(jié)的。然而未來還需要進(jìn)行更多關(guān)于機(jī)制的研究。

4.3高血糖 高血糖也被認(rèn)為是眼部新生血管和視力喪失的風(fēng)險(xiǎn)因素。DR是20～74歲美國(guó)人群中視力喪失的最普遍原因。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠CNV模型中有大量BMCs聚集于損傷處，并證明了患有糖尿病的小鼠中BMCs更多地聚集到CNV處[31]。ECs標(biāo)記和單核巨噬細(xì)胞標(biāo)記的BMCs比例上升，VEGF和CNV中SDF-1因子上調(diào)。此外，將MSCs轉(zhuǎn)移到人RPE細(xì)胞中，VEGF與SDF-1的表達(dá)在高血糖時(shí)增加[31]。提示高血糖增強(qiáng)了RPE細(xì)胞中VEGF和SDF-1的表達(dá)，促進(jìn)了BMCs的聚集，影響CNV中BMCs的分化，增加了糖尿病小鼠CNV的嚴(yán)重程度。另有研究顯示，高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激促進(jìn)了STAT3的活性，使VEGF轉(zhuǎn)錄活化，從而間接促進(jìn)了BMCs參與CNV，加重CNV的嚴(yán)重程度[32]。

4.4炎癥 BMCs上表達(dá)大量炎性介質(zhì)，且炎癥在CNV中起到重要的作用[33]。有研究表明，單核巨噬細(xì)胞缺損的基因敲除鼠行激光誘導(dǎo)CNV后，損傷部位有大量來源于BM的單核巨噬細(xì)胞聚集，且分析后發(fā)現(xiàn)基因敲除組的CNV面積、體積、厚度較對(duì)照組有明顯減少[26]。提示炎性介質(zhì)在BMCs參與眼部新生血管的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用[34]。此外，有研究表明中性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞在CNV中同樣發(fā)揮著重要作用[26,34]。

總之，大量證據(jù)表明BMCs在眼部新生血管發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵作用[35]，分為動(dòng)員、遷移、黏附和分化4步。多種細(xì)胞因子如SDF-1、TNF-α、VEGF及MMPs等可用于BMCs的靶向治療。BMCs參與眼部新生血管的風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)預(yù)防眼部新生血管的發(fā)生起到重要作用。對(duì)BMCs參與眼部新生血管機(jī)制的深入理解，有助于探討靶向優(yōu)化的治療方案。本文詳細(xì)綜述了BMCs在眼部新生血管發(fā)育中的重要作用，涉及到抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以及未來抗血管生成療法。然而，眼部新生血管的退化，如RNV和CNV，幾乎不會(huì)是永久的，若沒有抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑的多重使用，幾個(gè)月后會(huì)觀察到新血管的再生[35-36]。至今，極少有研究調(diào)查過眼部新生血管復(fù)發(fā)時(shí)BMCs作用潛在的功能和機(jī)制。如果能解決這個(gè)問題，可能對(duì)BMCs結(jié)合抗血管生成治療靶向治療有幫助。此外，眼部新生血管的診斷常常建立在新生血管形成之后，有時(shí)甚至伴隨著分泌物和出血。BMCs從BM活化并轉(zhuǎn)移至周圍血液循環(huán)，在新生血管形成前就到達(dá)損傷處。這些研究使我們猜測(cè)BMCs和相關(guān)細(xì)胞因子是否能作為潛在標(biāo)志，來協(xié)助眼部新生血管的早期診斷。目前許多相關(guān)發(fā)病機(jī)制仍需更進(jìn)一步研究?？偟膩碚f，帶著這些問題能更深刻地幫助我們提高對(duì)眼部新生血管中BMCs影響的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制的理解，有望在未來擴(kuò)大BMCs的臨床應(yīng)用和治療用途。將BMCs作為靶點(diǎn)或載體不僅可應(yīng)用到眼部，還可應(yīng)用到身體其他部位。