通過生物信息學方法識別頸動脈粥樣硬化斑塊相關風險基因*

奈文青, 戴萌

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院健康管理科(廣東廣州 510515)

心腦血管疾病的發(fā)病率、病死率在全球均位居首位，動脈粥樣硬化是引起心腦血管疾病發(fā)生的主要原因[1-2]。目前普遍認為動脈粥樣硬化是一種慢性、炎癥性、進展性疾病，而明確動脈粥樣硬化的發(fā)病機制是防治心腦血管病的關鍵。盡管該領域存在大量研究，但是動脈粥樣硬化進展和斑塊破裂的分子機制目前仍不完全清楚，迫切需要新的研究來闡明斑塊進展機制[3]。在生物技術層面，基因芯片發(fā)展非常迅速，目前使用也非常普遍，可以同時識別成千上萬個差異基因，為動脈粥樣硬化的發(fā)病機制研究提供新的方向。國內外大量研究通過基因芯片技術探尋動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的病理過程，旨在尋找動脈粥樣硬化進展過程中的差異表達基因，識別動脈粥樣硬化進展過程中的重要的信號通路和相關的致病基因，但是上述這些研究設計方面或多或少存在一些問題，如樣本收集不規(guī)范、樣本量過少、不同來源不同部位的血管進行比較，這些會引入一些試驗偏差，影響研究結果的準確性和可推廣性[4-7]。在本次研究中，為了克服不同個體、不同部位血管帶來的研究偏差，我們采用相同個體的動脈粥樣硬化斑塊和對應的斑塊旁組織進行基因芯片表達譜分析，獲取斑塊組織和斑塊旁組織間差異表達基因，并運用系統(tǒng)生物信息學方法獲取與動脈粥樣硬化相關的信號通路和風險基因，初步探索動脈粥樣硬化斑塊形成的潛在分子病理機制。這些為深度挖掘動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生機制、探尋動脈粥樣斑塊潛在治療靶點和篩選心腦血管疾病早期預警靶標奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 TRIGene提取RNA試劑,Takara公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit,RR047Q，Takara； SYBR? Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)-QPCR Kit，RR420A, Takara。蛋白質定量試劑盒(BCA法)，碧云天;RIPA裂解液，9806S,CST；雞尾酒蛋白酶抑制劑，5872S，CST； SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)，P0051，碧云天；Western一抗二抗去除液(中性)，P0025N，碧云天；胎牛血清，Gibco；鼠抗VAV1單克隆抗體，Cell Signaling Technology,兔抗LYN單克隆抗體，Abcam，兔抗LYN單克隆抗體，Abcam, 兔抗PTPN6單克隆抗體，Abcam;GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠、兔抗山羊二抗、化學發(fā)光試劑盒均采購于Santa Cruz；本次實驗研究所使用儀器主要有PCR儀Lightcycler96 (Roche Applied Science)和蛋白印跡掃描儀ChemiDocTMXRS Imaging System。

1.2 樣本數(shù)據(jù)描述與處理 本次研究使用的GSE43292數(shù)據(jù)集來源于GENE EXPRESSION OMNIBUS數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)，采用的芯片是Affymetrix Human Gene1.0 ST Array[8]。該芯片數(shù)據(jù)集樣本： 32例頸動脈斑塊組織和32例斑塊旁組織，為頸動脈內膜剝脫術后的病變血管組織。術后切除的組織樣本根據(jù)國際AHA的分類標準判定：斑塊組織多是處于IV或V期，而斑塊旁組織絕大多數(shù)為Ⅰ和Ⅱ期病變。

下載GSE43292的CEL原始文件后,然后對探針水平信號值進行系統(tǒng)預處理，包括：質控、變異穩(wěn)定性的分析、背景的矯正、數(shù)據(jù)歸一化處理和基因注釋，最后轉為基因水平表達值。斑塊組織和斑塊旁組織間差異基因采取SAM(significance analysis of microarrays)檢驗和倍比法(fold-change, FC)獲取，篩選閾值為FDR≤0.05且FC>1.5或<0.667。采用R環(huán)境下的GO功能富集包[9]進行后續(xù)的GO功能注釋，采用超幾何檢驗，篩選閾值P<0.01。利用SubpathwayMiner[10]進行后續(xù)通路分析，采用超幾何檢驗，篩選閾值P<0.01。通過Human Protein Reference (Release 9)數(shù)據(jù)庫[11](http://www.hprd.org/)和Cytoscape[12-13](版本號3.6.1)實現(xiàn)蛋白網(wǎng)絡構建及可視化。利用CFinder軟件[14-15]在蛋白互作網(wǎng)絡中篩查疾病風險模塊。

1.3 提取RNA及檢測其濃度和純度 從超低溫冰箱中取出8對頸動脈動脈斑塊和斑塊旁組織，Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA是否降解，最后用紫外分光光度法檢測RNA的濃度和純度，其中A260/280吸光值比率在1.8～2.1范圍內者方可進行后續(xù)系列實驗。

1.4 RT-PCR檢測目標基因mRNA表達水平 反轉錄合成cDNA 反應依據(jù)反轉錄試劑盒說明書進行相應操作。采用SYBR 法Q-PCR 試劑盒(SYBR? Premix Ex Taq,Takara)在熒光定量PCR(Lightcycler96)上熒光定量PCR操作，實驗條件：45 個循環(huán)包括95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，然后60～95 ℃融解曲線分析。目標基因引物的序列從引物數(shù)據(jù)庫下載，并委托生工生物工程股份有限公司進行合成(表1)。內參基因采用GAPDH，并采用2-ΔΔCt方法[16]計算各基因對應的表達值。各個基因的表達值測量均重復3次。

1.5 組織標本蛋白表達水平分析 從-80℃實驗室超低溫冰箱中拿出4對頸動脈粥樣斑塊組織，稱取重量后放入研缽，并用液氮研磨成粉末，用RIPA裂解液提取組織蛋白，測定蛋白濃度，按照標準制膠配方表來配制所需的5%和12%分離膠，并使用Bio-Rad微型電轉移系統(tǒng)進行跑膠，參數(shù)采用恒流即32 mA(16 mA/gel)，時間約為70～90 min，轉膜，轉膜電壓為恒壓100 V，時間70 min，封閉及孵育抗體，在蛋白印跡掃描儀ChemiDocTM XRS Imaging System上掃描條帶。并使用ImageJ軟件測定條帶的顏色深度，并用內參GAPDH進行標準化。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，頸動脈粥樣硬化斑塊和斑塊旁組織之間采用Wilcoxon符號秩檢驗對每個基因表達情況差異進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因表達譜芯片分析結果 通過頸動脈粥樣硬化斑塊的基因表達譜分析，我們獲取了816 個差異基因，包括上調差異表達基因443個，下調差異表達基因373個(圖1)。生物信息學分析中GO的富集結果：差異表達基因在細胞激活、細胞因子、適應性免疫應答和肌肉系統(tǒng)過程富集顯著性是最高，上述生物過程可能參與了動脈粥樣硬化斑塊的進展。而通路的生物信息學分析結果：77個通路被差異上調基因顯著富集，26個通路被差異下調基因顯著富集。其中滿足富集閾值要求的前5個顯著性最高的通路如B細胞受體信號通路和轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路等(表2)。最后，我們構建了上述差異基因對應蛋白的互作網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中的節(jié)點為差異基因和與差異基因直接互作的鄰居基因。在該網(wǎng)絡中，本研究共獲取了10個在蛋白互作網(wǎng)絡中具有密切互作聯(lián)系的差異基因節(jié)點，說明這些節(jié)點在網(wǎng)絡中與其他節(jié)點具有更緊密的互作關系，在生物網(wǎng)絡中占據(jù)更重要的位置，提示在疾病進展中可能發(fā)揮著更重要作用。這些密切互作的節(jié)點基因包括SMAD9、LYN、PTPN6、ZBTB16、SYK、PRKCB、SVIL、VAV1、BMPR1B 和 BTK(圖2-A)。此外，在蛋白互作網(wǎng)絡中使用CFinder軟件尋找疾病風險模塊。圖2-B顯示在默認參數(shù)下識別到的疾病風險模塊，這個模塊中包括8個差異表達的基因，分別是CSF2RB、LCP2、LYN、PLCG2、PTPN6、PTPRC、SYK和VAV1。結合蛋白互作網(wǎng)絡中的前10個重要的差異基因節(jié)點和疾病風險模塊中的差異基因，我們發(fā)現(xiàn)SYK、LYN、PTPN6和VAV1無論在蛋白互作網(wǎng)絡還是疾病風險模塊中都占據(jù)關鍵的位置，即為聯(lián)合分析的重要差異基因，可能是疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用的基因。

注：紅色圓點代表上調差異基因共443個，差異程度最大的基因為FABP4，藍色圓點代表下調差異基因373個，差異程度最大的基因為CNTN1。Atheroma plaque:頸動脈粥樣硬化斑塊組織，Macroscopically intact plaque：斑塊旁組織

圖1動脈粥樣硬化斑塊和斑塊旁組織間差異表達基因火山圖

2.2 實驗驗證關鍵的差異基因 所有實驗均重復3次。采用熒光定量PCR對8對頸動脈斑塊(n=8)和斑塊旁標本(n=8)進行分析，驗證上述標本中SYK,LYN,PTPN6和VAV1基因的表達改變：VAV1(13.2±4.7), LYN(3.6±0.9), SYK(12.1±4.4)和PTPN6(11.8±4.6)。結果顯示，4個差異表達基因在mRNA表達層面與芯片分析結果趨勢完全一致，且差異表達程度較芯片更明顯(圖3)。

表1 實時熒光定量PCR引物

表2 差異表達基因富集KEGG排名前5的通路結果

使用蛋白免疫印跡分析4對頸動脈粥樣斑塊(n=4)和斑塊旁組織(n=4)，結果顯在斑塊組織中LYN,SYK和PTPN6的蛋白表達水平顯著增加：LYN(2.2±0.3)、SYK(26.3±5.3)和PTPN6(1.8±0.2)，與基因芯片檢測趨勢相符。但是VAV1在蛋白印跡條帶上并未檢測出來。

3 討論

本研究運用基因芯片技術對頸動脈斑塊組織和斑塊旁組織進行分析，芯片分析結果顯示有816個差異表達基因，其中上調基因443個，下調基因373個，上述差異基因可能參與與斑塊的發(fā)生、發(fā)展。生物信息學分析結果：動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展可能與免疫應答、炎癥、NK細胞介導的細胞毒作用和FcεRI信號通路等有關。而進一步的蛋白互作網(wǎng)絡與風險模塊聯(lián)合分析提示：VAV1,SYK,LYN和PTPN6可能在動脈粥樣斑塊進展中發(fā)揮著重要作用。

前期已有一些研究表明SYK和VAV1在動脈粥樣斑塊過程中發(fā)揮重要作用。SYK通過激活單核細胞趨化蛋白-1參與動脈粥樣硬化進展[17]。SYK抑制劑BAY61-3606可以顯著抑制血管平滑肌細胞的病理增值和遷移，提示SYK可能是動脈粥樣硬化的潛在治療靶點[18]。Choi等[19]發(fā)現(xiàn)TLR4/SYK介導的巨噬細胞應答促進動脈粥樣斑塊中慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。體外實驗顯示在血管平滑肌細胞中激活的SYK通過釋放IL-1β促進動脈粥樣斑塊中炎癥的進展和微鈣化形成[20]。另一項研究也顯示，SYK抑制劑fostamatinib可以削弱小鼠體內斑塊的進展，提示SYK可能是動脈粥樣硬化進展的潛在抗炎治療靶點[21]。

VAV1僅表達于血液細胞，作為鳥嘌呤核苷酸交換因子參與RAC1和Rho GTP酶的信號轉導。VAV1參與的生物學過程與動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展密切相關，如NADPH氧化酶介導活性氧產(chǎn)生、細胞死亡和白細胞激活[22]。Rahaman等[23]發(fā)現(xiàn)在輔以高脂飲食條件下，apoE-/-/vav1-/-小鼠較apoE-/-小鼠主動脈血管動脈粥樣斑塊面積顯著減少，免疫組化結果提示apoE-/-/vav1-/-小鼠較apoE-/-小鼠斑塊組織中巨噬細胞和皂泡細胞數(shù)量減少，提示Vav1與動脈粥樣斑塊發(fā)生、發(fā)展相關。敲除Vav1基因只是適度抑制氧化低密度脂蛋白的吸收和皂泡細胞的形成，同時敲除Vav1和Vav3基本完全抑制該病理過程，Vav家族在動脈粥樣斑塊形成中可能發(fā)揮重要的調節(jié)作用，作為新型潛在治療靶點值得期待[24]。在我們此次研究中，VAV1在頸動脈粥樣斑塊組織中的免疫印跡實驗中未能檢測到，更換VAV1抗體后仍未能檢測到，雖然在基因芯片和qPCR中可以檢測到其mRNA的表達，考慮VAV1在蛋白翻譯層面可能被阻斷，從而表達量過低引起無法檢測到相關數(shù)值。

LYN編碼酪氨酸蛋白激酶參與肥大細胞脫顆粒。LYN屬于Src家族激酶，參與調節(jié)糖蛋白Ⅵ信號，其缺失會導致血小板激活延遲和凝聚障礙[25]。體外實驗證實，在巨噬細胞中oxLDL通過激活Lyn從而促使CD36募集并激活Na+/K+-ATPase-Lyn復合物，促使巨噬細胞攝入oxLDL和皂泡細胞形成[26]。Miki等[27]研究揭示Lyn在血脂代謝中發(fā)揮重要作用，通過誘導單核細胞趨化蛋白1表達可能參與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展。我們此次研究發(fā)現(xiàn)LYN在動脈粥樣硬化斑塊組織中mRNA和蛋白水平都是增加的，提示LYN可能促進動脈粥樣斑塊的發(fā)生、發(fā)展。

注：A、B：節(jié)點代表基因編碼的蛋白，節(jié)點間的邊代表蛋白間的互作關系，紅色節(jié)點代表上調差異基因編碼的蛋白，藍色節(jié)點代表下調差異基因編碼的蛋白，粉色節(jié)點代表非差異基因編碼的蛋白，但是與差異基因編碼蛋白之間存在直接互作關系。B：在上述蛋白互作構建的網(wǎng)絡中通過CFinder軟件發(fā)現(xiàn)的疾病風險模塊

圖2差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡構建和疾病相關風險模塊聯(lián)合分析

注：ATH:頸動脈粥樣硬化斑塊；MIT:斑塊旁組織；A：通過qRT-PCR在8對頸動脈粥樣斑塊和斑塊旁組織中驗證VAV1、LYN、SYK和PTPN6表達情況，**與MIT比較P<0.01；B：在4對頸動脈斑塊組織和斑塊旁組織中蛋白的表達情況，并使用ImageJ軟件進行灰度值分析

圖3通過手術標本驗證基因芯片分析的4個差異表達基因

PTPN6是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，作為信號分子參與調控細胞生長、分化、細胞周期和腫瘤轉化[28]。PTPN6除參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展外，還參與氣道炎癥反應和血糖穩(wěn)態(tài)的調節(jié)[29-30]。本研究顯示PTPN6在動脈粥樣斑塊組織mRNA和蛋白水平都是表達增加的，首次表明PTPN6可能參與動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展，其功能研究將是我們后續(xù)研究的重點。

綜上所述，本次研究通過系統(tǒng)生物信息學方法研究動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展過程中基因的表達變化，對全面、綜合、系統(tǒng)化的認識動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展奠定一定的基礎，為頸動脈斑塊發(fā)生機制研究提供了一些新的方向和思路。本次研究發(fā)現(xiàn)了VAV1,SYK,LYN和PTPN6可能與動脈粥樣硬化斑塊形成相關，并實驗驗證了上述基因的表達變化，而PTPN6可能是參與動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展的關鍵基因，其功能研究有待進一步分析。