高通量靶向Panel測序新型突變對癲癇遺傳多樣性的臨床價值*

孫立，鄧哲治，孟祥福，姚婕，曾漢兵，彭劉亮，劉玲，陳劍明，李龍毓，黃海威△，鄧杏飛△

1廣東國盛醫(yī)學(xué)科技有限公司(廣東廣州 510530); 2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科(廣東廣州 510080)

癲癇是一種最常見的腦部疾病，以神經(jīng)元過度同步化放電導(dǎo)致大腦反復(fù)性、發(fā)作性和短暫性神經(jīng)系統(tǒng)異常為特征，在全球影響著超過7 000萬人。據(jù)統(tǒng)計，超過75%的癲癇患者沒有得到有效的治療，特別是在低收入及中等收入國家中。因為癲癇本身的復(fù)雜性和遺傳多樣性，全面的、基于遺傳的研究和見解較為有限。在本次研究中，我們通過自主設(shè)計的基因Panel對癲癇相關(guān)的600多個基因?qū)⒔? 000個位點進(jìn)行高通量測序，目的在于發(fā)掘以前文獻(xiàn)忽略的乃至沒有報道過的新型癲癇致病性或遺傳易感性位點，揭示癲癇的遺傳多樣性。基因Panel靶向測序相比于全外顯子組測序和全基因組測序，測序深度更高，對疾病相關(guān)的易感性、致病性以及精準(zhǔn)用藥的位點和區(qū)域更有針對性，可以更好地反映癲癇的遺傳多樣性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究納入2016年10月至2019年5月由合作機(jī)構(gòu)送至廣東國盛醫(yī)學(xué)科技有限公司檢測的癲癇病例，其年齡、性別和病史信息均從患者的臨床資料中獲得。入選病例的診斷參考中國抗癲癇協(xié)會2015年修訂的《臨床診療指南-癲癇病分冊》，按照ILAE 1989癲癇和癲癇綜合癥分類方法并結(jié)合臨床信息進(jìn)行分類：原發(fā)性癲癇是指除了可能的遺傳易感性之外，沒有其他潛在的病因的，除了癲癇發(fā)作外，沒有結(jié)構(gòu)性腦部病變和其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的；繼發(fā)性癲癇則是指癲癇發(fā)作是由一個或多個可辨認(rèn)的結(jié)構(gòu)性腦部病變引起的[1]。本研究169個病例中原發(fā)性癲癇69例，繼發(fā)性癲癇100例，兩組一般資料見表1。

病例的納入標(biāo)準(zhǔn)為臨床醫(yī)生確切診斷為癲癇，或者腦電圖和MRI核磁共振結(jié)果明確且臨床醫(yī)生可做出癲癇分類的病例。根據(jù)2014年ILAE提出的癲癇臨床實用定義，癲癇的診斷應(yīng)滿足：(1)2次相隔超過24 h的非誘發(fā)性和非反射性的癲癇發(fā)作；或者(2)一次非誘發(fā)或非反射性的癲癇發(fā)作，且未來10年再發(fā)風(fēng)險>60%；或者(3)診斷為某種癲癇綜合征[2]。

本研究排除在外的病例包括：(1)臨床上沒有作出癲癇診斷的患者(如懷疑是癲癇發(fā)作的，或者只出現(xiàn)過一次癲癇發(fā)作的)；(2)臨床信息不足以作出原發(fā)性及繼發(fā)性癲癇分類的病例。所有病例樣本為干血片或者5 mL EDTA抗凝全血樣本，使用國盛醫(yī)學(xué)自主開發(fā)的核酸提取試劑盒提取基因組DNA。

表1 兩組患者的一般情況 例

1.2 方法

1.2.1 高通量測序 使用美國Thermo Fisher的Ion Torrent高通量測序平臺，并采用AmpliSeq擴(kuò)增子法進(jìn)行癲癇Panel靶向測序。癲癇Panel為國盛醫(yī)學(xué)自主設(shè)計，覆蓋癲癇相關(guān)近600個基因，共8 000個左右癲癇致病、癲癇易感及癲癇精準(zhǔn)用藥位點。所有樣本的測序reads質(zhì)量使用FastQC工具進(jìn)行質(zhì)量控制。測序結(jié)果使用Thermo Fisher的內(nèi)置數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行基因組比對，使用標(biāo)準(zhǔn)生物信息數(shù)據(jù)分析流程進(jìn)行位點比對后處理和注釋。

1.2.2 差異比較 經(jīng)過注釋的Panel測序數(shù)據(jù)通過與千人基因組328個樣本的數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，按照:(1)千人基因組對照數(shù)據(jù)集——全癲癇患者(原發(fā)+繼發(fā))；(2)千人基因組對照數(shù)據(jù)集——原發(fā)癲癇；(3)千人基因組對照數(shù)據(jù)集——繼發(fā)癲癇的分組查找差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 (1)先根據(jù)兩組對比數(shù)據(jù)的表現(xiàn)性分布，進(jìn)行哈代-溫伯格平衡(指在理想狀態(tài)下，各等位基因的頻率和等位基因的基因型頻率在遺傳中是穩(wěn)定不變的，即保持著基因平衡)檢驗，計算出哈溫平衡P值(HWE_P.value)，將HWE_P>0.05的突變列為符合哈溫平衡的可信位點；(2)根據(jù)兩組對比數(shù)據(jù)的表現(xiàn)性分布，進(jìn)行2檢驗，計算出P值，將P<0.05列為組內(nèi)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的位點；(3)根據(jù)具有該突變病例的比例從高到低排列所有突變位點，篩選出突變病例比例>10%的結(jié)果。結(jié)果與HGMD、ClinVar數(shù)據(jù)庫比較，確定為新型突變。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序結(jié)果 入組的癲癇患者中發(fā)現(xiàn)新型突變13個；在原發(fā)性癲癇組中發(fā)現(xiàn)11個新型突變，其中4個為原發(fā)性癲癇患者特有位點；在繼發(fā)性癲癇組中發(fā)現(xiàn)18個新型突變，8個為繼發(fā)性癲癇患者特有位點。3組對比數(shù)據(jù)的基因分布情況見表2。高通量測序質(zhì)控數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表3。

表2 3組的基因分布情況

表3 高通量測序質(zhì)控數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2 全癲癇患者共同新型突變的特點分析 所有癲癇患者組發(fā)現(xiàn)的共同新型突變既有SPATA5、SCN1A這種癲癇致病基因，也有導(dǎo)致精神發(fā)育遲緩及腦病的癲癇易感性基因。相對于千人基因組對照數(shù)據(jù)集，全癲癇患者(原發(fā)+繼發(fā))樣本中突變頻率在10%以上的新型突變有13個，見表4。3組對比數(shù)據(jù)中共同的突變位點為SPATA5、SYNGAP1、SLC25A22、SCN1A、SLC19A3共5個基因。

表4 所有169例癲癇患者(原發(fā)+繼發(fā)性)組新型移碼突變 例(%)

注：黑色加粗的突變?yōu)閿?shù)據(jù)庫已有的突變

2.3 原發(fā)性癲癇特有新型突變的特點分析 原發(fā)性癲癇特有的新型突變中LGI1是癲癇致病基因，其余均為導(dǎo)致神經(jīng)性退化疾病、腦病(encephalopathy)和共濟(jì)失調(diào)的遺傳易感性基因。相對于千人基因組對照數(shù)據(jù)集，原發(fā)癲癇樣本中突變頻率在10%以上的突變有11個，其中區(qū)別于全癲癇患者組和繼發(fā)癲癇組的為NDUFV1、LGI1、AMT、POLG 4個基因的4個突變位點，見表5。

表5 69例原發(fā)性癲癇患者組新型移碼突變 例(%)

注：黑色加粗的突變?yōu)閿?shù)據(jù)庫已有的突變

2.4 繼發(fā)癲癇特有的新型突變的特點分析 繼發(fā)癲癇特有的新型突變主要為導(dǎo)致痙攣截癱、共濟(jì)失調(diào)、腦病及肌張力障礙等癲癇遺傳易感性基因。相對于千人基因組對照數(shù)據(jù)，繼發(fā)癲癇樣本中突變頻率在10%以上的突變有20個，其中區(qū)別于癲癇患者組和原發(fā)性癲癇組的為ZFYVE26、RUBCN、SACS、NOTCH3、RYR1、ATP1A3及AMER1的7個突變位點，見表6。

表6 100例繼發(fā)性癲癇患者組新型移碼突變 例(%)

注：黑色加粗的突變?yōu)閿?shù)據(jù)庫已有的突變

3 討論

癲癇的形成實質(zhì)上是一個健康正常的大腦向一個自發(fā)產(chǎn)生并反復(fù)出現(xiàn)癲癇發(fā)作的大腦轉(zhuǎn)換的過程[3-4]。這個過程很大程度上歸因于一個神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中激發(fā)性活動和抑制性活動的失衡。在失衡的情況下，癲癇性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)以一種過度的、超同步的、周期振蕩的方式工作，并且一旦持續(xù)發(fā)生，它會破壞正常的神經(jīng)元信號處理，甚至可以破壞其他正常的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)[3]。近期的癲癇遺傳性研究較多以全面性和局灶性癲癇分類為基礎(chǔ)：大部分全面性癲癇都被認(rèn)為有遺傳性基礎(chǔ)，而大部分局灶型癲癇則伴隨著腦部結(jié)構(gòu)性異常[5-8]。癲癇的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是多樣的：既有常染色體顯性的罕見癲癇致病突變，也有經(jīng)歷了獲得性腦部損傷，即二次打擊后發(fā)展成癲癇的遺傳易感性位點。常染色體顯性的罕見癲癇遺傳性致病突變通常發(fā)生在三十幾個不同的基因當(dāng)中[9-10]。這些基因主要包括編碼離子通道、神經(jīng)元受體、轉(zhuǎn)錄因子及蛋白酶的基因。雖已經(jīng)有大量報道，但單基因遺傳性癲癇只占所有遺傳性癲癇的5%～10%[11-12]。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為基因變異主要導(dǎo)致全面性癲癇，特別是原發(fā)性全面性癲癇及發(fā)育型癲癇性腦病[13]。但是局灶性癲癇也具有遺傳基礎(chǔ)，有證據(jù)表明具有癲癇家族史的人擁有更高的局灶性癲癇獲得風(fēng)險[13-14]。因此，無論是導(dǎo)致全面性癲癇的罕見突變，還是導(dǎo)致局灶性獲得性癲癇的常見遺傳易感位點，在癲癇的獲得和發(fā)展中很可能都起著相當(dāng)?shù)淖饔肹15]。

本研究通過3組數(shù)據(jù)對比，在全癲癇患者、原發(fā)性癲癇患者和繼發(fā)性癲癇患者組中發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫沒有收錄的癲癇相關(guān)新型移碼突變，展示了高通量Panel靶向測序在癲癇遺傳性研究中的重要作用。所有新型突變都經(jīng)過哈溫平衡檢驗和2檢驗，為符合哈溫平衡的可信位點且組內(nèi)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由結(jié)果可以看出：

3.1 所有癲癇患者組發(fā)現(xiàn)的共同新型突變既有SPATA5、SCN1A這種癲癇致病基因，也有導(dǎo)致精神發(fā)育遲緩及腦病的癲癇遺傳易感性基因 SPATA5編碼的蛋白是廣泛參與膜融合、DNA復(fù)制、微管切斷分離和蛋白質(zhì)降解過程的ATPase酶，Tanaka等[16]在10個家庭14個有癲癇、聽力損失和精神發(fā)育遲緩綜合征的兒童中發(fā)現(xiàn)該基因的純和或者復(fù)合雜合突變，且該基因的遺傳方式為常染色體隱性遺傳。SYNGAP1編碼的為Ras GTPase激活蛋白，該基因的突變會導(dǎo)致常染色體顯性的精神發(fā)育遲緩。SLC25A22編碼的為一種線粒體的谷氨酸載體，該基因的變異被認(rèn)為會導(dǎo)致常染色體隱性的癲癇性腦病。SCN1A編碼的為鈉離子電壓門控通道Alpha子單元，該基因為常染色體顯性遺傳的癲癇致病基因。SLC19A3編碼的為維生素B1跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，該基因的突變可能導(dǎo)致常染色體隱性的生物素或者維生素B1應(yīng)答的2型腦病。SPATA5、SCN1A這種癲癇致病基因在所有169例癲癇患者中的發(fā)生比例分別為24.85%和18.93%，且遺傳方式既有常染色體顯性遺傳AD，也有常染色體隱性遺傳AR。這顯示出無論是原發(fā)性癲癇還是繼發(fā)性癲癇患者中都可有癲癇致病的單基因遺傳位點，與以往癲癇致病突變主要集中在原發(fā)性癲癇患者的觀點有所不同。而遺傳易感性在這一組中主要表現(xiàn)為精神發(fā)育遲緩的遺傳病。

3.2 原發(fā)性癲癇特有的新型突變中LGI1是癲癇致病基因 在169例病例中發(fā)生原發(fā)性癲癇特有的新型突變比例為13%，其余均為導(dǎo)致神經(jīng)性退化疾病、腦病(encephalopathy)和共濟(jì)失調(diào)的遺傳易感性基因，在所有病例中的發(fā)生比例為10%～14.5%。文獻(xiàn)報道的原發(fā)性癲癇與很多基因多態(tài)性相關(guān)性較高，包括GABBR1、SLC2A1、EIG家族、CLCN2等，且主要為原發(fā)性癲癇的遺傳易感性基因。NDUFV1基因編碼NADH：泛醌氧化還原酶Ⅰ型復(fù)合物的蛋白，該基因的變異主要導(dǎo)致常染色體隱性遺傳的線粒體Ⅰ型復(fù)合物缺乏，與肌病、腦肌病變與如帕金森和Leigh氏綜合征等神經(jīng)性退化性疾病相關(guān)。LGI1基因表達(dá)的富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白可能參與調(diào)控了電壓門控鉀離子通道，與神經(jīng)元細(xì)胞調(diào)控和生存相關(guān)。該基因的變異會導(dǎo)致常染色體顯性遺傳的外側(cè)額葉癲癇。AMT基因編碼甘氨酸剪切系統(tǒng)的4個組成部分之一，這個基因的突變可能導(dǎo)致常染色體隱性遺傳的甘氨酸腦病變。POLG基因編碼DNA聚合酶gamma催化子單元，該基因的變異會導(dǎo)致線粒體DNA枯竭綜合征、線粒體常染色體隱性共濟(jì)失調(diào)綜合征、進(jìn)行性眼外肌麻痹。POLG基因編碼的蛋白為線粒體DNA復(fù)制和修復(fù)的重要DNA聚合酶催化單元，該移碼突變NM_001126131：3671delinsAT的位置為POLG蛋白的DNA聚合酶區(qū)域[17]。因此可以推斷該新型移碼突變很可能是致病性突變，引起線粒體常染色體隱性共濟(jì)失調(diào)綜合癥等遺傳疾病。Marcián等[18]討論過共濟(jì)失調(diào)及癲癇的關(guān)系，認(rèn)為共濟(jì)失調(diào)可能源于癲癇或者是抗癲癇藥物治療不良反應(yīng)的體現(xiàn)，但是共濟(jì)失調(diào)是否會使癲癇惡化仍有待研究。

3.3 繼發(fā)癲癇特有的新型突變主要為導(dǎo)致痙攣截癱、共濟(jì)失調(diào)、腦病及肌張力障礙等癲癇遺傳易感性基因 繼發(fā)性癲癇特有的新型突變在所有病例中的發(fā)生比例為10%～15%。繼發(fā)性癲癇的病因較復(fù)雜，可發(fā)于腦部器質(zhì)性或者代謝性疾病。以往的文獻(xiàn)較少進(jìn)行繼發(fā)性癲癇的遺傳研究，呂冰清等[19]研究了183例兒童繼發(fā)性癲癇病因，發(fā)現(xiàn)遺傳性疾病占了全部病例的38.3%，以神經(jīng)皮膚綜合征、家族性癲癇和遺傳代謝病占比最高。

ZFYVE26基因編碼一個包含F(xiàn)YVE鋅指結(jié)合域的蛋白，該蛋白可以通過和磷脂質(zhì)互作與細(xì)胞膜脂質(zhì)蛋白相結(jié)合。該基因的突變會導(dǎo)致常染色體隱性痙攣性截癱15型。SACS基因編碼sacsin蛋白，主要在大腦等神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，該蛋白可以與泛素-蛋白酶系統(tǒng)合作和召集如Hsp70等分子伴侶，保護(hù)大腦不受突變的ataxin-1等共濟(jì)失調(diào)癥蛋白傷害。該基因的突變主要導(dǎo)致Charlevoix-Saguenay型痙攣性共濟(jì)失調(diào)。NOTCH3基因編碼的是一個歸屬于NOTCH受體家族的跨細(xì)胞膜蛋白，該受體家族形成的信號通路在神經(jīng)發(fā)育過程中起著重要的作用。該基因的突變會導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的腦動脈病和側(cè)面腦脊膜膨出綜合征。RYR1基因編碼骨骼肌肉蘭尼堿受體，為肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放通道。該基因的突變主要導(dǎo)致惡性體溫過高易感性、中央核心區(qū)疾病及帶有外部眼肌癱瘓的微核心肌病。ATP1A3基因編碼鈉離子鉀離子離子泵腺甙三磷酸酶alpha-3催化子單元，在基底核、海馬體和小腦中特異性表達(dá)。該基因的變異會導(dǎo)致如2型兒童多發(fā)性替代性半身不遂、CAPOS綜合征和肌張力障礙。AMER1基因編碼的是抗原提呈細(xì)胞(APC)細(xì)胞膜召集蛋白1，該蛋白可以與CTNNB1、APC、AXIN1、AXIN2等基因的蛋白互作并上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性。該基因的變異主要導(dǎo)致X-連鎖顯性遺傳的帶有顱內(nèi)硬化的條紋狀骨病。

因為癲癇臨床信息的有限性，本研究以1989年ILAE的分類為基礎(chǔ)進(jìn)行數(shù)據(jù)分組比較展示癲癇相關(guān)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫沒有收錄的新型移碼突變，而沒有采用更貼近目前主流癲癇分類方法的2017年ILAE分類[20]，因此得到的對比結(jié)果與國外類似研究的可比性不強(qiáng)。但是以1989年ILAE的分類為基礎(chǔ)進(jìn)行數(shù)據(jù)分組，可以對原發(fā)性和繼發(fā)性癲癇的遺傳性進(jìn)行比較，彌補(bǔ)了以往文獻(xiàn)對這兩種癲癇分類，特別是繼發(fā)性癲癇的遺傳性研究的不足。

綜上所述，高通量靶向Panel測序檢測到了不同癲癇類型的新型移碼突變，有效地揭示了包含致病性突變和遺傳易感性突變在內(nèi)的遺傳多樣性。