甲狀腺乳頭狀癌組織FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)與其病情和預(yù)后關(guān)系分析*

曾海勇，吳恢升，吳妹，李海燕△，陳淑娟，劉雪婷，周麗明

深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院(深圳市第二人民醫(yī)院) 1內(nèi)分泌科，2甲乳外科，3高壓氧科(廣東深圳 518000)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，且內(nèi)分泌系良惡性腫瘤組織形態(tài)十分相似，單純依靠常規(guī)組織學(xué)檢查易造成漏診、誤診等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響患者的治病時(shí)機(jī)[1]。有研究顯示[2-3]，PTC的發(fā)生受環(huán)境、遺傳和激素變化或這些因素相互作用的影響，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常而引發(fā) DNA鏈結(jié)構(gòu)改變，其中叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(FoxM1)、Ki-67、p27均與細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)。同時(shí)也有研究顯示，血管滲透因子(VEGF)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但有關(guān)上述因子聯(lián)合評估PTC預(yù)后的研究報(bào)道較少[4]。對此，本研究通過檢測PTC患者FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)，探討其對PTC患者的預(yù)后分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月至2018年6月我院收治的PTC術(shù)后組織及其癌旁正常甲狀腺組織80例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床癥狀、病史、實(shí)驗(yàn)室等檢查確診為PTC[5]；(2)均未接受任何抗癌治療；(3)無溝通障礙和精神病病史;(4)患者或其家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠及哺乳特殊人群；(2)血液性疾??；(3)有心、肝、腎等嚴(yán)重性疾?。?4)拒不配合者。其中男31例，女49例，年齡22～65歲，平均(42.56±5.65)歲，臨床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期51例，Ⅲ期38例，Ⅳ期32例，腫瘤最大徑1～5 cm，平均(2.32±0.45)cm。根據(jù)隨訪1年后是否死亡，分為生存患者52例，死亡患者28例。本次研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批且通過，所有資料來源均真實(shí)可靠。

1.2 方法 所有患者經(jīng)臨床確診為PTC并且均未進(jìn)行放療、化療，采用免疫組織化學(xué)(SP)法檢測所有患者的PTC組織及其癌旁正常甲狀腺組織的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)情況。方案如下：通過手術(shù)切除PTC組織及其癌旁正常甲狀腺組織作為新鮮標(biāo)本，所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定和石蠟包埋后，連續(xù)切片進(jìn)行脫蠟，切片厚度均為4 μm，在60℃烤箱放置2 h，置于4℃冰箱保存，采用SP法檢測同時(shí)對FoxM1、Ki-67、VEGF、p27染色，實(shí)驗(yàn)采用一抗鼠人FoxM1、Ki-67、VEGF、p27試劑，試驗(yàn)操作按照說明進(jìn)行，DAB顯色后用蘇木素復(fù)染3 min，進(jìn)行脫水待切片透明后用中性樹膠封固，同時(shí)采用已知表達(dá)性的切片作為陽性對照，使用PBS緩沖液代替一抗性作為陰性對照，所有因子稀釋比例為1∶50。所有試劑盒均購自廣州錦物生物科技有限公司。

1.3 指標(biāo)觀察和標(biāo)準(zhǔn)[6]FoxM1、Ki-67、VEGF、p27陽性信號(hào)主要位于PTC的細(xì)胞核中，于病灶隨機(jī)選擇5個(gè)視野(×400倍)，觀察癌細(xì)胞，根據(jù)SP法染色以細(xì)胞漿中出現(xiàn)變異性染色的深淺進(jìn)行評分，陽性強(qiáng)度以無色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分；棕黃色為3分。根據(jù)組織染色細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)百分比評分：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性(0分)；5%～25%(1分)；26%～50%(2分)；51%～75%(3分)；>75%(4分)。兩者評分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)，方便試驗(yàn)操作和分析，用(-)代表陰性，(+)(++)(+++)代表陽性，陽性代表高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，采用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以表示，符合正態(tài)分布的采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)比較 PTC組織FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)明顯高于癌旁正常甲狀腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 不同甲狀腺組織的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)比較 例(%)

2.2 FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)與PTC臨床特征的關(guān)系 單因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)等有關(guān)(P<0.05)，見表2。

2.3 不同對象的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)比較 隨訪1年后，發(fā)現(xiàn)死亡患者有28例，且死亡患者FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)明顯高于生存患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

3 討論

PTC是甲狀腺癌中發(fā)病率最高的組織學(xué)類型，占頭頸部腫瘤的首位，好發(fā)于女性群體，隨著近年來生活節(jié)奏的加快和醫(yī)學(xué)知識(shí)的匱乏導(dǎo)致該病發(fā)病率有明顯上升的趨勢，已成為當(dāng)前社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問題。PTC臨床無明顯特異性癥狀，且預(yù)后良好，但若不及時(shí)治療，可進(jìn)一步出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移等惡性癥狀，嚴(yán)重影響患者的健康生活。目前，手術(shù)切除是治療PTC常見的治療方法，可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，當(dāng)仍有部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，甚至死亡的現(xiàn)象。故如何有效評估患者病情及預(yù)后發(fā)展，有利于挽救患者生命[7-8]。

有研究顯示，PTC的發(fā)生、發(fā)展是一種典型的血管依賴性病變，而VEGF被認(rèn)為是最重要的促血管生成蛋白，具有促進(jìn)新生血管生成的作用，在PTC的發(fā)生、發(fā)展中密切相關(guān)[9]。同時(shí)有研究顯示，細(xì)胞周期調(diào)控異常引發(fā)的DNA鏈結(jié)構(gòu)改變是PTC的病因，其中FoxM1 屬于Forkhead 的轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及能量代謝的作用[10-11]。P27是CDKI家族中的一份子，能通過負(fù)性調(diào)控cyclin-CDK復(fù)合物來防止DNA異常復(fù)制的發(fā)生。Ki-67是目前較為肯定的與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白，與很多惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后均具有相關(guān)性[12]。

注：A：PTC組織FoxM1表達(dá)；B：PTC組織Ki-67表達(dá)；C：PTC組織VEGF表達(dá);D：PTC組織p27表達(dá)

圖1PTC中FoxM1、Ki-67、VEGF、p27的表達(dá)(SP，×400)

表2 FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)與PTC臨床特征的關(guān)系 例(%)

表3 不同對象的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)比較 例(%)

對此，本研究采用SP法檢測PTC組織及癌旁正常甲狀腺組織的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTC組織的FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)明顯高于癌旁正常甲狀腺組織，表明上述因子與PTC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而國內(nèi)有學(xué)者[13-14]的研究也證實(shí)了上述因子在PTC的發(fā)展中會(huì)異常變化。這可能是機(jī)體遭受PTC細(xì)胞的侵襲時(shí)，癌細(xì)胞會(huì)破壞血管的正常生長，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，加劇VEGF的產(chǎn)生，且隨著腫瘤血管的大量生成也會(huì)進(jìn)一步催生癌細(xì)胞的增長，從而使Forkhead、Ki-67大量分泌，同時(shí)癌細(xì)胞的侵襲也會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞的周期紊亂，繼而導(dǎo)致DNA異常復(fù)制和多倍體的形成，從而影響p27的表達(dá)[15]。而本研究單因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)等有關(guān)，表明上述因子的表達(dá)與PTC的病情發(fā)展密切相關(guān)，且進(jìn)一步提示PTC患者的病情越嚴(yán)重，其表達(dá)水平越高。這可能是臨床分期及病理分級(jí)越高的患者，其病情越嚴(yán)重，機(jī)體的腫瘤血管擴(kuò)張較快，癌細(xì)胞的成長環(huán)境越好，其分裂及增殖的速度越快。因此，患者的病情越嚴(yán)重，F(xiàn)oxM1、Ki-67、VEGF等因子的表達(dá)越明顯[16-17]。而患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則意味腫瘤的發(fā)育可能進(jìn)入晚期，此時(shí)的腫瘤細(xì)胞快速生長且向外擴(kuò)散侵入淋巴血管，從而誘導(dǎo)新生淋巴管的形成，有利于腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血管或向臨近纖維蛋白和結(jié)締組織基質(zhì)擴(kuò)散，最終導(dǎo)致大部分正常細(xì)胞由G1期到S期轉(zhuǎn)化，使進(jìn)入S期的瘤細(xì)胞增多，最終使其促進(jìn)和參與DNA復(fù)制，加速細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，繼而加劇上述因子的分泌，由此可見FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)與PTC的發(fā)展可能存在某種關(guān)系[18-19]。此外，隨訪1年后，死亡患者FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)明顯高于生存患者，表明上述因子可作為PTC的預(yù)后生存指標(biāo)。這可能是VEGF的高度表達(dá)會(huì)提高腫瘤血管的生成，且有利于腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，而FoxM1、Ki-67、p27的高度表達(dá)會(huì)破壞正常細(xì)胞的周期運(yùn)行，加劇腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，最終導(dǎo)致患者的病情惡化[20]。

綜上所述，F(xiàn)oxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)與PTC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，檢測FoxM1、Ki-67、VEGF、p27表達(dá)對評估患者病情發(fā)展及預(yù)后具有重要的價(jià)值。