通過鉆孔加速建立體外椎體骨質(zhì)疏松模型*

馮慶裕, 謝文偉, 王志坤, 鐘歡, 張家勛

1廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(廣東湛江 524000)； 2東莞市第三人民醫(yī)院骨外科(廣東東莞 523290)

隨著人口老齡化的日趨嚴(yán)重，老年人相關(guān)疾病患病率也逐年增長(zhǎng)，而老年性骨質(zhì)疏松癥(senile osteoporosis,SOP)是最為常見的老年人疾病之一。據(jù)預(yù)計(jì)，2020年中國人SOP患病人數(shù)將達(dá)到2.866億人[1]，而SOP是椎體壓縮性骨折發(fā)生的高危因素。為了研究骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折的發(fā)生機(jī)制以及相關(guān)治療方式，椎體骨質(zhì)疏松模型的建立具有重要的臨床意義，目前的模型建立方法大體可分為在體模型及離體模型兩大類型[2]，在體模型的建立方法大致可分為：手術(shù)建模法[3]、藥物建模法、基因工程建模法等，但由于建模時(shí)間較長(zhǎng)，動(dòng)物個(gè)體差異水平大以及實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)限制了模型的大量建立。離體模型則多使用試劑使骨骼脫去鈣質(zhì)，其建模費(fèi)用相對(duì)低廉，建模用時(shí)較短等優(yōu)點(diǎn)而受到臨床研究者的喜愛。而二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)可螯合多種金屬離子，包括鈣離子，其不破壞細(xì)胞等微觀結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)使其成為主流的脫鈣液，但其脫鈣效果仍比較緩慢。我們?cè)?019年7月4日至9月5日通過對(duì)椎體進(jìn)行不同數(shù)量的鉆孔，并對(duì)其脫鈣以及進(jìn)行生物力學(xué)試驗(yàn)，本文將探討不同數(shù)量的鉆孔及脫鈣來加速建立椎體骨質(zhì)疏松模型，并比較各組的生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而找到一種既能加速脫鈣又不影響其生物力學(xué)改變的建模方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑 實(shí)驗(yàn)材料：模型取自20只年齡6～8年的雌性陜南白山羊胸腰段椎體(體重25～27 kg)，取其腰椎L1、L2、L3、L4、L5椎體共100個(gè)。

實(shí)驗(yàn)儀器：雙能X線吸收骨密度儀(Hologic Discovery Wi, Hologic Inc, Bedford MA, USA)、數(shù)字化X線照片機(jī)(DR)、島津力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀、Stryker 電鉆、2 mm 鉆頭、自制傾斜角度為 15°的不銹鋼壓縮模具、游標(biāo)卡尺(型號(hào)：0～150，上海量具，測(cè)量范圍：0～150 mm，讀數(shù)值：0.02 mm)、量筒、天平、pH 試紙等。

實(shí)驗(yàn)試劑：EDTA-2Na(分子量336.21，廣州偉達(dá)化工有限公司)、NaOH(氫氧化鈉，分子量 40，廣州偉達(dá)化工有限公司)、10%甲醛溶液(10%中性緩沖甲醛溶液，浙江省金華市同和生物科技有限公司)、蒸餾水(25 kg/桶，東莞市仟凈環(huán)保設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑準(zhǔn)備 EDTA-Na2脫鈣液：配制方法為稱取EDTA-Na2 165 g，NaOH 20 g 加入800 mL蒸餾水，然后劇烈攪拌液體至粉劑完全溶解后定容至1 000 mL，用pH試紙檢測(cè)其值≈7.0，濃度為 0.491 6 mmol/L。用此法大量復(fù)制脫鈣液備用。

1.2.2 椎體脫鈣前準(zhǔn)備 取同一天宰殺20只年齡6～8年的雌性陜南白山羊(體重25～27 kg)的脊柱，將L1、L2、L3、L4、L5椎體從脊柱中分離出來，呈單椎體狀，經(jīng)過肉眼與 DR 觀察，無明顯骨缺損，病變與畸形，去除椎旁肌肉與椎體表面的骨膜，切斷橫突保留3 mm，棘突保留2 cm、切除椎間盤，清水沖洗干凈。置于10%甲醛溶液中固定24 h。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將100個(gè)椎體隨機(jī)分為5組：A組、B組、C組、D組、E組(每組20個(gè))，并在每個(gè)椎體做好標(biāo)記。5組椎體均使用雙能X線吸收骨密度儀測(cè)定骨密度，并記錄數(shù)據(jù)。

A組：20個(gè)椎體不做鉆孔處理。B組：椎體使用Stryker 2 mm 鉆頭的電鉆對(duì)椎體進(jìn)行鉆20個(gè)孔。要求鉆孔前先在兩側(cè)終板規(guī)劃好進(jìn)孔點(diǎn)，鉆頭予游標(biāo)卡尺限深，打孔深度為10 mm，但以不鉆穿對(duì)側(cè)終板為準(zhǔn)。鉆頭垂直于終板表面，孔洞在終板上平均分布，雙側(cè)終板鉆孔均等交錯(cuò)分布。C組：椎體使用Stryker 2 mm 鉆頭的電鉆對(duì)椎體進(jìn)行鉆20個(gè)孔。要求鉆孔前先在兩側(cè)終板規(guī)劃好進(jìn)孔點(diǎn)，鉆頭予游標(biāo)卡尺限深，打孔深度為10 mm，但以不鉆穿對(duì)側(cè)終板為準(zhǔn)。鉆頭垂直于終板表面，孔洞在終板上平均分布，雙側(cè)終板鉆孔均等交錯(cuò)分布。D組：椎體使用Stryker 2 mm 鉆頭的電鉆對(duì)椎體進(jìn)行鉆30個(gè)孔。要求鉆孔前先在兩側(cè)終板規(guī)劃好進(jìn)孔點(diǎn)，鉆頭予游標(biāo)卡尺限深，打孔深度為10 mm，但以不鉆穿對(duì)側(cè)終板為準(zhǔn)。鉆頭垂直于終板表面，孔洞在終板上平均分布，雙側(cè)終板鉆孔均等交錯(cuò)分布。E組：椎體使用Stryker 2 mm 鉆頭的電鉆對(duì)椎體進(jìn)行鉆40個(gè)孔。要求鉆孔前先在兩側(cè)終板規(guī)劃好進(jìn)孔點(diǎn)，鉆頭予游標(biāo)卡尺限深，打孔深度為40 mm，但以不鉆穿對(duì)側(cè)終板為準(zhǔn)。鉆頭垂直于終板表面，孔洞在終板上平均分布，雙側(cè)終板鉆孔均等交錯(cuò)分布。

1.2.4 對(duì)鉆孔各組椎體進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)定 取各組的10個(gè)模型分別放置于兩模具中間，以1 mm/min的加載速度進(jìn)行預(yù)壓，直到100 N 時(shí)停止加壓，目的為消除蠕變運(yùn)動(dòng)以及充分固定，然后將試驗(yàn)力調(diào)零；采用2 mm/min的負(fù)荷加載速度進(jìn)行壓縮，試驗(yàn)力精確度為 0.01 N，位移精確度為 0.05 mm，加壓至有椎體出現(xiàn)骨折時(shí)停止，記錄出現(xiàn)骨折時(shí)候的試驗(yàn)力大小及發(fā)生骨折的椎體的高度改變，力學(xué)實(shí)驗(yàn)過程保持室溫恒定并使用空針抽取生理鹽水不斷于單元椎上噴灑以保持濕潤(rùn)，減少誤差；

1.2.5 脫鈣 將A、B、C、D、E五組50個(gè)椎體浸泡于配制好的EDTA-Na2脫鈣液中，每24 h更換脫鈣液，每隔5 d使用雙能X線吸收骨密度儀測(cè)定骨密度并記錄數(shù)據(jù)，記錄每組椎體骨密度達(dá)到下降超過原骨密度25%的時(shí)間。

1.2.6 對(duì)浸泡后各組椎體生物力學(xué)測(cè)定 將各組浸泡完成后的每個(gè)模型分別放置于兩模具中間，以1 mm/min 的加載速度進(jìn)行預(yù)壓，直到100 N 時(shí)停止加壓，目的為消除蠕變運(yùn)動(dòng)以及充分固定，然后將試驗(yàn)力調(diào)零；采用2 mm/min的負(fù)荷加載速度進(jìn)行壓縮，試驗(yàn)力精確度為 0.01 N，位移精確度為 0.05 mm，加壓至有椎體出現(xiàn)壓縮性骨折停止，記錄出現(xiàn)壓縮性骨折時(shí)候的試驗(yàn)力大小及發(fā)生骨折的椎體的高度改變，力學(xué)實(shí)驗(yàn)過程保持室溫恒定并使用空針抽取生理鹽水不斷于單元椎上噴灑以保持濕潤(rùn)，減少誤差。

2 結(jié)果

2.1 各組未浸泡前椎體生物力學(xué)結(jié)果 對(duì)A、B、C、D、E五組進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)5組間的抵抗極限強(qiáng)度及剛度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，通過兩兩對(duì)比可知，A、B、C三組相互間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D、E兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而D組與A、B、C三組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，E組與A、B、C三組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。由此可認(rèn)為在本實(shí)驗(yàn)條件下，B、C兩組雖然經(jīng)受鉆孔但沒明顯影響其椎體的抵抗極限強(qiáng)度及剛度，然而鉆孔數(shù)量上升到一定程度后，D、E兩組會(huì)降低椎體的抵抗極限強(qiáng)度及剛度見表1。說明鉆孔數(shù)≤20個(gè)以內(nèi)對(duì)椎體生物力學(xué)性能影響不大。

2.2 椎體骨質(zhì)疏松建模結(jié)果 建模時(shí)間見圖1。(1)A組10個(gè)椎體單元脫鈣前骨密度(BMD)為(1.237±0.030) g/cm3，脫鈣45 d BMD達(dá)到下降25%以上，BMD為(0.921±0.021) g/cm3。(2)B組10個(gè)椎體單元脫鈣前BMD為(1.229±0.011) g/cm3，脫鈣35 d BMD達(dá)到下降25%以上，BMD為(0.916±0.013) g/cm3。(3)C組10個(gè)椎體單元脫鈣前BMD為(1.229±0.012) g/cm3，脫鈣30 d BMD達(dá)到下降25%以上，BMD為(0.922±0.022) g/cm3。(4)D組10個(gè)椎體單元脫鈣前BMD為(1.232±0.023) g/cm3，脫鈣25 d BMD達(dá)到下降25%以上，BMD為(0.918±0.023) g/cm3。(5)E組10個(gè)椎體單元脫鈣前BMD為(1.230±0.021) g/cm3，脫鈣25 d BMD達(dá)到下降25%以上，BMD為(0.915±0.019) g/cm3。

圖1 各組椎體建模所需時(shí)間

對(duì)A、B、C、D、E五組進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)5組間的脫鈣前BMD的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，脫鈣后5組BMD的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，由此可認(rèn)為各組在脫鈣前的BMD沒有差異，脫鈣后的BMD也沒有差異。脫鈣后椎體達(dá)到統(tǒng)一骨質(zhì)疏松標(biāo)準(zhǔn)，其鉆孔數(shù)與所需建模時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性。見圖2。

A：不鉆孔椎體脫鈣前；B：脫鈣15 d；C:脫鈣30 d；D:脫鈣45 d

2.3 各組骨質(zhì)疏松椎體生物力學(xué)結(jié)果 A、B、C、D、E組生物力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果見表2，B組因有1個(gè)椎體在行力學(xué)試驗(yàn)時(shí)發(fā)生棘突爆裂排除在外。

項(xiàng)目樣本量(個(gè))抵抗極限強(qiáng)度(N)剛度(N/mm)A組104234±36627±8B組94222±54623±9C組104027±42526±9D組103812±28430±10E組103454±76337±1F值4241334P值<0.001<0.001

以A組為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行兩兩對(duì)比，發(fā)現(xiàn)A、B兩組相互間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而C、 A兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),D、A兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，E、A兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，由此可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)條件下，C、D、E組的鉆孔數(shù)量會(huì)降低脫鈣后椎體的抵抗極限強(qiáng)度及剛度。說明脫鈣后椎體鉆孔數(shù)≥20個(gè)則會(huì)影響其生物力學(xué)特性。

3 討論

骨質(zhì)疏松是導(dǎo)致椎體壓縮性骨折的主要因素之一，國內(nèi)外對(duì)骨質(zhì)疏松性壓縮性骨折的發(fā)生機(jī)制以及治療進(jìn)行了大量的研究，而建立椎體骨質(zhì)疏松模型是研究骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折的重要基礎(chǔ)。

動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型可分為在體模型和離體模型兩大類[4]，在體模型又可根據(jù)建立方法大致可分為：手術(shù)建模法、藥物建模法、基因工程建模法[5-7]等。其中手術(shù)建模法在實(shí)驗(yàn)中最為常用，而手術(shù)建模法可通過切除動(dòng)物卵巢、睪丸、甲狀旁腺等方式，其中以切除卵巢去勢(shì)法為主流方法。

建立在體模型的動(dòng)物常用的有鼠類[8]、狗、豬、羊以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物等。其中大型動(dòng)物常用雌性綿羊或山羊進(jìn)行去勢(shì)法來建立，但存在明顯的缺點(diǎn)，其建模時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月以上[9]、而且需要控制的變量多，如受到個(gè)體差異、季節(jié)、氣候、喂食的方法及山羊的健康狀況等，建立的模型往往差異較大，較難滿足大量實(shí)驗(yàn)的要求。因而尋求一種快速、有效的骨質(zhì)疏松模型顯得具有其必要性。

而動(dòng)物體外模型滿足了這個(gè)需要，動(dòng)物離體模型有著建模時(shí)間較短[10]、可大量制備、不涉及道德倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，體外模型通過使用鹽酸、EDTA-2Na等試劑來制備，這一過程被稱為去礦化[11]，還有學(xué)者嘗試用硝酸、雙氧水等試劑對(duì)骨骼進(jìn)行脫鈣。鹽酸是最早使用來脫鈣的試劑，Akbay等[12]使用鹽酸在25 h內(nèi)成功建立小牛腰椎骨質(zhì)疏松模型，張樹芳等[13]通過使用鹽酸對(duì)小牛腰椎進(jìn)行脫鈣，成功建立起椎體骨質(zhì)疏松模型，但使用鹽酸所制作的動(dòng)物椎體骨質(zhì)疏松模型與人體內(nèi)的骨質(zhì)疏松病理過程不同，該方法建立的模型更接近于骨軟化，而且鹽酸會(huì)使得骨骼內(nèi)的蛋白等物質(zhì)變性，并非最佳的脫鈣試劑。雙氧水是一種強(qiáng)氧化劑，在外科常用于清創(chuàng)消毒，其能破壞骨骼中有機(jī)成分，改變骨骼的生物力學(xué)性能，張智海等[14]曾用雙氧水浸泡山羊椎體，發(fā)現(xiàn)該方法雖然可以降低椎體的彈性模量，但由于其并無脫鈣作用，因此不常用于建立骨質(zhì)疏松模型。而EDTA-2Na是一種金屬螯合劑，能有效鰲合骨骼中的鈣離子[15]，其脫鈣作用對(duì)骨骼中有機(jī)成分，如細(xì)胞等微觀結(jié)構(gòu)破壞較少，在進(jìn)行脫鈣后也能進(jìn)行免疫組化的研究[16]，但其存在著脫鈣的速度較慢的缺點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)使用的成年雌性陜南白山羊的腰椎作為研究對(duì)象，國際公認(rèn)山羊是制備骨質(zhì)疏松模型的常用大型動(dòng)物之一[17]，蒙文丹等[18]認(rèn)為羊是一種相當(dāng)有研究?jī)r(jià)值的骨質(zhì)疏松模型建模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其成年動(dòng)物骨密度略大于我國成年人的椎體BMD，可通過脫鈣使其BMD下降，從而模擬不同程度的椎體骨質(zhì)疏松模型，本實(shí)驗(yàn)用骨量丟失百分率診斷法[19]來判斷椎體是否達(dá)到骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對(duì)建模方法進(jìn)行改造，對(duì)實(shí)驗(yàn)椎體進(jìn)行不同數(shù)量鉆孔，使得脫鈣液能直接與椎體內(nèi)的松質(zhì)骨直接接觸，加大接觸面積，從而加速椎體骨質(zhì)疏松模型的建立。但由于鉆孔的數(shù)量以及程度會(huì)對(duì)椎體的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的破壞，因此本實(shí)驗(yàn)鉆孔方式設(shè)計(jì)定義為只在椎體雙側(cè)終板表面垂直鉆孔，并使鉆孔數(shù)交錯(cuò)分布均勻，目的在于當(dāng)進(jìn)行垂直受壓生物力學(xué)測(cè)定時(shí)，孔洞方向與測(cè)定壓力方向一致，相對(duì)于其他側(cè)面鉆孔，更能消除因鉆孔導(dǎo)致對(duì)椎體抗壓力的外來因素的干擾。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃噲D尋求到一種既不影響椎體生物力學(xué)性能、保證達(dá)到骨質(zhì)疏松標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，又能促進(jìn)加速脫鈣過程加快制備出椎體骨質(zhì)疏松模型的方法。從而更好地為骨質(zhì)疏松研究提供良好服務(wù)，又不至于影響椎體生物力學(xué)結(jié)果的方法來快速制備椎體骨質(zhì)疏松模型。

由本實(shí)驗(yàn)擬結(jié)果可知，椎體脫鈣前經(jīng)過不同鉆孔數(shù)后，進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)鉆孔數(shù)≤20個(gè)以內(nèi)對(duì)椎體生物力學(xué)性能影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在椎體脫鈣建立成一定標(biāo)準(zhǔn)的骨質(zhì)疏松模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)其鉆孔數(shù)與所需建模時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性，并且當(dāng)鉆孔數(shù)≥20個(gè)則會(huì)影響其生物力學(xué)特性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上分析得出以下結(jié)論：(1)對(duì)無論脫鈣前還是脫鈣后的椎體進(jìn)行垂直終板鉆孔達(dá)到一定數(shù)量后均會(huì)對(duì)其生物力學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生明顯影響。(2)當(dāng)在對(duì)椎體進(jìn)行約10個(gè)數(shù)量的鉆孔時(shí)，既可滿足達(dá)到骨質(zhì)疏松標(biāo)準(zhǔn)建模的條件，又不影響其所需的生物力學(xué)特性。(3)經(jīng)過10個(gè)數(shù)量的鉆孔時(shí)，能可在35 d內(nèi)建立出椎體骨質(zhì)疏松模型，相比傳統(tǒng)不鉆孔建模所需的45 d，明顯縮短時(shí)間，從而達(dá)到了在盡量不影響椎體極限抵抗強(qiáng)度與剛度的前提下，而達(dá)到快速建模的本研究目標(biāo)。

本建模方法盡管不能完全替代使用去勢(shì)法建立的雌性山羊椎體骨質(zhì)疏松在體模型，但可以在某種程度上為骨質(zhì)疏松椎體生物力學(xué)研究快速有效地提供椎體骨質(zhì)疏松模型數(shù)據(jù)，從而可以為在體模型甚至人體實(shí)驗(yàn)作基礎(chǔ)研究。本研究尚存在一些不足：(1)本研究通過鉆孔的方式加速制備時(shí)間，不免會(huì)對(duì)椎體結(jié)構(gòu)存在破壞；(2)本研究的樣本數(shù)量不多，需加大樣本數(shù)量以進(jìn)一步驗(yàn)證鉆孔數(shù)量與建模時(shí)間以及對(duì)生物力學(xué)特性的影響。下一步，本團(tuán)隊(duì)將研究使用不同填充物填充骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折模型術(shù)后的生物力學(xué)研究。