去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠的治療研究進(jìn)展

黎 婷，張海燕

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽蕪湖 241003)

0 引言

目前，去細(xì)胞支架越來越多的應(yīng)用到了組織工程中，如骨損傷、糖尿病潰瘍等外科臨床手術(shù)中，來源于人皮膚、豬小腸粘膜下層和膀胱等組織器官的去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠[1]，已被用于組織修復(fù)材料，如心肌衰弱、肝臟、氣管和食管等器官的修復(fù)[2-4].去細(xì)胞基質(zhì)可通過2種常用方法制備可注射的水凝膠：一種方法是將去細(xì)胞基質(zhì)研磨成粉末，用液體溶解后進(jìn)行注射，例如骨基質(zhì)、膀胱基質(zhì)等[5]，這種方法應(yīng)用較少；另一種方法是利用胰酶等消化基質(zhì)，消化后的基質(zhì)可自動形成納米纖維水凝膠，與體內(nèi)pH等生理?xiàng)l件更為匹配，相比第一種方法更具臨床應(yīng)用優(yōu)勢[6]，還可以與生長因子等聯(lián)合應(yīng)用，更作為生物墨水材料應(yīng)用于組織的3D打印[7]，該方法制備的去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠應(yīng)用更為廣泛.

1 器官修復(fù)作用

1.1 心肌

去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠在心臟疾病中主要用于心肌梗塞，如豬心基質(zhì)水凝膠已用于臨床心肌梗塞患者的治療，通過重構(gòu)心臟特殊的心肌細(xì)胞微環(huán)境來吸引內(nèi)源細(xì)胞遷移來幫助修復(fù).這種心臟基質(zhì)水凝膠還可以用于血液相容性組織的修復(fù)，由于使用酶消化制備的水凝膠含有大量的膠原成分[8]，通過激活血小板起到激動劑的作用[9].這種治療方式可大大提高心肌增殖、新血管形成，從而修復(fù)心臟功能[10].越來越多的研究致力于探明修復(fù)機(jī)制，如Wawwenaar等將大鼠心肌梗塞使用水凝膠治療進(jìn)行RNA全轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)在心臟修復(fù)相關(guān)通路中，如血管生成、心臟轉(zhuǎn)錄等因子顯著上調(diào)，而炎癥、細(xì)胞凋亡和纖維化等因子顯著下調(diào)，刺激心肌生成[11].

制備水凝膠的組織器官來源中，豬、山羊和人等不同來源的心肌已在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其可使用性，而豬小腸粘膜下層、人胎盤及豬和人的心包由于無組織特異性，作為自體同源組織材料，已分別應(yīng)用于豬和人的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[[12-13]，結(jié)果顯示梗死面積顯著縮小[14].去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠也已經(jīng)用于心臟組織的3D打印，使用人心肌祖細(xì)胞作為種子細(xì)胞，證實(shí)了新血管發(fā)生，移植到裸鼠的心肌梗塞模型后，心臟功能顯著增強(qiáng)[15].在大鼠心肌梗塞模型中，心包去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠與生長因子，如bFGF和HGF聯(lián)用治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小動脈發(fā)生數(shù)顯著增加，新生成的血管與原有血管發(fā)生吻合，實(shí)現(xiàn)通血[16].綜上所述，在心臟疾病治療中應(yīng)用去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，新血管生成，心臟功能顯著改善.

1.2 運(yùn)動器官

1.2.1 骨骼肌 骨骼肌常發(fā)生急性損傷，或因外周動脈疾病造成缺血性損傷和萎縮，多種不同來源器官的去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠已用于骨骼肌的修復(fù)研究.在大鼠后肢缺血性損傷模型中，使用豬骨骼肌與人臍帶去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠進(jìn)行注射治療，二者內(nèi)皮細(xì)胞增殖、動脈生成、肌細(xì)胞增殖及骨骼肌祖細(xì)胞遷移等均顯著增加，但在肌纖維形態(tài)學(xué)上，前者要優(yōu)于后者[17-18].在大鼠腹壁肌肉缺損模型中，使用豬真皮去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠與聚合材料通過電噴射技術(shù)在靜電紡紗材料上凝膠化，移植于缺損部位4周后，經(jīng)過力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)修復(fù)部位硬度幾乎達(dá)到天然組織硬度，移植部位經(jīng)HE染色，顯示大量巨噬細(xì)胞和肌動蛋白陽性細(xì)胞遷移[19]；與使用膀胱去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠治療對比，后者降解更快，肌發(fā)生更顯著[20].

1.2.2 肌腱 肌腱和韌帶損傷會引起組織撕裂和運(yùn)動功能障礙，注射水凝膠在二者治療中效果良好，如Farnebo使用人肌腱去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠進(jìn)行肌內(nèi)注射，引起纖維原細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞及巨噬細(xì)胞大量增殖[21].由于肌腱通血功能差，在大鼠肌腱損傷模型中，單獨(dú)使用水凝膠進(jìn)行注射治療4周后，并未形成肌腱，但是添加富血小板血漿及脂肪干細(xì)胞后，形成肌腱，且力學(xué)測定，如彈性系數(shù)等效果好[22].由于人肌腱供體有限，目前選擇豬和馬作為異種肌腱供體[23]，體外實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)過凍干處理后，細(xì)胞增殖率和細(xì)胞活性更高[24].

1.2.3 關(guān)節(jié)軟骨 關(guān)節(jié)軟骨再生能力差，目前常使用微裂縫手術(shù)促使軟骨再生，但是臨床效果差強(qiáng)人意.可注射水凝膠結(jié)合種子干細(xì)胞或者生長因子聯(lián)用成為一種可替代的方法，Kwon首次使用豬軟骨去細(xì)胞水凝膠用于大鼠軟骨損傷的注射治療[25]，多個(gè)研究使用不同物種的軟骨去細(xì)胞水凝膠進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，以期獲得最好的細(xì)胞反應(yīng)和力學(xué)特性，如去細(xì)胞過程和酶消化過度會造成水凝膠力學(xué)脆弱，重塑能力差[26-27].

1.2.4 骨 缺乏血液供應(yīng)和相關(guān)的生長因子造成骨折后不愈合或愈合效果差，去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠注射在骨折區(qū)域可傳遞外源性生長因子，或招募內(nèi)源性生長因子[28].制備骨去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠時(shí)需通過鹽酸處理脫鈣，否則水凝膠無法凝膠化[29].研究發(fā)現(xiàn)，注射水凝膠修復(fù)骨折時(shí)，聯(lián)用人骨基質(zhì)細(xì)胞與骨形態(tài)蛋白2，骨基質(zhì)形成和膠原沉積增加，而不同的種子細(xì)胞和生長因子的修復(fù)效果有所差別[30].

1.3 神經(jīng)組織

1.3.1 腦 缺血或外傷造成的皮質(zhì)損傷會分別引起缺血性或者創(chuàng)傷性腦損傷，均可使用水凝膠注射進(jìn)行治療.DeQuach首先使用豬腦制備水凝膠培養(yǎng)神經(jīng)元[31]，Bible開始了水凝膠聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞注射治療大鼠中風(fēng)模型的體內(nèi)研究，但是核磁共振結(jié)果顯示并沒有形成神經(jīng)纖維以及與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中其它細(xì)胞的連接[32].分別使用膀胱、臍帶與腦去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞注射治療中風(fēng)性腦損傷，結(jié)果顯示水凝膠濃度高于3 mg/mL，在體內(nèi)才會凝膠化，而濃度為8 mg/mL時(shí)，內(nèi)生性修復(fù)效果最好；不同器官去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠均會促使間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的分化，以及內(nèi)源性細(xì)胞向損傷區(qū)域的遷移；在腦損傷區(qū)域的修復(fù)程度上，不同器官制備的去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠并不是關(guān)鍵，腦組織特異性細(xì)胞(如神經(jīng)干細(xì)胞)才是功能恢復(fù)的關(guān)鍵[33-34].

1.3.2 脊髓 脊髓損傷會導(dǎo)致?lián)p傷平面下喪失感覺和運(yùn)動功能，水凝膠治療旨在愈合脊髓缺口，形成新的神經(jīng)連接.已有研究報(bào)道了多種豬脊髓去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠的制備方法和體外研究結(jié)果，顯示出其促進(jìn)神經(jīng)元的增殖、遷移和分化，以及神經(jīng)元突起的形成[35].豬脊髓和膀胱去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠在大鼠脊髓損傷模型的修復(fù)應(yīng)用中，細(xì)胞增殖、遷移和分化無顯著差異，與人間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)用治療，血管生成和神經(jīng)元突起形成的結(jié)果也無顯著差異，但是以上實(shí)驗(yàn)中水凝膠都迅速分解[36].在今后水凝膠修復(fù)脊髓損傷的研究中，更傾向于對水凝膠進(jìn)行更好的修飾以期減少分解，以及選擇更理想的種子細(xì)胞.

綜上所述，在多種器官修復(fù)的研究中，如肝[37]、結(jié)腸[38]、肺[39]、胰腺[40]等器官，相較于目前的其它臨床生物材料，水凝膠與受體微環(huán)境更為匹配，種子細(xì)胞的增殖、遷移及分化及也更為顯著.

2 移植條件

2.1 組織來源

不同組織制備的可注射基質(zhì)水凝膠成分有所差別，這種差別尤以影響水凝膠的機(jī)械性能以及擴(kuò)展性，組織主要選自于異種動物，尤其是豬源或牛源，來源于人活體的捐獻(xiàn)非常少，大多數(shù)來自死者的捐獻(xiàn)[41].同種及異種組織來源的對比研究發(fā)現(xiàn)，活體異種組織機(jī)械性能更好；自體同源組織，如心包和大網(wǎng)膜等組織由于取樣時(shí)手術(shù)創(chuàng)口大而量少，并沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；異體同源組織常來自于病體，制備水凝膠難度加大，而水凝膠的粘多糖和膠原成分與來自于正常機(jī)體組織的有顯著差別[22,42].因此，目前在臨床使用的去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠，多是來源于異種動物組織的生物商品.

2.2 供體年齡

供體年齡越大，去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠注射后的凝膠化狀態(tài)越差，脂肪沉積和纖維化加劇.Sood等團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，使用不同年齡組織制備的水凝膠體外培養(yǎng)神經(jīng)元與人間充質(zhì)干細(xì)胞，年齡越小，神經(jīng)元增殖、突觸聯(lián)系、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的狀態(tài)越好，間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化狀態(tài)越好[43-44].因此，在制備去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠時(shí)，應(yīng)選擇年齡小的供體器官組織，在組織工程的應(yīng)用中效果更好，如一些動物的胚胎組織已有應(yīng)用.

2.3 組織特異性

不同組織基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成有一定的差異，形成每種組織獨(dú)特的微環(huán)境和生化功能，經(jīng)過去細(xì)胞處理仍然保留一定的組織特異性成分，包括標(biāo)記蛋白、生長因子和組織結(jié)構(gòu).French團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)與脂肪等組織基質(zhì)相比，心臟基質(zhì)中心肌祖細(xì)胞表達(dá)的早期心肌標(biāo)記蛋白含量有顯著性差異[45]；Viswanath團(tuán)隊(duì)使用脊髓、骨骼和牙基質(zhì)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，在脊髓基質(zhì)中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞向舌乳頭分化的數(shù)量更多[46].因此在組織工程的應(yīng)用中，應(yīng)選擇結(jié)構(gòu)更匹配的組織，是因基質(zhì)誘導(dǎo)種子干細(xì)胞向組織特異性細(xì)胞系分化潛力更大.

2.4 滅菌

目前基質(zhì)水凝膠的滅菌技術(shù)和無菌狀態(tài)并沒有統(tǒng)一衡量標(biāo)準(zhǔn)，去細(xì)胞步驟主要包含去除細(xì)胞成分(洗滌劑或酶處理)、酸處理和滅菌(抗體、射線處理[47]).最終的滅菌處理步驟會顯著影響基質(zhì)支架的機(jī)械性能，對乙烯、γ射線和電輻射進(jìn)行無菌處理比較，機(jī)械性能有顯著差別，乙烯處理優(yōu)于電輻射及γ射線[48].今后組織工程中基質(zhì)水凝膠的研究，需要探索全新的滅菌方式，保證其體內(nèi)應(yīng)用生物活性的保留.

3 可能的修復(fù)機(jī)制

去細(xì)胞基質(zhì)是從組織或器官制備的天然支架，去除細(xì)胞和細(xì)胞核成分，但是保留了組織或器官的三維空間結(jié)構(gòu)(仍然保留了部分膠原纖維等天然纖維成分)；支架具有生物活性和生物相容性，相對于用于進(jìn)行自體或異體移植的其它人工生物工程材料，去細(xì)胞基質(zhì)展現(xiàn)了沒有免疫排斥的優(yōu)勢；研究發(fā)現(xiàn)，去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠中保留了大量的細(xì)胞生長因子，如成纖維生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和肝細(xì)胞生長因子等，可以吸引種子細(xì)胞的生長、遷移、增殖和分化，以及血管發(fā)生。這種與種子細(xì)胞之間的“實(shí)時(shí)互動”，可以更好的重塑組織、器官的結(jié)構(gòu)，對組織與器官的再生與功能修復(fù)有著重要的意義[1].

4 展望

已有的研究結(jié)果已證實(shí)去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠作為支架在多種器官損傷治療的修復(fù)作用，表現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移與新血管生成等方面，但是修復(fù)機(jī)制尚未明確.去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠的應(yīng)用剛起步，仍有許多的研究空間.在再生醫(yī)學(xué)中，伴隨著去細(xì)胞基質(zhì)水凝膠的選擇、制備方法和修飾等條件的日益成熟，以及修復(fù)機(jī)制的深入闡釋，將更加完善其在器官功能的修復(fù)治療效果.尤其是新技術(shù)如3D打印的出現(xiàn)，會越來越適應(yīng)器官的復(fù)雜性，而結(jié)合理想的種子細(xì)胞及生長因子，器官功能的修復(fù)也會日益加強(qiáng)，為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了新的方向.