神經(jīng)科學(xué)的突破性方法:膜片鉗技術(shù)

編譯 李升偉

膜片鉗技術(shù)最初是為了記錄離子通過細(xì)胞膜通道蛋白的電流而發(fā)展起來的，現(xiàn)在它已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)工具箱中真正的中堅(jiān)力量。

大腦中的信息被認(rèn)為是由數(shù)千個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生的復(fù)雜電脈沖模式編碼而成的。每個(gè)脈沖，即動(dòng)作電位，是由流經(jīng)神經(jīng)元膜的帶電離子電流調(diào)節(jié)的。但是，這些離子是如何穿過神經(jīng)元的絕緣膜的，多年來一直是個(gè)謎。1976年，埃爾溫·內(nèi)爾（Erwin Neher）和伯特·沙克曼（Bert Sakmann）開發(fā)了膜片鉗技術(shù)，該技術(shù)明確表明電流是由膜中許多通道蛋白的打開引起的。盡管這項(xiàng)技術(shù)最初是為了記錄微小的電流，但它已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究電信號(hào)最重要的工具之一——從分子水平到神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)水平。

到20世紀(jì)70年代，人們普遍認(rèn)為流經(jīng)細(xì)胞的電流是由于細(xì)胞膜上許多通道的打開而產(chǎn)生的，盡管其潛在的機(jī)制尚不清楚。那時(shí)，電流通常是用尖利的電極（一種尖端很細(xì)的移液管）刺入組織來記錄的。然而，不幸的是，以這種方式記錄的信號(hào)太吵了，所以只有通過組織的大的“宏觀的”電流——由許多不同類型的通道調(diào)節(jié)的集體電流——才能被解決。

1972年，細(xì)胞間突觸連接生物學(xué)的先驅(qū)伯納德·卡茨（Bernard Katz）和里卡多·米里迪（Ricardo Miledi）從膜通道的宏觀電流中推斷出某些特性，但這是在排除了所有可能的混雜因素之后才得以實(shí)現(xiàn)的。問題是，宏觀電流可能受到與通道活性無直接關(guān)系的因素的影響，如細(xì)胞幾何形狀和調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性的調(diào)控過程。同樣麻煩的是，對(duì)宏觀電流特征的解釋是基于對(duì)單個(gè)渠道活動(dòng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)未經(jīng)驗(yàn)證的假設(shè)。盡管卡茨和米里迪做了仔細(xì)的分析，但是他們的結(jié)論是否正確仍然存在疑問。關(guān)鍵的數(shù)據(jù)是由內(nèi)爾和沙克曼使用膜片鉗得到的。

膜片鉗技術(shù)從概念上來說相當(dāng)簡(jiǎn)單。將一個(gè)直徑較大的移液管壓在細(xì)胞膜上，而不是刺入細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)臈l件下，移液管的尖端與膜“結(jié)合”，形成一個(gè)緊密的密封。與使用尖銳電極相比，這大大降低了噪聲，因?yàn)橛梢埔汗芗舛税鼑囊恍∑づc細(xì)胞膜的其余部分和細(xì)胞周圍的環(huán)境是電絕緣的。

這樣，科學(xué)家們第一次觀察到了通過膜片中幾個(gè)通道的微小電流。記錄確認(rèn)了關(guān)鍵的通道屬性：當(dāng)通道打開時(shí)，在電流痕跡中有一個(gè)臺(tái)階狀的跳躍；當(dāng)它們關(guān)閉時(shí)，有一個(gè)臺(tái)階狀的回落到基線?，F(xiàn)在可以確定細(xì)節(jié)，如通道的打開和關(guān)閉的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，它們所介導(dǎo)的電流的振幅，以及觸發(fā)通道打開的最佳刺激。借此工作，內(nèi)爾和沙克曼獲得了1991年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

膜片鉗的改進(jìn)使得研究各種制備體中的通道成為可能，從而最終解決長期存在的問題?？茖W(xué)家們對(duì)驗(yàn)證20世紀(jì)50年代諾貝爾獎(jiǎng)得主艾倫·霍奇金（Alan Hodgkin）和安德魯·赫胥黎（Andrew Huxley）提出的動(dòng)作電位生成模型特別感興趣。現(xiàn)在可以直接檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷木唧w預(yù)測(cè)，方法是通過單個(gè)通道檢查電流，并觀察當(dāng)通道的分子結(jié)構(gòu)改變時(shí)電流的變化。最終，這個(gè)模型被證明基本上是正確的，并且目前仍然是計(jì)算神經(jīng)科學(xué)家的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

膜片鉗的幾個(gè)變體之一——全細(xì)胞結(jié)構(gòu)——被一群神經(jīng)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了，他們正在研究通道水平以外神經(jīng)元中的電現(xiàn)象。為了實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞記錄，電極下的膜片被擊破，使電進(jìn)入細(xì)胞。與使用鋒利的電極相比，全細(xì)胞膜片鉗允許更準(zhǔn)確的記錄，更重要的是，對(duì)細(xì)胞的損傷更小。這使得在細(xì)胞水平上對(duì)協(xié)同過程的系統(tǒng)研究成為可能，例如通過調(diào)節(jié)分子來調(diào)節(jié)宏觀電流，以及神經(jīng)元中不同類型通道之間的相互作用。

在全細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，在細(xì)胞中形成的相對(duì)較大的開口也為化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞提供了途徑，使染料能夠得到配送用于觀察復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并提取RNA用于基因表達(dá)分析。內(nèi)爾小組通過向細(xì)胞中引入化學(xué)物質(zhì)，同時(shí)跟蹤細(xì)胞膜電學(xué)特性的變化，來檢測(cè)細(xì)胞間信息傳遞的基礎(chǔ)事件的先后順序。

全細(xì)胞膜片鉗被證明是研究體外保存的大腦切片中神經(jīng)元和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的集體特性的理想工具。在處理更復(fù)雜的系統(tǒng)（如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）的一個(gè)挑戰(zhàn)是，可能的混雜因素的數(shù)量增加。沙克曼在20世紀(jì)90年代提出的解決方案是用兩個(gè)或三個(gè)電極同時(shí)進(jìn)行全細(xì)胞記錄，這在一些人看來有些過分，因?yàn)榭梢杂酶俚碾姌O連續(xù)記錄來獲得可比較的數(shù)據(jù)。然而，這樣做的理由是，花時(shí)間設(shè)計(jì)近乎完美的實(shí)驗(yàn)，可以緩解后來在數(shù)據(jù)解釋方面的困難，類似于卡茨和米萊迪所面臨的困難。

因此，來自神經(jīng)元不同部位的同步記錄最終證實(shí)，動(dòng)作電位始于主長神經(jīng)元突起（軸突）的一部分，并傳播回樹突（接收其他神經(jīng)元輸入的簇狀突起）。將電極置于突觸連接的兩側(cè)，可以直接研究神經(jīng)元之間信號(hào)傳遞的機(jī)制。此外，來自不同類別神經(jīng)元的三重記錄揭示了網(wǎng)絡(luò)組織的特定基本原則。

膜片鉗技術(shù)還被用來檢測(cè)在更為自然的條件下的細(xì)胞活動(dòng)。為了研究感覺刺激和運(yùn)動(dòng)在大腦中是如何表現(xiàn)的，必須在活體動(dòng)物身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然而，這種方法的挑戰(zhàn)在于，最輕微的運(yùn)動(dòng)就能將電極從神經(jīng)元中移除。由于電極和膜之間的緊密密封，全細(xì)胞膜片鉗的結(jié)果是非常穩(wěn)定的。因此，這項(xiàng)技術(shù)可以記錄被麻醉的嚙齒動(dòng)物的樹突和成對(duì)的神經(jīng)元，甚至可以記錄來自會(huì)走路和跑步的動(dòng)物的信息。

可以論證的是，膜片鉗記錄仍然是研究大腦電信號(hào)最直接有效的方法。用這種技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)基本上代表了神經(jīng)科學(xué)許多分支研究人員的基本事實(shí)，從理論工作者到開發(fā)治療某些腦部疾?。òòd癇和自閉癥）藥物的轉(zhuǎn)化研究人員。

另外，膜片鉗補(bǔ)充和豐富了現(xiàn)代的“光遺傳學(xué)”技術(shù)，它可以利用光控制和可視化大量神經(jīng)元的活動(dòng)。新興的技術(shù)，如用于視覺的假眼，可能會(huì)嚴(yán)重依賴于膜片鉗記錄來建立將外部刺激轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的最佳條件。在可預(yù)見的未來，膜片鉗技術(shù)顯然仍將是神經(jīng)科學(xué)家的重要工具。