金線蓮多糖抗衰老作用及其機(jī)制

劉青， 李永， 盛世美

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門(mén) 361021)

衰老是生物體隨著年齡增長(zhǎng)在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能方面出現(xiàn)的一系列退行性變化，是正常且自然的過(guò)程.有學(xué)者認(rèn)為，隨著衰老機(jī)體自由基產(chǎn)生和消除的不平衡，過(guò)量的自由基可損傷細(xì)胞膜、DNA結(jié)構(gòu)，促進(jìn)核酸及蛋白質(zhì)分子內(nèi)發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，從而影響細(xì)胞的正常功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1].隨著衰老不斷進(jìn)行，機(jī)體免疫系統(tǒng)開(kāi)始老化，免疫功能下降.已有研究表明，多種植物多糖具有抗衰老作用[2-3]，它們的抗衰老作用與其抗氧化、免疫調(diào)理作用有關(guān).金線蓮(Anoectochilusroxburghii)又名金線蘭、金石松等，為蘭科(Orchidaceae)開(kāi)唇蘭屬植物，是我國(guó)名貴中藥材，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕等功效[4].金線蓮多糖是金線蓮的主要活性成分之一.近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮多糖具有良好的體外抗氧化[5]、免疫調(diào)節(jié)[6-7]、降血糖[8-9]及抗腫瘤作用[10]，然而，未見(jiàn)金線蓮多糖在抗衰老方面的報(bào)道.因此，本文將對(duì)金線蓮多糖改善衰老小鼠腦功能退化作用進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 金線蓮多糖的提取[11]

將金線蓮干品切碎，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇提取，提取液過(guò)濾后，將干燥殘?jiān)湃?0 ℃的蒸餾水中提取3次，每次1 h；提取液混合濃縮后，加入5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀24 h；然后，將沉淀物溶解在60 ℃熱水中，采用Sevag法去蛋白，并用水透析48 h；最后，用無(wú)水乙醛、丙酮和乙醚洗滌沉淀，得到金線蓮多糖，并用苯酚硫酸法測(cè)定多糖的純度.所得的金線蓮多糖純度為94.5%，且該多糖在260，280 nm處沒(méi)有紫外吸收，將提取的金線蓮多糖命名為ARP.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005.小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，所有操作均符合華僑大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)的要求.

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

D-半乳糖(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；維生素E膠丸(福建省廈門(mén)星鯊藥業(yè)集團(tuán))；過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、血清血清總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和蛋白測(cè)定試劑盒(江蘇省南京建成生物工程研究所)；抗體 p-NF-κB p65和β-actin(美國(guó)貝弗利Cell Signaling Technology公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

用蒸餾水將1 000 mg·kg-1的D-半乳糖溶液配成40 mg·kg-1的D-半乳糖溶液用于皮下注射；將維生素E(VE)溶解在玉米油中，配成200 mg·kg-1的維生素E溶液待用.

BS110S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司)；752型紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；JL BeHv型動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)；DDY-10型三恒電泳儀、半干轉(zhuǎn)印槽、全自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司).

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠衰老模型 小鼠78只，隨機(jī)分為6組，雌雄各半，每組13只.除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠每天頸部皮下注射D-半乳糖溶液(40 mg·kg-1)，建立小鼠衰老模型[12].造模期間，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠灌胃給予維生素E(200 mg·kg-1)，金線蓮多糖組小鼠則分別灌胃給予不同劑量的金線蓮多糖水溶液(100，200，300 mg·kg-1，分別編號(hào)ARP1，ARP2，ARP3)進(jìn)行治療.6周后，每組隨機(jī)取10只小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括曠場(chǎng)、強(qiáng)迫游泳和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)8周后，宰殺這些小鼠，取小鼠胸腺，測(cè)定胸腺指數(shù)；取小鼠大腦皮層，測(cè)定大腦皮層p-NF-κB p65的表達(dá)，以及抗氧化酶CAT，SOD活性，并測(cè)定小鼠血清中T-AOC活性和MDA濃度.每組剩下的3只小鼠，在最后一次給藥后1～2 h，用于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn).

1.4.2 小鼠外觀觀察及體質(zhì)量稱(chēng)量 觀察實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠的生長(zhǎng)情況、外觀與體質(zhì)量變化.

1.4.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 使用開(kāi)口為40 cm×40 cm×35 cm(長(zhǎng)×寬×高)的藍(lán)色塑膠制實(shí)驗(yàn)箱，將軟質(zhì)黑色墊板墊在箱底部，方便小鼠爬行.實(shí)驗(yàn)時(shí)，所有小鼠均提前適應(yīng)環(huán)境3 min，每只小鼠測(cè)試一次.將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱的中心位置，在實(shí)驗(yàn)箱中自由探索環(huán)境5 min，記錄每只小鼠在這5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)速度和后肢直立的次數(shù)(包括攀附箱壁和兩支前爪騰空的次數(shù)).

1.4.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 使用直徑為40 cm，高為30 cm的無(wú)色透明塑料制實(shí)驗(yàn)箱，箱內(nèi)裝有干凈且溫度適合的水供小鼠游泳.實(shí)驗(yàn)時(shí)，所有小鼠均提前適應(yīng)環(huán)境，每只小鼠測(cè)試一次.將小鼠提尾置于實(shí)驗(yàn)箱中心位置的正上方，隨后松手使小鼠自由落體入水，讓小鼠在水中游泳5 min，記錄每只小鼠5 min內(nèi)的游泳時(shí)間.

1.4.5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 采用25 cm×25 cm×30 cm(長(zhǎng)×寬×高)的小鼠跳臺(tái)反應(yīng)箱，將其分為4間，箱底為可通36 V連續(xù)電刺激的銅柵.每間中間放置一直徑為12 cm，高為4.5 cm的橡皮墊作為小鼠回避電擊的安全區(qū).首先，將小鼠置于跳臺(tái)儀中，適應(yīng)環(huán)境3 min；然后，底部銅柵通以36 V交流電.記錄小鼠受到電刺激后跳上橡皮墊的反應(yīng)時(shí)間，以及5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)(受到電擊的次數(shù)).24 h后，再次將小鼠置于跳臺(tái)儀中適應(yīng)3 min，然后將其置于橡皮墊上，記錄第1次跳上橡皮墊的潛伏期，作為記憶成績(jī).

1.4.6 生化檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作要求，測(cè)定小鼠大腦皮層CAT，SOD活性，血清T-AOC活性和MDA濃度.

1.4.7 Western Blot檢測(cè) 采用提取試劑盒提取小鼠大腦皮層總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，加熱使之變性，上樣量30 μg；然后，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉1 h后，加入相關(guān)一抗(anti-p-NF-κB p65稀釋體積比為1∶500，anti-β-actin稀釋體積比為1∶500)，4 ℃過(guò)夜，經(jīng)TBST緩沖液洗3次后，加入相關(guān)二抗封閉液(稀釋體積比為1∶5 000)封閉1 h；采用電化學(xué)(ECL)發(fā)光法，掃描記錄，并采用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，結(jié)果以β-actin為內(nèi)參.

1.4.8 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)[13]最后一次給藥后1～2 h，給每組剩余的3只小鼠，腹腔注射1 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液，輕揉腹部使雞細(xì)胞分散.20 min后，處死小鼠，消毒后剪開(kāi)皮膚，經(jīng)腹腔注入2.5 mL生理鹽水.輕揉小鼠腹部1 min，用移液槍吸取腹腔液，涂片，于37 ℃孵育30 min.取出玻片，漂洗，除去未貼片的細(xì)胞，晾干.以體積比為1∶1的丙酮甲醇液固定5 min，再用瑞氏姬姆薩染液染色，漂洗，晾干，在油鏡下記錄200個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，及每個(gè)巨噬細(xì)胞中被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù).吞噬指數(shù)(IP)和細(xì)胞吞噬百分率(η)的計(jì)算式分別為

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠的外觀及體質(zhì)量變化

圖1 小鼠體質(zhì)量變化(n=10)Fig.1 Weight change in mice (n=10)

觀察可知：實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠生長(zhǎng)良好，飲食及活動(dòng)自由，未發(fā)生死亡；隨著給予小鼠D-半乳糖注射時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)粗糙發(fā)黃、反應(yīng)遲鈍、食量減少等現(xiàn)象；空白對(duì)照組及藥物治療組小鼠的毛較光滑、顏色較正常、活潑好動(dòng).

在實(shí)驗(yàn)周期中，小鼠的體質(zhì)量變化，如圖1所示.圖1中：m為小鼠的體質(zhì)量；t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間；n為每組小鼠的數(shù)量.由圖1可知：相比于其他給藥組小鼠，模型組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)更緩慢.

2.2 小鼠的行為學(xué)能力

(a) 運(yùn)動(dòng)時(shí)間

(b) 運(yùn)動(dòng)速度 (c) 后肢直立的次數(shù)圖2 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠在5 min內(nèi)的活動(dòng)結(jié)果(n=10)Fig.2 Movement results of each group mice in 5 minutes (n=10)

通過(guò)觀察和檢測(cè)小鼠在新環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)探究行為和自主活動(dòng)行為，測(cè)試小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、空間探索能力、學(xué)習(xí)能力和記憶能力[14].不同實(shí)驗(yàn)組小鼠在5 min內(nèi)的活動(dòng)結(jié)果，包括運(yùn)動(dòng)時(shí)間(te)、運(yùn)動(dòng)速度(v)和后肢直立的次數(shù)(N),如圖2所示.圖2中：與空白對(duì)照組相比，“**”表示P<0.01;與模型組相比,“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01.

由圖2可知：與空白對(duì)照組相比較，衰老模型組小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)速度和站立次數(shù)均顯著下降(P<0.01)；與衰老模型組小鼠相比，經(jīng)不同劑量金線蓮多糖和VE治療后，小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)速度和站立次數(shù)均明顯增加(P<0.01，P<0.05)，說(shuō)明金線蓮多糖和VE能使衰老小鼠的運(yùn)動(dòng)、空間探索、學(xué)習(xí)和記憶能力有明顯改善.

2.3 小鼠的抗疲勞能力

每組小鼠在5 min內(nèi)的游泳時(shí)間，如圖3所示.圖3中：ts為游泳時(shí)間.

由圖3可知：與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠在5 min內(nèi)的游泳時(shí)間顯著減少(P<0.01)，衰老模型組小鼠的體力差；與衰老模型組相比，金線蓮多糖治療各組及VE組小鼠的游泳時(shí)間均明顯延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明金線蓮多糖能改善衰老小鼠的耐力，提高其抗疲勞能力.

2.4 小鼠的被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶能力

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)常用來(lái)測(cè)試小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶能力.各組小鼠2次上臺(tái)潛伏期，如圖4所示.圖4中：ti為小鼠的上臺(tái)潛伏期.

圖3 各組小鼠在5 min內(nèi)的游泳時(shí)間(n=10) 圖4 各組小鼠2次上臺(tái)潛伏期(n=10) Fig.3 Swimming time of each group mice Fig.4 Two incubation periods of in 5 minutes (n=10) each group mice (n=10)

由圖4可知：在第1次測(cè)試中，各組小鼠的上臺(tái)潛伏期差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但在第2次記憶重現(xiàn)測(cè)試中，衰老模型組小鼠的上臺(tái)潛伏期明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組小鼠，表明衰老小鼠的學(xué)習(xí)能力沒(méi)有空白對(duì)照組小鼠好；經(jīng)金線蓮治療后，各治療組小鼠的上臺(tái)潛伏期均明顯縮短，與衰老模型組小鼠相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，這說(shuō)明給予一定劑量的金線蓮多糖對(duì)衰老小鼠的被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶能力有促進(jìn)效應(yīng).

2.5 小鼠的抗氧化能力

抗氧化酶對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著重要作用，它能清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷.各組小鼠大腦皮層及血清的抗氧化酶活性和血清中的MDA濃度，如表1所示.表1中：c(MDA)為血清中的MDA的濃度；IT為胸腺指數(shù)；z(SOD),z(CAT),z(T-AOC)分別為SOD，CAT，T-AOC的活性.

由表1可知：與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠大腦皮層和血清抗氧化酶(SOD，CAT，T-AOC)活力均顯著降低(P<0.01)；而衰老模型組小鼠血清的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA濃度顯著升高，說(shuō)明衰老小鼠的抗氧化能力明顯減弱；給予金線蓮多糖治療后，衰老小鼠的抗氧酶活力均升高，中、高劑量金線蓮多糖治療組小鼠的抗氧化酶活力表現(xiàn)出明顯改善(P<0.05，P<0.01)；相應(yīng)地，經(jīng)金線蓮多糖治療后，衰老小鼠血清MDA的濃度也下降，中、高劑量金線蓮多糖治療組小鼠的血清MDA濃度表現(xiàn)出明顯降低(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果表明，給予金線蓮多糖能提高衰老小鼠抗氧化能力；與空白對(duì)照組小鼠相比，衰老模型組小鼠的胸腺指數(shù)明顯減小(P<0.01)，而經(jīng)金線蓮多糖治療后，衰老小鼠的胸腺指數(shù)明顯增加(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明金線蓮多糖能改善衰老小鼠的胸腺萎縮.

組別IT/mg·g-1z(SOD)/μkat·L-1z(CAT)/μkat·L-1z(T-AOC)/μkat·L-1c(MDA)/mol·L-1空白對(duì)照組2.12±0.133 318.33±276.22319.90±49.84370.07±82.6813.34±2.09 模型組1.31±0.16**2 503.50±414.58**190.70±65.18**243.71±51.68**24.32±5.03**VE組1.92±0.13##3 182.30±280.72##300.73±62.35##312.73±33.01#18.44±3.40##ARP1組1.57±0.13#2 800.73±431.59193.20±67.35249.72±32.8421.32±3.17ARP2組1.84±0.13##3 042.27±377.24##254.38±74.35#301.06±62.68#20.07±2.56#ARP3組1.91±0.09##3 090.45±162.53##286.22±64.35#306.89±40.84#18.76±3.75##

2.6 p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)

p-NF-κB p65的相對(duì)蛋白表達(dá)量分析及 p-NF-κB p65表達(dá)量，如圖5所示.圖5中：D為相對(duì)蛋白表達(dá)量.

由圖5可知：與空白對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠大腦皮層p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；經(jīng)金線蓮多糖治療后，衰老小鼠大腦皮層p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平隨金線蓮多糖治療量的增加而逐步降低，說(shuō)明金線蓮多糖能抑制衰老小鼠大腦皮層NF-κB 的信號(hào)通路.

(a) 相對(duì)蛋白表達(dá)量 (b) 表達(dá)量圖5 p-NF-κB p65的相對(duì)蛋白表達(dá)量分析及 p-NF-κB p65表達(dá)量(n=3)Fig.5 Analysis of relative protein expression and expression of p-NF-κB p65 (n=3)

2.7 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬百分率

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖6所示.由圖6可知：與空白對(duì)照組比較，衰老模型組小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)與吞噬百分率明顯降低；經(jīng)金線蓮多糖治療后，衰老小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率與吞噬指數(shù)能力隨著金線蓮多糖使用量的增加而逐步提高，說(shuō)明金線蓮多糖能提高衰老小鼠的免疫力.

(a) 吞噬指數(shù) (b) 吞噬百分率圖6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Fig.6 Peritoneal macrophage phagocytosis test results (n=3)

3 討論

由于衰老機(jī)體自由基產(chǎn)生和消除的不平衡，過(guò)量的自由基可影響細(xì)胞的正常功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.D-半乳糖能使體內(nèi)產(chǎn)生大量的超氧陰離子，從而導(dǎo)致組織器官過(guò)氧化損害，這與自然衰老的表現(xiàn)相似.因此，D-半乳糖被廣泛用于制造衰老模型.研究結(jié)果顯示，經(jīng)D-半乳糖皮下注射8周后，小鼠大腦皮層和血清抗氧化酶活性明顯下降，而脂質(zhì)過(guò)氧化中間產(chǎn)物MDA的濃度卻顯著上升，表明此時(shí)小鼠體內(nèi)氧自由基的清除失衡.

NF-κB信號(hào)通路是氧化應(yīng)激敏感的信號(hào)通路.實(shí)驗(yàn)中，衰老小鼠大腦皮層抗氧化酶活性降低，氧自由基的清除失衡，氧自由基產(chǎn)生增多，激活了小鼠大腦皮層NF-κB信號(hào)通路，使p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào).NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起中心調(diào)控作用，其激活可引起下游多種炎癥反應(yīng)[15]，中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)會(huì)促進(jìn)腦衰老相關(guān)認(rèn)知功能障礙性疾病的發(fā)展.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，衰老小鼠出現(xiàn)行為學(xué)變化，小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、空間探索、學(xué)習(xí)和記憶能力均明顯遲緩.

衰老與免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能改變密切相關(guān).隨著年齡的增加，機(jī)體自由基積累逐漸增多，引起免疫功能改變，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)衰老，免疫器官逐漸萎縮，器官功能下降，使免疫器官對(duì)外界抗原的反應(yīng)緩慢，清除抗原的能力降低[16].實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組小鼠相比，衰老小鼠的胸腺指數(shù)下降，其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著下降.

金線蓮多糖是金線蓮的主要有效成分之一.近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，金線蓮多糖有良好的體外抗氧化、免疫保護(hù)、降血糖作用.實(shí)驗(yàn)中，與衰老小鼠相比，經(jīng)不同劑量的金線蓮多糖治療后的小鼠大腦皮層和血清的抗氧化酶SOD，CAT，T-AOC均有顯著升高，而血清的MDA的濃度呈明顯的下降.這進(jìn)一步表明金線蓮多糖有明顯的體內(nèi)抗氧化作用，能有效改善衰老小鼠機(jī)體的氧化還原狀態(tài).

學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力減退是衰老的主要特點(diǎn)，經(jīng)金線蓮多糖治療后，衰老小鼠大腦皮層的NF-κB信號(hào)通路被抑制，小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、空間探索、學(xué)習(xí)和記憶能力都得到顯著改善，衰老小鼠的活力增加.

經(jīng)金線蓮多糖治療后，隨著機(jī)體抗氧化系統(tǒng)平衡的恢復(fù)，免疫系統(tǒng)的功能得到改善.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金線蓮多糖能顯著提高衰老小鼠的胸腺指數(shù)和巨噬細(xì)胞的吞噬能力，說(shuō)明金線蓮多糖能延緩衰老小鼠免疫器官萎縮，增強(qiáng)衰老小鼠清除抗原的能力.

綜上所述，金線蓮多糖的抗氧化作用能顯著抑制衰老小鼠大腦皮層的NF-κB信號(hào)通路，有效提高衰老小鼠的學(xué)習(xí)、認(rèn)知能力，增強(qiáng)衰老小鼠的活力，提高衰老小鼠的免疫功能，從而起到明顯的抗衰老作用.金線蓮多糖改善衰老小鼠腦功能作用可能與其抗氧化、抑制衰老小鼠大腦皮層的NF-κB信號(hào)通路、增強(qiáng)衰老小鼠免疫功能有關(guān).