單基因和雙基因聯(lián)合治療對小鼠B16-F10黑色素瘤生長抑制作用研究

韋世元， 唐放， 彭旭， 何學令， 尹海林*

(1. 四川大學生命科學學院， 成都610065； 2. 四川大學實驗動物中心， 成都610041)

黑色素瘤起源于黑色素細胞，轉(zhuǎn)移性較強，并且通常在發(fā)現(xiàn)時惡性程度較高。每年約有80%的皮膚腫瘤患者死于黑色素瘤，其5年生存期不到15%。惡性黑色素瘤對放化療不敏感，對于那些失去早期手術(shù)切除治療機會的患者，通過基因靶向治療來延長生存期和改善生活質(zhì)量是一個重要的研究方向(Bartolometal.，2017；田萍，鄭玲，2017)。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是一種主要由免疫細胞、上皮細胞以及一些腫瘤細胞分泌的造血細胞因子，可以促進樹突狀細胞、巨噬細胞等抗原呈遞細胞的增殖分化，可以作為疫苗佐劑強化以樹突狀細胞為基礎(chǔ)的免疫作用(張佳奇等，2018)。血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)可以與血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合促進血管內(nèi)皮細胞增長，目前常見的主要有5種：VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(KDR/Klt-1)、VEGFR3(Flt-4)、免疫防御素神經(jīng)纖毛蛋白(NRP-1)和NRP-2，其中，F(xiàn)lt-1、Flt-4和KDR/Klt-1均是蛋白絡(luò)氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)受體，F(xiàn)lt-1和KDR/Klt-1主要在血管內(nèi)皮細胞上表達，而Flt-4則主要分布在淋巴管內(nèi)皮細胞(馬銳，夏海濱，2017)。目前利用GM-CSF和Flt-kdr3單基因治療腫瘤的研究已有多篇文章，Sallinen等(2009)在sVEGFR-1(sFlt-1)、sVEGFR-2(sFlk-1/KDR)、sVEGFR-3(sFlt-4)基因轉(zhuǎn)移及其組合在異種移植小鼠腹腔內(nèi)的抗血管生成和抗淋巴管生成作用的實驗中發(fā)現(xiàn)，可溶性VEGFRs的抗血管生成基因治療可降低異種卵巢癌移植的腫瘤生長、腫瘤血管供應(yīng)和腹水形成；Yu等(2016)通過coton優(yōu)化的GM-CSF基因顯著提高了所有細胞中蛋白表達水平，有助于產(chǎn)生對HIV-1 Gag和HPV相關(guān)癌癥的強大免疫應(yīng)答。但這2個基因聯(lián)合進行基因治療的研究工作未見報道，為了進一步探討2種基因?qū)δ[瘤治療的協(xié)同作用，本研究通過陽離子脂質(zhì)體介導的mGM-csf和mFlt-kdr3基因藥物治療黑色素肺轉(zhuǎn)移瘤和腋下實體瘤，探討其對腫瘤生長抑制的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物5～6周齡BALB/c小鼠購自四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-15]，飼養(yǎng)于四川大學實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2016-9]，動物實驗均遵循四川大學實驗動物中心實驗動物保護福利和使用相關(guān)制度。

1.1.2 細胞株鼠源黑色素瘤B16-F10細胞株(四川大學生物治療國家重點實驗室)。采用DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化傳代。

1.1.3 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國Gibco，青霉素-鏈霉素雙抗購自Hy-clone；基因藥物D1：H1299+pNE-5(mFlt-kdr3)、D2：H1299+pNE-6(mGM-csf)由成都諾恩生物科技有限公司提供(批號分別為2018081302、2018081301)，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 B16-F10肺轉(zhuǎn)移模型建立收集對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好(可見明顯梭形結(jié)構(gòu)和黑色顆粒狀)的B16-F10細胞，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基1 000 r·min-1離心3 min，洗滌1次后PBS重懸，接著用0.04%臺盼藍染液染色，顯微鏡下計數(shù)檢測細胞活力(細胞活力=活細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量×100%)，待細胞活力達到90%以上時，調(diào)整細胞濃度為5×105/mL。冰袋保溫將細胞送到無菌動物實驗室，在35只小鼠尾部近末端1/3處用尾靜脈注射法緩慢注射0.2 mL細胞懸液。

1.2.2 腋下實體瘤模型建立收集對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好(可見明顯梭形結(jié)構(gòu)和黑色顆粒狀)的B16-F10細胞，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基1 000 r·min-1離心3 min，洗滌1次后PBS重懸，接著用0.04%臺盼藍染液染色，顯微鏡下計數(shù)檢測細胞活力，待細胞活力達到90%以上時，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL。冰袋保溫將細胞送到無菌動物實驗室，在35只小鼠左腋下方用皮下注射法注射0.1 mL細胞懸液。

1.2.3 肺轉(zhuǎn)移模型分組及處理接種后21 d將小鼠隨機分成5組：mFlt-kdr3治療組、mGM-csf治療組、聯(lián)合治療組(1次mFlt-kdr3，2次mGM-csf)、H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對照組和生理鹽水對照組，每組6只。所有小鼠均采用尾靜脈注射法注射對應(yīng)基因藥物。注射劑量為80 μL/只，隔天治療，總計3次。

1.2.4 實體瘤模型分組處理接種后7 d將小鼠隨機分成5組：mFlt-kdr3治療組、mGM-csf治療組、聯(lián)合治療組(1次mFlt-kdr3，2次mGM-csf)、H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對照組和生理鹽水對照組，每組6只。所有小鼠均采用瘤體穿刺給藥法注射對應(yīng)基因藥物，注射劑量為25 μL/只，隔天治療，總計9次。

1.2.5 療效觀察肺轉(zhuǎn)移模型小鼠治療結(jié)束后3 d，即第30天時，用斷頸法處死全部小鼠，并解剖剝離小鼠肺組織，同時對各組小鼠肺部黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶進行拍照和計數(shù)。實體瘤模型小鼠每次注射給藥前用游標卡尺測量小鼠腫瘤長徑(a)、短徑(b)，腫瘤平均體積=1/2ab2；相對腫瘤體積(RTV)=Vt/V0，式中，V0為給藥前腫瘤體積，Vt為各個時間段腫瘤體積；腫瘤相對生長速度=TRTV/TCTV，式中，TRTV為治療組某一時間點的腫瘤體積變化率，即腫瘤體積與給藥前腫瘤體積的比值，TCTV為生理鹽水對照組在同一時間點的腫瘤體積變化率；療效價值=TRTV/TCTV×100%，若療效價值≤60%時，表明該藥物治療有效。

1.2.6 蘇木精-伊紅(HE)染色肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺組織用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、組織切片按照常規(guī)方法進行HE染色，電鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.7 毒副作用觀察試驗期間觀察小鼠的一般情況，包括飲食、活動、體質(zhì)量變化以及有無意外死亡等。

1.2.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20進行組間t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 mGM-csf、mFlt-kdr3和雙基因聯(lián)合治療組對小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移灶形成的抑制作用

mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組的腫瘤數(shù)目分別為2.00個±1.29個、5.33個±1.20個和1.17個±0.98個，均與生理鹽水對照組(12.83個±6.10個)之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對照組(10.83個±5.17個)和生理鹽水對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

2.2 肺轉(zhuǎn)移模型病理學變化

mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組小鼠的肺部結(jié)構(gòu)相對完整，可見比較完整的肺泡結(jié)構(gòu)，而H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對照組和生理鹽水對照組的肺部結(jié)構(gòu)遭到破壞，肺泡間隙增厚，癌細胞排列緊密，核大深染，周圍有大量炎細胞浸潤(圖2)。

2.3 mGM-csf、mFlt-kdr3和聯(lián)合治療組對小鼠黑色素實體瘤生長的抑制作用

實體瘤治療實驗中，mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組小鼠的黑色素瘤體積在18 d時分別為388.44 mm3±168.84 mm3、66.39 mm3±22.81 mm3和96.09 mm3±33.66 mm3，均顯著小于生理鹽水對照組(944.16 mm3±463.06 mm3；P<0.05)；而H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對照組(915.81 mm3±437.33 mm3)與生理鹽水對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05；表1)。mGM-csf治療組小鼠在6 d之前的腫瘤相對生長速度高于生理鹽水對照組，而聯(lián)合治療組腫瘤的平均體積在觀察時間段內(nèi)一直呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。聯(lián)合治療組腫瘤相對生長速度在給藥后2 d的療效價值已經(jīng)達到60%的有效值，而mGM-csf治療組和mFlt-kdr3治療組的療效價值分別在4 d和10 d達到60%(圖3)。且在實驗過程中各組小鼠的飲食、皮毛、活動以及精神狀況未出現(xiàn)異常，也未出現(xiàn)異常死亡。

表1 各組小鼠的腫瘤平均體積
Table 1 Average tumor volume of the mice in different groups

組別平均腫瘤體積(x±SD)/mm30 d2 d4 d6 d8 d10 d16 d18 dmGM-csf治療組33.16±3.1484.19±2.83227.49±47.82247.24±45.12287.99±77.85296.45±95.64378.39±149.61388.44±168.84?mFlt-kdr3治療組31.41±6.3253.29±10.95108.25±31.20110.40±33.29111.36±34.5691.97±30.3978.88±26.2466.39±22.81?聯(lián)合治療組175.22±65.59223.65±79.62194.08±81.80128.67±56.43119.62±46.44100.40±44.51101.25±34.7296.09±33.66?H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對照組33.27±8.4391.88±33.21283.24±116.21403.43±150.67497.80±213.94678.88±311.61818.73±384.72915.81±437.33生理鹽水對照組21.72±5.9360.20±16.12221.63±84.97317.40±125.07421.19±173.09589.70±240.31851.83±412.22944.16±463.06

注： 與生理鹽水對照組相比，*P<0.05

Note： compared with normal saline control group，*P<0.05

圖3 各組療效價值 Fig.3 Therapeutic value of different groups

3 討論

黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤，具有侵襲組織、持續(xù)增殖的能力，能夠逃避宿主細胞免疫監(jiān)視和免疫檢查，其在增殖轉(zhuǎn)移過程中伴隨著大量VEGF的分泌作用，VEGF與VEGFR結(jié)合后促進內(nèi)皮細胞增殖，增加血管通透性以及內(nèi)皮細胞遷移，誘導腫瘤生長轉(zhuǎn)移。因此，通過抑制VEGF與受體結(jié)合是抑制腫瘤生長的一種重要方法。如Davidoff等(2002)通過腺聯(lián)病毒載體構(gòu)建的VEGFR-2，經(jīng)門靜脈注射后在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的高表達，在2種腎腫瘤模型中觀察到顯著的抗腫瘤效果；Zhang等(2018)構(gòu)建了一種具有VEGF和CD 47雙特異性的融合蛋白-VEGFR1D2-SIRPαD1，通過抑制VEGF誘導的血管生成和激活巨噬細胞介導的吞噬功能，在膠質(zhì)母細胞瘤治療中發(fā)揮了較強的抗腫瘤作用。另一方面，GM-CSF能夠促進機體相關(guān)抗原的呈遞、增殖和分化，增強胞毒細胞活性，提高機體的免疫能力(張佳奇等，2018)。Tada等(2012)在體外將未成熟的樹突狀細胞與自體腫瘤抗原及GM-CSF、IL24共培養(yǎng)后皮內(nèi)注射治療2例原發(fā)性肝癌患者，結(jié)果有1例患者出現(xiàn)腫瘤生長減慢現(xiàn)象。RaziSoofiyani等(2017)在研究GM-CSF基因治療對小鼠纖維肉瘤模型腫瘤消退的影響實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過基因治療的模型小鼠的腫瘤體積極顯著縮小。

非病毒載體中的脂質(zhì)體載體具有包含量大、免疫原性小、成本效益高、易于生產(chǎn)和保護作用強的特點(Brenneretal.，1978)，而且Templeton等(1997)對脂質(zhì)體質(zhì)粒復合物表達效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體質(zhì)粒復合物經(jīng)尾靜脈注射進入機體后會在肺部大量分布，因此，利用陽離子脂質(zhì)體構(gòu)建質(zhì)?；驈秃衔锬芨佑行У貙⒅委熁騻鬟f到靶細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。

本實驗采用陽離子脂質(zhì)體包裹DNA的方法，構(gòu)建mGM-csf以及mFlt-kdr3脂質(zhì)體質(zhì)?；驈秃衔铮脕碇委熜∈驜16-F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移以及實體瘤，結(jié)果顯示生理鹽水對照組小鼠肺部結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，而mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組小鼠肺部結(jié)構(gòu)相對完整，僅見散在腫瘤灶，并且聯(lián)合治療組的腫瘤平均數(shù)目最少、治療效果最好。HE染色后在顯微鏡下可觀察到相對完整的肺泡結(jié)構(gòu)。實體瘤模型小鼠在給藥治療后，mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組腫瘤的相對生長速度顯著低于H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對照組和生理鹽水對照組，且聯(lián)合治療組的腫瘤平均體積呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，藥物療效為：聯(lián)合治療組>mFlt-kdr3治療組>mGM-csf治療組。即聯(lián)合基因藥物療效大于單一基因藥物，可能是2種基因在靶細胞內(nèi)同時表達，一方面能夠抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移；另一方面靶細胞內(nèi)表達的GM-CSF能夠促進淋巴細胞在腫瘤部位的浸潤，增強細胞毒性作用，從而增強機體的抗腫瘤能力。

mGM-csf治療組在最開始給藥的6 d表現(xiàn)出反?，F(xiàn)象，其腫瘤平均體積增長相對速度高于生理鹽水對照組，直到第10天左右才達到60%的治療有效標準。推測原因是藥物注射后免疫作用尚未啟動；還有可能是在免疫治療后激活免疫反應(yīng)的過程中，由于有淋巴細胞浸潤，導致腫瘤負荷暫時性增加。因此，這種短期腫瘤負荷的增加不一定是由于腫瘤生長所致的(Hodietal.，2008)。

利用陽離子脂質(zhì)體介導的mGM-csf以及mFlt-kdr3治療黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移以及實體瘤，結(jié)果表明：2種單一基因藥物均對肺部轉(zhuǎn)移腫瘤灶的形成以及實體瘤的生長有一定的抑制作用，并且聯(lián)合治療組抑制作用更加明顯。這為今后的腫瘤臨床治療和藥物開發(fā)提供了一個新思路，同時也為后續(xù)的協(xié)同機理探討奠定了一些基礎(chǔ)。