高原鼢鼠肝臟組織細(xì)胞周期相關(guān)基因的進(jìn)化和表達(dá)
2020-02-27 03:04:32安志芳魏琳娜王志潔李蘇華徐波李永曉魏蓮魏登邦
四川動(dòng)物 2020年1期
安志芳， 魏琳娜， 王志潔， 李蘇華， 徐波， 李永曉， 魏蓮， 魏登邦， *
(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016； 2. 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧810016； 3.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016； 4. 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧810016)
細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程，主要分為G1、S、G2和M期(翟中和等，2000)。細(xì)胞周期的調(diào)控是通過(guò)各個(gè)時(shí)期特異的細(xì)胞周期調(diào)控因子實(shí)現(xiàn)的，主要包括3大類：細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，包括CyclinA、CyclinB、CyclinD、CyclinE等；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)，包括CDK2、CDK4、CDK6等；細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinases inhibitor，CDKI)，包括p21、p16、p19、p27等。Cyclin是細(xì)胞周期正調(diào)控因子，CDKI是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，CDK的活性受Cyclin正向調(diào)節(jié)，受CDKI負(fù)向調(diào)節(jié)，Cyclin會(huì)與對(duì)應(yīng)的CDK結(jié)合，形成Cyclin-CDK復(fù)合物，進(jìn)而決定細(xì)胞周期進(jìn)程(Coatsetal.，1996；Sherr & Roberts，1999；Balter & Vogel，2001)。
研究表明，低氧誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p16、p21、p27高表達(dá)，CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等低表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞周期G1期阻滯(Krtolicaetal.，1998；Gardneretal.，2001；Godaetal.，2003；Cazzalinietal.，2010；Hubbietal.，2013)。細(xì)胞周期G1期阻滯是機(jī)體應(yīng)對(duì)外界刺激的一種保護(hù)反應(yīng)，可以提供充足的時(shí)間修復(fù)受損的DNA，從而避免突變基因遺傳給子代細(xì)胞，避免腫瘤的發(fā)生(Kastanetal.，1991；Cazzalinietal.，2010)。低氧誘導(dǎo)p53下游Gadd45α、14-3-3-σ等基因的高表達(dá)以及CyclinB1等的低表達(dá)，引起細(xì)胞周期G2期阻滯(Hermekingetal.，1997；Innocenteetal.，1999；Puccietal.，2000；Hammeretal.，2007)。細(xì)胞周期G2期阻滯可以保證細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中遺傳物質(zhì)分配的忠實(shí)性，保持基因組的穩(wěn)定(Kastanetal.，1991；Cazzalinietal.，2010)。
地下鼠是一類終身生活在完全封閉的地下洞道中的嚙齒動(dòng)物，其地下洞道嚴(yán)重缺氧(Nevo，1999，2011；Nevoetal.，2001)。大量研究表明，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，地下鼠形成了一系列適應(yīng)低氧的策略(Arieli & Ar，1981；Fangetal.，2014；Shaoetal.，2015；Maliketal.，2016；Danial-Farranetal.，2017；Schmidtetal.，2017)。研究表明，地下鼠具有壽命長(zhǎng)和抗腫瘤的特征，以色列鼴鼠Nannospalaxgalili和裸鼴鼠Heterocephalusglaber的壽命分別長(zhǎng)達(dá)21年和30年，且在國(guó)外40多年的研究過(guò)程中，無(wú)論是野外采集的樣本還是實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的樣本，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一例患有腫瘤的個(gè)體(Buffenstein & Jarvis，2002；Buffenstein，2008；Kimetal.，2011；Edreyetal.，2012；Tianetal.，2013)。研究發(fā)現(xiàn)，生活在濕潤(rùn)低氧的玄武巖地下洞道中的以色列鼴鼠腎臟組織中的p21基因表達(dá)水平顯著高于生活在干旱高溫的白堊土壤洞道中的個(gè)體(Zhaoetal.，2016)。Miyawaki等(2015)的研究發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠會(huì)上調(diào)p16和p19的mRNA和蛋白水平。Fang等(2014)對(duì)以色列鼴鼠基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)，低氧上調(diào)其腦組織中p21、p16和p19基因的表達(dá)，下調(diào)CyclinD1、CyclinG1、CyclinG2和CDK2等基因的表達(dá)。因此，地下鼠通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子的表達(dá)、下調(diào)細(xì)胞周期蛋白等的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1、G2期阻滯。
Kim等(2011)對(duì)裸鼴鼠基因組的研究發(fā)現(xiàn)，CyclinE1在第335號(hào)位點(diǎn)由丙氨酸(Ala)變異為纈氨酸(Val)，該位點(diǎn)的變異可能與裸鼴鼠長(zhǎng)壽抗腫瘤有關(guān)。Kim等(2011)和Miyawaki等(2015)的研究發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠中細(xì)胞周期因子p16和p19結(jié)構(gòu)的變異對(duì)其功能的發(fā)揮起著重要作用。p53是一個(gè)腫瘤抑制因子，通過(guò)上調(diào)或下調(diào)其下游靶基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)行DNA損傷修復(fù)(Agarwaletal.，1998；Vogelsteinetal.，2000)。研究發(fā)現(xiàn)，以色列鼴鼠中p53結(jié)構(gòu)的變異對(duì)其功能的發(fā)揮有重要的作用，p53在DNA結(jié)合域172位由精氨酸(Arg)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)，這種變異使得p21基因高表達(dá)，細(xì)胞周期G1期阻滯(Ashur-Fabianetal.，2004；Avivietal.，2007)。因此，地下鼠細(xì)胞周期的調(diào)控不僅與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)水平有關(guān)，而且與其結(jié)構(gòu)的變異有關(guān)。
高原鼢鼠Myospalaxbaileyi是生活在青藏高原2 800～4 200 m地區(qū)的一種典型的地下鼠，其洞道內(nèi)氧氣的含量較同地區(qū)大氣中的低20%(王祖望等，1979；樊乃昌，施銀柱，1982；劉仁華，1995)。目前，在低氧條件下，關(guān)于高原鼢鼠肝臟組織中細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)水平，以及細(xì)胞周期因子是否在長(zhǎng)期低氧的作用下為了適應(yīng)低氧環(huán)境發(fā)生了結(jié)構(gòu)上變異的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本文應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)p53下游細(xì)胞周期相關(guān)因子p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1進(jìn)行了進(jìn)化分析，并以SD大鼠Rattusnorvegicus為對(duì)照，研究了這些基因在不同海拔(3 300 m和2 260 m)條件下高原鼢鼠肝臟組織中的表達(dá)模式。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
16只高原鼢鼠捕捉于青海省西寧市湟源區(qū)宗家溝(101°17′E，36°43′N(xiāo)，海拔3 300 m)，隨機(jī)分為2組，每組8只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理方法同An等(2018)的前期研究。第1組為高海拔組(海拔3 300 m)，該組為宗家溝地區(qū)(海拔3 300 m)捕捉的樣本；第2組為低海拔組(海拔2 260 m)，將捕捉于宗家溝的高原鼢鼠置于西寧實(shí)驗(yàn)室(海拔2 260 m)飼養(yǎng)8 d。
16只SD大鼠購(gòu)買(mǎi)于甘肅省蘭州市[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(甘)2018-0002]，隨機(jī)分為 2組，每組8只。第1組為高海拔組(海拔3 300 m)，將SD大鼠置于宗家溝地區(qū)(海拔3 300 m)飼養(yǎng)8 d；第2組為低海拔組(海拔2 260 m)，將SD大鼠置于西寧實(shí)驗(yàn)室(海拔2 260 m)飼養(yǎng)8 d。
所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均用5%戊巴比妥鈉麻醉，采集肝臟組織樣品立即置于液氮中保存，采樣過(guò)程中所涉及處理動(dòng)物的措施均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例(GB14923-2010)》執(zhí)行。
1.2 細(xì)胞周期基因序列分析
1.2.1 序列獲取從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載以色列鼴鼠、大鼠、小鼠Musmusculus、橙腹草原田鼠Microtusochrogaster、金倉(cāng)鼠Mesocricetusauratus、黑線倉(cāng)鼠Cricetulusgriseus、突尼斯非洲跳鼠Jaculusjaculus、裸鼴鼠、達(dá)馬拉鼴鼠Fukomysdamarensis、豚鼠Caviaporcellus、毛絲鼠Chinchillalanigera、智利八齒鼠Octodondegus、多紋黃鼠Ictidomystridecemlineatus、北美鼠兔Ochotonaprinceps、野兔Oryctolaguscuniculus、家牛Bostaurus、牦牛Bosgrunniens、綿羊Ovisaries、山羊Caprahircus、人Homosapiens和黑猩猩Pantroglodytes的細(xì)胞周期相關(guān)基因p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1的堿基及氨基酸序列。高原鼢鼠和高原鼠兔Ochotonacurzoniae細(xì)胞周期相關(guān)基因的堿基序列利用Blast程序?qū)?shí)驗(yàn)室前期已測(cè)得的三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中全長(zhǎng)非嵌合序列文件以及二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的Trinity文件，構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫(kù)，分別用以色列鼴鼠和北美鼠兔上述周期相關(guān)基因的編碼區(qū)序列作為query文件進(jìn)行Blast比對(duì)篩選，使用DNASTAR中的Lastergene程序(Burland，2000)拼接篩選出的基因片段，最終獲得完整的編碼區(qū)堿基序列，使用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)將所有比對(duì)以及拼接篩選出的序列進(jìn)行比對(duì)，挑選與以色列鼴鼠和北美鼠兔同源性最高的一段序列作為目標(biāo)基因的編碼區(qū)序列，利用基因探索者軟件將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列。
1.2.2 同源性分析選擇與高原鼢鼠親緣關(guān)系較近的2種地下鼠(以色列鼴鼠和裸鼴鼠)、大鼠、小鼠和人的p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1基因編碼區(qū)序列和氨基酸序列，用DNAMAN 9.0和MEGA 7.0進(jìn)行同源性分析。
1.2.3 物種樹(shù)構(gòu)建方法從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載1.2.1中包括高原鼢鼠和高原鼠兔在內(nèi)的22個(gè)物種(嚙齒目Rodentia 14個(gè)物種、兔形目Lagomorpha 3個(gè)物種、鯨偶蹄目Cetartiodactyla 3個(gè)物種和靈長(zhǎng)目Primates 2個(gè)物種)的線粒體DNA全基因組序列，利用貝葉斯算法的MrBayes 3.2(Huelsenbeck & Ronquist 2001；Ronquist & Huelsenbeck，2003)構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用PAUP 4.0(Swofford，2002)和Modeltest 2.3(Darribaetal.，2012)篩選最優(yōu)模型，以赤池信息量準(zhǔn)則(Alaike information criterion，AIC)(Bozdogan，1987；Brooks，1989)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行最優(yōu)模型的篩選與確定，采用馬爾科夫鏈蒙特卡羅(Markov chain Monte Carlo，MCMC)運(yùn)算(Gamerman & Lopes，2006)，以隨機(jī)樹(shù)為起始，當(dāng)運(yùn)行2條和4條(1條冷鏈和3條熱鏈)MCMC時(shí)，分歧頻率的標(biāo)準(zhǔn)差穩(wěn)定到小于0.01為止。在貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的過(guò)程中，共進(jìn)行106代的MCMC運(yùn)算，設(shè)置每100代間隔進(jìn)行一次抽樣，舍棄起始老化樣本數(shù)(burn-in)占總數(shù)的25%(Wangetal.，2016)。利用TreeGraph 2.7.1作圖(St?ver & Müller，2010)。
1.2.4 選擇壓力分析分別將22個(gè)物種的p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1基因編碼區(qū)序列用ClustalX 1.81進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)后的結(jié)果利用MEGA 7.0進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，應(yīng)用PAML 4.8中的CODEML程序(Zhangetal.，2005；Yang，2007)，選用該程序中改進(jìn)的基于最大似然法的分支位點(diǎn)模型(“test2”)對(duì)基因序列進(jìn)行正向選擇分析。將高原鼢鼠設(shè)為前景支，其余支系設(shè)為背景支，先用model A檢測(cè)前景支中是否存在顯著的正選擇位點(diǎn)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為貝葉斯經(jīng)驗(yàn)貝葉斯值大于0.95；再將控制文件(codeml.ctl)中的fix omega和omega值都設(shè)定為1，作為Null A進(jìn)行第二次運(yùn)算，提取2次運(yùn)算得到的lnL值，分別記為lnL1和lnL0，計(jì)算其加倍差值2×ΔlnL。最后利用PAML 4.8中的Chi2程序，基于2×ΔlnL值計(jì)算模型的后驗(yàn)概率P值(df=1)，當(dāng)P<0.05時(shí)，可認(rèn)為此模型得到的結(jié)果較可靠。
1.2.5 趨同進(jìn)化分析選用1.2.1中的22個(gè)物種，對(duì)p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1基因的氨基酸序列進(jìn)行地下鼠趨同進(jìn)化分析。利用DNAMAN 9.0進(jìn)行序列比對(duì)，使用PAML 4.8中的CODEML程序(Yang，2007)對(duì)每組蛋白序列進(jìn)行了祖先序列重建。用重建后祖先位點(diǎn)的后驗(yàn)概率評(píng)估重建結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于祖先位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)干擾后續(xù)分析，因此舍棄后驗(yàn)概率小于0.9的位點(diǎn)。應(yīng)用converg 2(Zhang & Kumar，1997)檢驗(yàn)趨同進(jìn)化位點(diǎn)的顯著性；應(yīng)用MEGA 7.0中的ClustalW模式對(duì)22個(gè)物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，去掉所有空格，并按指定格式做出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，然后輸入樹(shù)文件和序列文件并應(yīng)用Jones-Taylor-Thornton 距離矩陣模型和泊松校正模型分別計(jì)算，參數(shù)使用默認(rèn)值，舍棄P>0.05的結(jié)果(Zhang & Kumar，1997)。
1.2.6 變異位點(diǎn)對(duì)基因功能影響的評(píng)估由于SIFT數(shù)據(jù)中與高原鼢鼠親緣關(guān)系最接近的物種為小鼠，因此從NCBI和Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到小鼠p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1的蛋白ID，以該氨基酸序列作為query序列，采用“Sorting Tolerant From Intolerant(SIFT)”的algorithm程序評(píng)估氨基酸變異位點(diǎn)對(duì)該基因功能的影響，其中參數(shù)的設(shè)置使用默認(rèn)值(Kumaretal.，2009)。
1.3 高原鼢鼠細(xì)胞周期基因表達(dá)水平測(cè)定
利用總RNA抽提試劑盒(天根，中國(guó))提取高原鼢鼠和SD大鼠肝臟組織總RNA，核酸蛋白含量檢測(cè)儀測(cè)定A260/A280值(1.8
表1 熒光定量引物序列Table 1 Quantitative PCR primers used in this study
2 結(jié)果
2.1 高原鼢鼠細(xì)胞周期基因同源性比對(duì)結(jié)果
同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，高原鼢鼠細(xì)胞周期相關(guān)基因p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1編碼區(qū)及氨基酸序列與以色列鼴鼠同源性最高，達(dá)到90%以上(表2)。
表2 高原鼢鼠與其他物種細(xì)胞周期基因、氨基酸序列同源性比較Table 2 Gene， amino acid sequence homologies of cell cycle-related genes between Myospalax baileyi and other species
2.2 物種樹(shù)的構(gòu)建
根據(jù)選取的22個(gè)物種的線粒體DNA全基因組序列構(gòu)建物種進(jìn)化樹(shù)。DAMBE飽和度檢測(cè)結(jié)果顯示，指標(biāo)分?jǐn)?shù)(index score，ISS)低于臨界分?jǐn)?shù)(critical score，TSS.C)(ISS=0.685，TSS.C=0.830，P<0.01)，說(shuō)明核酸替換未達(dá)到飽和，適合建樹(shù)。最佳DNA進(jìn)化替代模型采用with gamma-distributed rate variation across sites和a proportion of invariable sites的GTR模型。所得的貝葉斯樹(shù)各支的支持率都大于85%(圖1)，可以用于后續(xù)研究。
圖1 22種哺乳動(dòng)物的mtDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of 22 mammal species based on mtDNA
2.3 高原鼢鼠細(xì)胞周期相關(guān)因子選擇壓力分析
基于圖1構(gòu)建的22個(gè)物種進(jìn)化樹(shù)，檢測(cè)高原鼢鼠細(xì)胞周期相關(guān)因子p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1是否具有正向選擇位點(diǎn)。結(jié)果表明，CDK2有2個(gè)潛在的正向選擇位點(diǎn)，分別為第330號(hào)位點(diǎn)的蘇氨酸(Thr)和第341號(hào)位點(diǎn)的異亮氨酸(Ile)；B99有2個(gè)潛在的正向選擇位點(diǎn)，為第168號(hào)位點(diǎn)的谷氨酰胺(Gln)和第447號(hào)位點(diǎn)的絲氨酸(Ser)；Gadd45α有2個(gè)潛在的正向選擇位點(diǎn)，分別為第8號(hào)位點(diǎn)的絲氨酸(Ser)和第14號(hào)位點(diǎn)的賴氨酸(Lys)；CyclinB1有1個(gè)潛在的正向選擇位點(diǎn)，為第396號(hào)位點(diǎn)的精氨酸(Arg)，但是似然比檢驗(yàn)法顯示這些位點(diǎn)差異不顯著(2ΔlnL=0，P>0.05)(表3)。
表3 高原鼢鼠細(xì)胞周期基因選擇壓力似然比檢驗(yàn)Table 3 Likelihood ratio test of branch-site models for cell cycle-related genes in Myospalax baileyi
2.4 細(xì)胞周期相關(guān)因子趨同進(jìn)化分析
22個(gè)物種細(xì)胞周期相關(guān)因子p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1(由于NCBI中無(wú)牦牛p21和CyclinB1基因序列，分別選用家牛對(duì)應(yīng)序列：NP_001092428.1、NP_001039337.1)在地下鼠中的趨同進(jìn)化分析顯示，高原鼢鼠和以色列鼴鼠p21在第27號(hào)位點(diǎn)由谷氨酸(Glu，E)變異為丙氨酸(Ala，A)(圖2：A)；CyclinD1第20、24、143和266號(hào)位點(diǎn)分別由蘇氨酸(Thr，T)、天冬酰胺(Asn，N)、亮氨酸(Leu，L)和亮氨酸(Leu，L)變異為絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、異亮氨酸(Ile，I)和谷氨酰胺(Gln，Q)(圖2：B)；CyclinE第86、92、125、126和402號(hào)位點(diǎn)分別由亮氨酸(Leu，L)、蘇氨酸(Thr，T)、谷氨酸(Glu，E)、賴氨酸(Lys，K)和賴氨酸(Lys，K)變異為纈氨酸(Val，V)、賴氨酸(Lys，K)、天冬氨酸(Asp，D)、天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酰胺(Gln，Q)(圖2：C)；CyclinB1第105、135和370號(hào)位點(diǎn)分別由纈氨酸(Val，V)、谷氨酸(Glu，E)和絲氨酸(Ser，S)變異為天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)和半胱氨酸(Cys，C)(圖2：D)，而CDK6、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α和B99在高原鼢鼠和以色列鼴鼠中沒(méi)有趨同進(jìn)化位點(diǎn)。
圖2 最大似然法構(gòu)建的p21(A)、CyclinD1(B)、CyclinE(C)和CyclinB1(D)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和進(jìn)化位點(diǎn)Fig. 2 Maximum-likelihood tree of the p21(A)， CyclinD1(B)， CyclinE(C) and CyclinB1(D) gene sequences and the convergent sites
系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)后的序列分別表示氨基酸和對(duì)應(yīng)的堿基序列， 加粗及下劃線的氨基酸表示高原鼢鼠和以色列鼴鼠共有的趨同進(jìn)化位點(diǎn)
Amino acids and codons of convergent sites are shown in the right part of each panel， and amino acids inMyospalaxbaileyiandNannospalaxgaliliare highlighted in bold and underline
2.5 高原鼢鼠細(xì)胞周期相關(guān)因子變異位點(diǎn)對(duì)其功能影響的評(píng)估
SIFT評(píng)估結(jié)果表明，高原鼢鼠與以色列鼴鼠細(xì)胞周期相關(guān)因子的趨同進(jìn)化位點(diǎn)中，只有p21第27號(hào)位點(diǎn)丙氨酸(Ala，A)和CyclinB1第105號(hào)位點(diǎn)天冬酰胺(Asn，N)的變異對(duì)其功能有顯著影響，其余變異位點(diǎn)對(duì)基因功能均沒(méi)有影響(表4)。
表4 高原鼢鼠細(xì)胞周期基因氨基酸序列中 突變位點(diǎn)對(duì)其功能的影響Table 4 The effects of mutation sites on the function of cell cycle-related genes in Myospalax baileyi
2.6 高原鼢鼠和SD大鼠細(xì)胞周期基因mRNA表達(dá)水平
熒光定量PCR結(jié)果表明，與低海拔條件(2 260 m)相比，在高海拔條件(3 300 m)下，高原鼢鼠肝臟組織中細(xì)胞周期基因p21的表達(dá)水平極顯著高于低海拔(2 260 m)下的表達(dá)水平(P<0.01)，p21下游基因CyclinD1、CDK6、CyclinE和CDK2的表達(dá)水平顯著低于低海拔(2 260 m)下的表達(dá)水平(P<0.05)，而在SD大鼠肝臟組織中上述基因的表達(dá)水平差異都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高原鼢鼠和SD大鼠肝臟組織中細(xì)胞周期基因14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1表達(dá)水平間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。在不同海拔條件下，高原鼢鼠肝臟組織中細(xì)胞周期相關(guān)基因p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1的表達(dá)水平均極顯著高于SD大鼠(P<0.01)(圖3)。
3 討論
G1期是細(xì)胞周期的第一階段，在這時(shí)期細(xì)胞開(kāi)始合成生長(zhǎng)所需的RNA、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等，同時(shí)細(xì)胞體積顯著增大，屬于細(xì)胞的生長(zhǎng)期(翟中和等，2000)。研究表明，低氧誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p16、p21、p27高表達(dá)，CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等低表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞周期G1期阻滯(Krtolicaetal.，1998；Gardneretal.，2001；Godaetal.，2003；Cazzalinietal.，2010；Hubbietal.，2013)。細(xì)胞周期G1期阻滯是機(jī)體應(yīng)對(duì)外界刺激的一種保護(hù)反應(yīng)，可以提供充足的時(shí)間修復(fù)受損的DNA，從而避免突變基因遺傳給子代細(xì)胞，避免腫瘤的發(fā)生(Kastanetal.，1991；Cazzalinietal.，2010)。研究表明，p21基因的高表達(dá)是引起細(xì)胞周期G1期阻滯的直接原因(Cazzalinietal.，2010)。p21作為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，在其N(xiāo)端第21～26位及第49～72位的氨基酸分別與細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶結(jié)合，抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，進(jìn)而引起視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白不能發(fā)生磷酸化，阻止轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放，使得參與細(xì)胞周期的CyclinD1、CyclinE等不能表達(dá)，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯(Sherr & Roberts，1995，1999；Gartel & Radhakrishnan，2005)。本研究結(jié)果表明，在高原鼢鼠肝臟組織中，與G1期調(diào)控相關(guān)的基因p21表達(dá)水平隨海拔的升高顯著升高，p21下游基因CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2的表達(dá)水平隨海拔的升高顯著降低，而在SD大鼠中沒(méi)有差異；在高原鼢鼠和SD大鼠肝臟組織中，與G2期調(diào)控相關(guān)的基因Gadd45α、B99、14-3-3-δ和CyclinB1的表達(dá)水平隨海拔改變不發(fā)生變化。因此，高原鼢鼠通過(guò)長(zhǎng)期的低氧適應(yīng)，在高海拔條件下，p21基因的高表達(dá)抑制了下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯，提供了充足的時(shí)間修復(fù)受損的DNA，保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。
圖3 高原鼢鼠和SD大鼠肝臟組織中細(xì)胞周期基因在不同海拔條件下的mRNA表達(dá)水平
Fig. 3 Quantification of the mRNA levels of cell cycle-related genes in the liver ofMyospalaxbaileyiandRattusnorvegicusunder different altitudes
*P<0.05，**P<0.01， ns.P>0.05
細(xì)胞周期調(diào)控不僅與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)水平有關(guān)，而且與其結(jié)構(gòu)的突變有關(guān)。p21是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，主要有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，N端第21～26位及第49～72位的氨基酸分別與Cyclin和CDK結(jié)合，抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性；C端第124～164位氨基酸與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)結(jié)合，使得PCNA不能與DNA聚合酶δ結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制(Luoetal.，1995；Johnson & Walker，1999)。研究發(fā)現(xiàn)，p21第31號(hào)位點(diǎn)由極性不帶電的絲氨酸(Ser)變異為極性帶正電的精氨酸(Arg)，這會(huì)使得p21蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，該位點(diǎn)的變異與乳腺癌、宮頸癌等的易感性有關(guān)(Lukasetal.，1997)。在人類乳腺癌中，p21第94號(hào)位點(diǎn)由極性帶正電的精氨酸(Arg)變異為非極性的色氨酸(Trp)，該位點(diǎn)的變異使得p21抑制CDK的能力減弱，但是與PCNA結(jié)合的能力沒(méi)有發(fā)生改變(Balbínetal.，1996)。本研究的SIFT評(píng)估結(jié)果表明，高原鼢鼠p21第27號(hào)位點(diǎn)的變異對(duì)其功能有顯著影響，該位點(diǎn)由極性帶負(fù)電的谷氨酸(Glu)變異為非極性的丙氨酸(Ala)，位于Cyclin結(jié)合域附近，其改變了該區(qū)域原本帶負(fù)電的局部環(huán)境，可能引起p21對(duì)Cyclin和CDK的結(jié)合力增強(qiáng)，從而使得p21阻滯細(xì)胞周期的功能增強(qiáng)。
CyclinB1屬于細(xì)胞周期蛋白，在其第201～288位有一個(gè)高度保守的細(xì)胞周期蛋白盒序列，該結(jié)構(gòu)域與CDK1氨基末端的PSTAIR結(jié)構(gòu)形成CyclinB1-CDK1復(fù)合物，該復(fù)合物被稱為有絲分裂促進(jìn)因子；CyclinB1位于第42～50位的氨基酸序列為降解盒結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞周期蛋白的自身降解(Glotzeretal.，1991；Nobleetal.，1997)；此外，CyclinB1還有2個(gè)控制CyclinB1-CDK1復(fù)合物胞質(zhì)-核穿梭的結(jié)構(gòu)域，分別是位于第155～170位的核定位區(qū)域(nuclear localization signal，NLS)和N端第78～127位的胞質(zhì)滯留結(jié)構(gòu)域(cytoplasmic retention signal，CRS)，NLS結(jié)構(gòu)域的作用是將CyclinB1-CDK1復(fù)合物運(yùn)送至細(xì)胞核內(nèi)，CRS結(jié)構(gòu)域是確保有絲分裂前CyclinB1-CDK1復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中的定位(Robbinsetal.，1991；Pines & Hunter，1994)。研究表明，位于CRS結(jié)構(gòu)域中絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?Ala)時(shí)，CyclinB1活性消失，而當(dāng)突變?yōu)楣劝彼?Glu)時(shí)，可以增強(qiáng)其活性(Lietal.，1997)。SIFT評(píng)估結(jié)果表明，高原鼢鼠CyclinB1位于CRS結(jié)構(gòu)域中的第105號(hào)位點(diǎn)的變異對(duì)其功能有顯著影響，該位點(diǎn)由非極性的纈氨酸(Val)變異為極性的天冬酰胺(Asn)，這種變異可能會(huì)導(dǎo)致該點(diǎn)附近的靜電勢(shì)能發(fā)生變化，影響CyclinB1-CDK1復(fù)合物從細(xì)胞核運(yùn)往細(xì)胞質(zhì)，從而增強(qiáng)細(xì)胞周期阻滯作用。
綜上所述，高原鼢鼠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的低氧適應(yīng)，通過(guò)上調(diào)p21基因的表達(dá)抑制下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯，從而提供充足的時(shí)間修復(fù)受損的DNA，保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性；同時(shí)高原鼢鼠肝臟組織中細(xì)胞周期的調(diào)控不僅與細(xì)胞周期基因的表達(dá)水平有關(guān)，而且可能與細(xì)胞周期因子p21的第27號(hào)位點(diǎn)和CyclinB1的第105號(hào)位點(diǎn)的變異有關(guān)。
