過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢殺菌效果評估

彌成龍，郭 亮，鄭明學(xué)，白 瑞，史晨婕，張 黎，鄭龍龍，郝飛飛，馮玉萍，康慧鑫，張雪松

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

蠟樣桿菌是與炭疽桿菌密切相關(guān)的細(xì)菌，對人和動(dòng)物具有致病性[6]。芽孢是某些細(xì)菌在一定條件下，胞質(zhì)脫水在菌體內(nèi)形成具有多層膜包囊的圓形或卵圓形小體，是細(xì)菌避開不良環(huán)境、維持細(xì)菌生存處于代謝相對靜止的休眠體。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）屬芽孢桿菌屬（Bacillus），為需氧芽孢桿菌，俗稱蠟樣桿菌，廣泛分布于自然界，易污染食品[7]。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室復(fù)方消毒劑試驗(yàn)組研制的過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑（專利申請?zhí)柎a：CN200910263970.X）可對多種細(xì)菌繁殖體、枯草桿菌芽胞、真菌、NDV和IBDV等具有良好的殺滅效果[8-10]，且具有作用迅速、長效、抗干擾能力強(qiáng)且低成本和作用效率高等特點(diǎn)。但復(fù)方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢的殺滅效果如何，以及與復(fù)方消毒劑中含量相同的過氧乙酸、戊二醛和過氧化氫分別對蠟樣桿菌芽孢的殺滅效果如何，目前還不清楚。

本試驗(yàn)通過復(fù)方消毒劑及其與過氧乙酸、戊二醛和過氧化氫對蠟樣桿菌芽孢的殺滅效果比較，旨在為該復(fù)方消毒劑的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 蠟樣桿菌8008為國家消毒試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株，購自中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 30%過氧乙酸（廣東省西隴科技有限公司）；15%過氧化氫（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；50%戊二醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室提供。普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司）；普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（上海賓穗生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢定性滅菌試驗(yàn)

于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行定性滅菌試驗(yàn)。具體方法為：試驗(yàn)前將蠟樣桿菌芽孢制備成懸液并活菌計(jì)數(shù)，用含1%蛋白胨的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液將菌液稀釋成為5×105～5×106cfu/mL。將復(fù)方消毒劑、與復(fù)方消毒劑中相同含量的過氧乙酸、過氧化氫、戊二醛和0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液分別以滅菌蒸餾水連續(xù)倍比稀釋10次，并分別取2.5 mL細(xì)菌懸液，混勻后立即計(jì)時(shí)，分別作用 5、10、15、30、60min后，各取0.5mL菌藥混合液加入到4.5mL相應(yīng)的中和劑中，中和10 min后，立即取0.5 mL菌藥中和劑混合液加入至4.5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，取同批試驗(yàn)未使用完的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照組，將上述0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液試驗(yàn)組作為陽性對照。

37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至第7 d，觀察試管中的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基是否渾濁。若不渾濁，則說明消毒劑可以殺滅細(xì)菌芽孢；若渾濁，則說明不能殺滅細(xì)菌芽孢。定性滅菌試驗(yàn)共重復(fù)3次，以無菌生長的最大稀釋倍數(shù)作為該消毒劑的最低有效殺菌濃度，最短作用時(shí)間為該濃度殺菌最快有效時(shí)間。

1.2.2 復(fù)方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢定量殺滅試驗(yàn)

a)如果Label[j]>0且medarray[Label(j)]<1，則表示該標(biāo)號的塊連通域首次被掃描到，則Label_index=Label_index+1；medarray[Label(j)]=Label_index；Label[j]=Label_index。

試驗(yàn)前用1%蛋白胨的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液將蠟樣桿菌芽孢懸液稀釋成5×106～5×107cfu/mL。取5個(gè)試管分別加入0.5 mL細(xì)菌懸液、0.5 mL濃度為0.03 g/mL的牛血清白蛋白、4.0 mL相應(yīng)濃度的復(fù)方消毒劑（依據(jù)定性滅菌試驗(yàn)確定的最低有效殺菌濃度），并設(shè)置一個(gè)4.0 mL的無菌蒸餾水作為陽性對照組，混勻后將5個(gè)試管同時(shí)放置在25℃水浴中，作用到定性滅菌試驗(yàn)中確定的最快殺菌有效時(shí)間時(shí)，取菌藥混合液0.5 mL加入到4.5 mL相應(yīng)中和劑中，中和作用10 min后取1.0 mL菌藥中和劑混合液到無菌培養(yǎng)皿中做細(xì)菌傾注培養(yǎng)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后活菌計(jì)數(shù)并計(jì)算殺菌率和殺滅對數(shù)值。

根據(jù)下列公式，計(jì)算殺菌率和殺滅對數(shù)值，陽性對照組所得結(jié)果代表菌液原濃度，以其作為計(jì)算殺菌率和殺滅對數(shù)值的初始值。殺菌率≥99.9%時(shí)，達(dá)到消毒效能，殺菌率為100%時(shí)，達(dá)到殺菌效能；殺滅對數(shù)值均≥5.00時(shí)，為消毒合格[11-12]。

式中，n0和nt分別為陽性對照組平均活菌數(shù)和試驗(yàn)組平均活菌數(shù)；N0和Nx分別為對照組平均活菌濃度的對數(shù)值和試驗(yàn)組活菌濃度對數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑定性殺滅蠟樣桿菌芽孢試驗(yàn)

復(fù)方消毒劑、過氧乙酸、過氧化氫對蠟樣桿菌芽孢的最低有效殺菌濃度分別為3.125%、0.125%、0.600%，該濃度下的最快有效殺菌時(shí)間依次為5、5、15 min。復(fù)方消毒劑所含戊二醛對蠟樣桿菌芽孢不能完全殺滅。

2.2 消毒劑定量殺滅蠟樣桿菌芽孢試驗(yàn)

復(fù)方消毒劑最低有效殺菌濃度（3.125%）作用5 min可有效殺滅蠟樣桿菌芽孢，殺滅對數(shù)值≥5。復(fù)方消毒劑含量相同的單一成分的過氧乙酸、過氧化氫分別作用5、15 min可有效殺滅蠟樣桿菌芽孢，殺滅對數(shù)值均≥5，但戊二醛（0.06%）在60 min內(nèi)則無法完全殺滅蠟樣桿菌芽孢，其殺滅對數(shù)值為4.08（表 1、2）。

表1 復(fù)方消毒劑定量殺滅蠟樣桿菌芽孢的殺滅率 %

表2 復(fù)方消毒劑定量殺滅蠟樣桿菌芽孢的殺滅對數(shù)值

3 結(jié)論與討論

飼養(yǎng)健康動(dòng)物、提供安全健康的動(dòng)物產(chǎn)品和獲取最佳的經(jīng)濟(jì)效益是現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的三大任務(wù)，而建立有效的消毒防疫體系至關(guān)重要，一個(gè)符合當(dāng)?shù)貙?shí)際的消毒方案，是現(xiàn)代養(yǎng)殖企業(yè)控制疾病、獲取最佳效益的重要措施。

復(fù)方消毒劑對蠟樣桿菌芽孢具有良好的殺滅作用，3.125%（32倍稀釋）作用5 min就可殺滅100%的蠟樣桿菌芽孢，與該復(fù)方消毒劑含量相同的單一成分除戊二醛外，過氧乙酸（0.125%）作用5 min和過氧化氫（0.6%）作用15 min可有效殺滅蠟樣桿菌芽孢。

過氧乙酸和過氧化氫作為強(qiáng)氧化劑，戊二醛作為蛋白質(zhì)凝固劑，3種消毒劑不但可以高效殺毒滅菌而且互相存在協(xié)同作用[11]；且氧化類消毒劑作用強(qiáng)，殺毒滅菌迅速，同時(shí)過氧化氫與過氧乙酸分解產(chǎn)物乙酸再次生成過氧乙酸，增加其殺菌效果[2]。

呂鳳霞等[13]研究表明，1.08%的H2O2作用蠟樣桿菌芽孢60 min，殺滅對數(shù)值≥5.00；莫金觀等[14]研究表明，1.0%和1.5%的H2O2分別作用蠟樣芽孢桿菌1.5 min，殺滅對數(shù)值分別為2.12和2.86，用1.5%和2.0%的CH3COOOH分別作用蠟樣芽孢桿菌1.5 min，殺滅對數(shù)值分別為3.10和≥5.00；李月丹等[15]研究表明，2%的戊二醛對蠟樣桿菌芽孢沒有殺滅效果。本試驗(yàn)得出的結(jié)果與之相似。在本試驗(yàn)中，0.6%的H2O2和0.125%的CH3COOOH分別作用蠟樣桿菌芽孢5、15min，殺滅對數(shù)值均≥5.00，0.06%的戊二醛作用蠟樣桿菌芽孢60 min，殺滅對數(shù)值為4.08。表明H2O2和CH3COOOH在一定濃度下對蠟樣桿菌芽孢均有一定的殺菌效果。

洪令瑤等[16]研究表明，用0.0025%的CH3COOOH和0.002 5%的H2O2混合配制成的復(fù)方消毒液對蠟樣芽孢桿菌分別作用10、480 min，其殺菌率分別為96.71%、97.08%；本研究中3.125%的過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑作用蠟樣桿菌芽孢5min，殺菌率可達(dá)100%。本試驗(yàn)結(jié)果與之相比，消毒效果更好，消毒更徹底，更適合養(yǎng)殖場的實(shí)際生產(chǎn)與實(shí)踐，且復(fù)方消毒劑的消毒效果優(yōu)于單一消毒劑的消毒效果。過氧乙酸戊二醛復(fù)方消毒劑降低了使用劑量，對人畜的毒性、刺激性大大降低，更適合用于生產(chǎn)實(shí)踐。