不同甘薯品種及其輻射誘變后代基因組變異的分子標記評價

劉家榜 ，趙 珊 ，張 聰 ，馮俊彥 ，李 明 ，屈會娟 ，黎 青 ，李建偉 ，林 楊 ，蒲志剛

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川成都610061；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川成都610066）

甘薯（Ipomoea batatasLam.）俗稱紅薯、紅苕、番薯等，屬旋花科（Convolvulaceae）甘薯屬（Ipomoea）蔓生多年生草本植物，是重要的糧食和飼料作物，具有較高的食用價值和經(jīng)濟價值[1-3]。2009年世界甘薯種植面積為677萬hm2，薯干總產(chǎn)量為2 112萬t[4]。甘薯也是我國主要栽培作物之一，常年種植面積在6×106hm2左右，我國甘薯栽培面積和總產(chǎn)量均居世界首位，而四川是我國甘薯種植面積最大的省份之一，每年穩(wěn)定種植面積在47萬hm2以上，鮮薯總產(chǎn)穩(wěn)定在1 000萬t左右[5-7]。

長期以來，我國主要通過選擇優(yōu)質(zhì)甘薯種質(zhì)資源或野生材料作為親本進行雜交，從后代中篩選出具有優(yōu)良性狀的甘薯新品系（種）[8]。但由于甘薯可利用種質(zhì)資源較少、不易開花、種間雜交親和性較低等原因，雜交育種技術(shù)在甘薯育種上的應(yīng)用存在較大局限性[9-10]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)合生物技術(shù)和輻射誘變技術(shù)進行甘薯種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種改良，在甘薯育種中呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景[11]。

經(jīng)過多年發(fā)展，分子標記技術(shù)已經(jīng)在動物、植物、微生物研究中得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了大量的研究成果[12-17]，可以預(yù)見，在今后的研究中分子標記技術(shù)將發(fā)揮越來越重要的作用。但是目前在甘薯育種研究上可以使用的分子標記仍然較少[18]。

本研究利用目標起始密碼子多態(tài)性分子標記技術(shù)（Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT）[19]、重復(fù)序列區(qū)間擴增多態(tài)性標記技術(shù)（Inter-simple Sequence Repeat，ISSR）[20]、CAAT盒多態(tài)性標記技術(shù)（CAATBox-derivedPolymorphism，CBDP）[21]對甘薯品種川薯34和川紫薯2號及其60Co-γ輻射誘變后代進行基因組掃描，比較不同標記對甘薯誘變后代變異的掃描結(jié)果；同時利用標記掃描結(jié)果評價不同甘薯誘變后代的變異情況，旨在為今后分子標記技術(shù)和輻射誘變技術(shù)在甘薯育種中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究從2個四川主栽甘薯品種川薯34和川紫薯2號懸浮細胞輻射誘變后代中[22]分別隨機選取32株作為試驗材料，并使用川薯34和川紫薯2號未誘變材料作為對照。參試材料均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所生物育種中心提供；懸浮細胞輻射處理由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所輻照中心完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘薯基因組DNA提取 參試材料基因組DNA提取參照黃艷嵐等[23]的方法進行，略有改進。稱取0.5～1.0 g新鮮甘薯葉片，加入液氮研磨至粉末，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入0.8 mL預(yù)熱的CTAB，混勻后，65℃水浴45 min，期間上下顛倒4～5次；加入0.8 mL氯仿，上下顛倒混勻，12 000 r/min離心10min；吸取上清液，加入-20℃預(yù)冷的異丙醇1mL，上下顛倒沉淀除DNA后，依次用70%、95%、100%濃度的酒精各洗2遍，晾干后，用1×TE緩沖液（含有20 ng/μLRNA酶）溶解DNA；然后使用Scandrop（Analyticgena）微量核酸測定儀和1%瓊脂糖電泳檢測DNA的濃度和純度。根據(jù)檢測結(jié)果，將DNA原液稀釋到50 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)條件 使用的SCoT引物、ISSR引物、CBDP引物以及PCR反應(yīng)程序及體系均參照已報道的方法[19-21，24]，略有改進（表 1）。PCR 反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體系均為20 μL，分別含有2 μL甘薯基因組 DNA、10 μL 的 2×TaqPCR Mix、3 μL 引物和5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)所需藥品、試劑以及引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 引物信息

SCoT引物PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，45～62℃退火1 min，72℃延伸2 min，38個循環(huán)；最后72℃終延伸5 min，冷卻至12℃保存。ISSR引物PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性 45 s，50～55℃退火 45 s，72℃延伸1min 30 s，35個循環(huán)；72℃最終延伸5 min，冷卻至12℃保存。CBDP引物PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性1min，35 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，5 個循環(huán)；94℃預(yù)變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃最后延伸10 min，15℃保存。

1.2.3 PCR擴增產(chǎn)物檢測 取PCR產(chǎn)物6 μL與5 μL DNA loading buffer混合，用2%的瓊脂糖凝膠在110 V電壓下進行電泳分離檢測，于紫外成像儀上拍照分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

根據(jù)檢測樣品中電泳條帶的有無，采用二進位制記錄，即在相同遷移率處有帶記為1，無帶記為0，記錄所有引物擴增結(jié)果；然后使用NTSYSpc 2.11和Popgen 32軟件對各品種及其誘變后代的遺傳相似系數(shù)進行計算及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射誘變甘薯后代PCR擴增多態(tài)性分析

川紫薯2號和川薯34懸浮細胞經(jīng)過低劑量輻射誘變后，后代植株在葉形、葉色、藤蔓長度、藤蔓顏色、薯塊形狀、薯塊大小等方面均出現(xiàn)不同程度的變異（圖1）。分別隨機選取各品種誘變后代32株，進行分子標記掃描分析，結(jié)果表明，6條SCoT引物在參試材料中的PCR擴增產(chǎn)物主要集中在200～2 000 bp（圖2），在川薯34及其突變后代中共擴增出條帶38條，平均每條引物可產(chǎn)生6.33條條帶，發(fā)現(xiàn)變異條帶4條，變異率為10.5%；在川紫薯2號中共擴增出40條條帶，平均每條引物擴增6.67條條帶，其中發(fā)現(xiàn)變異條帶7條，變異率17.5%（表2）。

表2 3種分子標記掃描結(jié)果統(tǒng)計

2條ISSR引物在川薯34誘變后代材料中，共擴增得到5條條帶，引物815擴增獲得2條條帶，引物873擴增獲得3條條帶；擴增片段主要處于100～2 500 bp；其中，變異條帶1條，變異率20.0%。在川紫薯2號誘變后代中，共擴增獲得6條條帶，引物815、873擴增分別獲得3條條帶（表2），擴增產(chǎn)物主要處于600～2 500 bp，未檢測到變異條帶。

6條CBDP引物在參試材料中獲得的擴增產(chǎn)物片段長度處于100～2 000 bp（圖2）。在32份川薯34誘變后代中檢測到35個擴增片段，平均每條引物獲得5.83條條帶，檢測到變異條帶13條，變異率為37.1%；在川紫薯2號材料中，共獲到36條條帶，其中，變異條帶7條，變異率為19.4%（表2）。

2.2 遺傳多樣性分析

利用Popgen 32軟件對3種分子標記在2個甘薯品種及其輻射誘變后代中的掃描結(jié)果進行分析，結(jié)果表明，在SCoT引物掃描結(jié)果中，川薯34的遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.94～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.99，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.032 0，Shannon's多樣性指數(shù)為0.019 5，平均等位基因效應(yīng)為1.028 3；川紫薯2號的遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.92～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.99，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.037 0，Shannon's多樣性指數(shù)為0.061 1，平均等位基因效應(yīng)為1.051 1。

在ISSR引物掃描結(jié)果中，川薯34的遺傳相似性系數(shù)范圍在0.80～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.97，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.0742，Shannon's多樣性指數(shù)為0.1116，平均等位基因效應(yīng)為1.1180。由于在川紫薯2號誘變后代中未發(fā)現(xiàn)變異條帶，其遺傳相似性系數(shù)、平均Nei's基因多樣性指數(shù)、Shannon's多樣性指數(shù)、平均等位基因效應(yīng)均未進行分析。

在CBDP引物掃描結(jié)果中，川薯34的遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.80～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.95，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.099 2，Shannon's多樣性指數(shù)為0.158 9，平均等位基因效應(yīng)為1.147 9；川紫薯2號的遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.86～1.00，平均遺傳相似性系數(shù)為0.98，平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.048 2，Shannon's多樣性指數(shù)為0.078 5，平均等位基因效應(yīng)為1.067 0。

2.3 分子標記掃描結(jié)果的聚類分析

使用NTSYSpc 2.11軟件中的UPGMA聚類方法，將SCoT引物、ISSR引物以及CBDP引物的掃描結(jié)果進行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。對川紫薯2號及其誘變后代的分析結(jié)果表明，當遺傳相似度為0.973時，34份參試材料被分別聚到4個類群中，其中，類群Ⅰ包含31份材料，剩余3個類群中分別包含1個材料。當遺傳相似度為0.986時，31份材料又可劃分為8個亞群，亞群Ⅰ包含24份材料，結(jié)果顯示，這些誘變材料基本未發(fā)生變異；另外7個亞群分別包含1份材料，遺傳相似性差異較大，差異明顯。原始品種川紫薯2號與23份誘變后代被聚到類群Ⅰ中，另外8份材料被單獨區(qū)分開，表明在甘薯品種川紫薯2號的懸浮細胞低劑量輻射誘變后代中發(fā)生了一定程度的較小變異，但絕大多數(shù)未發(fā)生變異（圖3）。

對川薯34及其輻射誘變后代3種標記掃描結(jié)果的分析表明，當遺傳相似度為0.97時，34份參試材料被分別聚到5個類群中，其中，類群Ⅰ、類群Ⅲ、類群Ⅳ和類群Ⅴ這4個類群內(nèi)分別僅包含1份材料；類群Ⅱ包含30份材料，類群Ⅱ在相似度為0.98時，30份材料被分別聚到6個亞群中，其中，有13份材料與對照親本的遺傳相似性達到1.00，被完全聚到一起，此外，cs34-14和cs34-23以及cs34-8和cs34-9這2組（4個材料）雖然均發(fā)生了變異，但是它們之間的遺傳相似性系數(shù)分別達到了1.00，也被完全聚到了一起。本研究結(jié)果表明，在川薯34輻射誘變后代中多數(shù)個體都發(fā)生了不同程度的變異，但整體變異程度較低。但是也有部分誘變后代變異不明顯，在分子標記掃描結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)變異位點，在聚類結(jié)果中這些個體與親本被完全聚到了一起（圖4）。從聚類圖4也可以看出，部分誘變后代雖然發(fā)生了變異，但是也被完全聚到了一起，說明在甘薯基因組中可能存在易變位點。

3 結(jié)論與討論

隨著近年來生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標記技術(shù)已在生物分子育種、植物遺傳指紋圖譜構(gòu)建、文庫構(gòu)建以及生物遺傳多樣性分析等多個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了顯著的成效[25-27]。目前，分子標記技術(shù)根據(jù)技術(shù)和方法的不同，其檢測技術(shù)和檢測分辨率差異很大，可以分為三大類：以分子雜交為核心的標記技術(shù)，如RFLP技術(shù)；以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的標記技術(shù)，如RAPD、AFLP、SSR等分子標記技術(shù)[28-29]；基于測序技術(shù)的新型標記技術(shù)，如SNP等標記[30]。南文卓等[31]利用SSR分子標記技術(shù)對30份甘薯種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，11對SSR引物可擴增出57條清晰的條帶，其中，多態(tài)性條帶53條，多態(tài)性比率93.0%，平均每對引物5.18條。趙麗麗等[32]利用ISSR分子標記技術(shù)分析了輻射誘變白刺花M2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20條多態(tài)性較好的ISSR引物擴增產(chǎn)生141條清晰譜帶，多態(tài)性條帶有75條，多態(tài)性比率為53.2%，表明在輻射誘變材料的后代中存在豐富的遺傳多樣性，為分子標記與輻射誘變技術(shù)在育種中的應(yīng)用提供了參考。翟秀明等[33]和謝向譽等[34]運用SCoT分子標記技術(shù)分別對茶樹和木薯的生長和突變體進行了分析，證明了SCoT分子標記技術(shù)可用于掃描分析植物突變體。

本研究使用SCoT、ISSR和CBDP分子標記技術(shù)，對2個甘薯品種及其輻射誘變后代進行了掃描分析，結(jié)果表明，SCoT、ISSR和CBDP等3種標記每條引物平均獲得條帶數(shù)最多的是CBDP引物，其次為SCoT引物，ISSR引物獲得的條帶數(shù)最少。SCoT、ISSR和CBDP等3種標記在突變體中獲得的多態(tài)性片段占擴增總片段數(shù)的比例中，在川薯34及其誘變后代中分別為0.11、0.20和0.37；在川紫薯2號及其誘變后代中分別為0.18、0和0.19。說明無論在擴增條帶數(shù)目上還是在獲得的突變體后代的多態(tài)性上，目前在甘薯分子研究中使用較少的SCoT分子標記和CBDP分子標記的表現(xiàn)均優(yōu)于ISSR分子標記，且CBDP分子標記結(jié)果最佳。此外，由于SCoT分子標記和CBDP分子標記均屬于單引物標記，操作簡單，因此，可以將其應(yīng)用到甘薯分子標記研究中去，豐富甘薯分子標記種類。

本研究通過對2個甘薯品種及其輻射誘變后代的分子標記掃描及聚類分析發(fā)現(xiàn)，原始材料及輻射誘變后代之間的遺傳相似性較高，而且存在多個與原始材料基本相同的突變后代，其原因可能與本研究的誘變材料是通過低劑量輻射誘變懸浮細胞獲得的[33]，其基因組變異較小有關(guān)。通過對比川薯34及其誘變后代以及川紫薯2號及其誘變后代的聚類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2個品種的誘變后代在基因組變異方面存在較為明顯的區(qū)別，川薯34誘變后代的變異率及變異幅度均顯著高于川紫薯2號，初步說明懸浮細胞對低劑量輻射誘變產(chǎn)生的變異大小與品種存在一定的關(guān)系。在川薯34輻射誘變后代中，有2組分別包含2個誘變材料被完全聚到了一起，可能與川薯34中存在容易發(fā)生誘變的位點有關(guān)。在今后的研究中，可以根據(jù)不同的甘薯品種選擇最優(yōu)的輻射劑量進行誘變。